治療缺血性腦病的藥物及其製備方法

2023-04-25 02:55:11

專利名稱：治療缺血性腦病的藥物及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種治療缺血性腦病的藥物，特別涉及一種治療缺血性腦病的純中藥製劑，以及上述藥物的製備方法。
背景技術：
缺血性腦血管疾病以發病率、死亡率、致殘率和復發率高為特點極大的危害著人類的健康，為人類三大死亡原因之一。其中缺血性腦血管疾病佔腦血管病的56.6％～80％，同時，中風也是人類致殘的主要原因之一，我國是世界上中風發生率與死亡率較高的國家，每年約有300萬人發生中風，是西方國家的1.5倍，祖國醫學自《內經》時期就對中風有了較為系統的認識，經歷代醫家的不斷完善，形成了完整的病因病機、預防、診斷和治療的理論體系，認為中風是以氣血虧虛與心、肝、腎三髒陰陽失調，而致虛(陰虛、氣虛)、火(肝火、心火)、風(肝風)、痰(風痰，溼痰)、氣(氣逆)、血(血瘀)六端為病機。
現在，一般採用西藥進行治療，但不能從根本上進行治療。中藥治療缺血性腦病的藥物較少，而且，療效也不顯著。

發明內容本發明的目的在於提供了一種藥物純度高、療效顯著、藥物從根本上治療缺血性腦病的純中藥製劑。
本發明另一目的在於提供一種提取率高、藥物損失少、工藝簡單的上述藥物的製備方法。
本發明涉及一種治療缺血性腦病的藥物，是由以下重量配比的原料和藥用輔料製成，羌活6-12g，川芎6-12g，三七6-12g，葛根提取物0.2-0.8g，山楂葉提取物0.2-0.8g，銀杏葉提取物0.2-0.8g。
本發明的藥物，所述原料的最佳重量配比為，羌活8-10g，川芎8-10g，三七8-10g，葛根提取物0.4-0.6g，山楂葉提取物0.4-0.6g，銀杏葉提取物0.4-0.6g。
本發明的藥物，優選為片劑。
上述本發明藥物，優選採用以下步驟的製備方法，(1)羌活、川芎飲片超臨界CO2流體提取揮髮油，揮髮油用β-環糊精包結，得β-環糊精包結物，藥渣備用；(2)羌活、川芎藥渣加10倍量60％乙醇，回流提取2次，每次2小時，提取液合併，減壓回收乙醇，並繼續濃縮至在80℃下相對密度為1.30～1.31的稠膏，60℃減壓乾燥成羌活、川芎幹膏；(3)三七粉碎成粗粉，加10倍量60％乙醇，回流提取3次，每次2小時，提取液合併，減壓回收乙醇，並繼續濃縮至在80℃下相對密度為1.30～1.31的稠膏，60℃減壓乾燥成三七幹膏；
(4)川芎、羌活幹膏和三七幹膏合併，粉碎成細粉，加入葛根提取物、山楂葉提取物、銀杏葉提取物和β-環糊精包結物，再加入適量輔料，混勻，加20％聚維酮乙醇溶液適量，16目篩溼法制粒，60℃烘乾，整粒，加入適量崩解劑，壓製成片劑。
三七為五加科植物三七Panax notoginseng(Burk)F.H.Chen的乾燥根，皂苷類是其主要生理活性成分。文獻報導三七總皂苷含量約為12％。三七的薄層指紋圖譜中，較明顯的斑點為人參皂苷Rg1、Re、Rb1及三七皂苷R1。
羌活和川芎均含揮髮油成分，羌活揮髮油含量約2.7％，收率約1.4％，為淡黃澄明液體。川芎揮髮油中主要成分為藁本內脂。上述的揮髮油具有活血化瘀的作用。上述羌活和川芎揮髮油可以採用蒸餾法提取，也可以採用超臨界CO2流體提取，優選超臨界CO2流體提取。超臨界CO2流體萃取川芎、羌活提取物為油狀物，比蒸餾法色深，提取物的體積為蒸餾法的6倍，且提取時間僅為蒸餾法的1/4，油中藁本內脂量大。因此，超臨界提取法優於水蒸氣蒸餾法。
提取揮髮油後的川芎、羌活藥渣中，還有其他藥效成分，其中包括川芎中的川芎嗪、阿魏酸，羌活中的呋喃香豆素類成分，一般採用醇提法。
葛根提取物、山楂葉提取物和銀杏葉提取物，分別以稀醇提取，提取液回收乙醇至適量，再經大孔吸附樹脂精製，分別得葛根提取物、山楂葉提取物和銀杏葉提取物。三種提取物中主要成分均為黃酮類成分，是治療心腦血管疾病的有效成分。三者均有各自的質量標準，符合標準規定時方可投料生產。三者的質量標準見「原料藥材和藥品的質量標準」。
本發明的藥物以傳統的中醫藥理論為指導，精心組方而成，現代研究已證實方中組成藥物多具有抗腦缺血，改善腦循環，抗血栓等作用。羌活具有抗血栓，增加腦血流量的作用；三七總皂苷、葛根總黃酮具有擴張腦膜微血管、降低腦血管阻力增加腦組織血供、改善局部微循環、提高腦局部微血流量、保護大鼠腦缺血，抑制血小板聚集，抗血栓、改善腦功能的藥理作用；川芎明顯增加腦血流量，減少腦缺血對腦組織的損傷和過氧化物的升高，改善腦膜微循環，抑制血小板聚集、抗血栓作用；銀杏葉提取物具有增加腦血流量，改善腦細胞代謝，降低腦血管阻力，保護腦組織，降低腦缺血造成的腦組織損傷，穩定腦細胞膜，改善腦功能多方面的生理效應；山楂葉提取物具有降低血脂，保護血管內皮，阻止血栓形成，保護腦缺血小鼠的作用。
本發明的藥物，由純中藥製成，並具有藥物純度高、療效顯著、能從根本上治療缺血性腦病。
本發明的製備方法，具有提取率高、藥物損失少、工藝簡單的優點。
具體實施方式
實施例1稱取以下重量的原料羌活8kg，川芎10kg，三七6kg，葛根提取物0.6kg，山楂葉提取物0.8kg，銀杏葉提取物0.3kg。
上述發明藥物的製備方法，包括以下步驟，羌活、川芎飲片通過水蒸汽提取揮髮油，揮髮油用β-環糊精包結，得β-環糊精包結物，藥渣備用；
三七粉碎成粗粉，與羌活、川芎藥渣合併加10倍量60％乙醇，回流提取2次，每次2小時，提取液合併，減壓回收乙醇，並繼續濃縮至在80℃下相對密度為1.30～1.31的稠膏，60℃減壓乾燥成幹膏；幹膏粉碎成細粉，加入葛根提取物、山楂葉提取物、銀杏葉提取物和β-環糊精包結物，加入適量的糊精，由常規方法，製得1000包顆粒劑，8g/包。用法與用量一天1-2次，一次一包。
實施例2稱取以下重量的原料羌活10kg，川芎10kg，三七8kg，葛根提取物0.5kg，山楂葉提取物0.3kg，銀杏葉提取物0.5kg。
按以下步驟進行製備，羌活、川芎飲片超臨界CO2流體提取揮髮油，揮髮油用β-環糊精包結，得β-環糊精包結物，藥渣備用；羌活、川芎藥渣加10倍量60％乙醇，回流提取2次，每次2小時，提取液合併，減壓回收乙醇，並繼續濃縮至在80℃下相對密度為1.30～1.31的稠膏，60℃減壓乾燥成羌活、川芎幹膏；三七粉碎成粗粉，加10倍量60％乙醇，回流提取3次，每次2小時，提取液合併，減壓回收乙醇，並繼續濃縮至在80℃下相對密度為1.30～1.31的稠膏，60℃減壓乾燥成三七幹膏；川芎、羌活幹膏和三七幹膏合併，粉碎成細粉，加入葛根提取物、山楂葉提取物、銀杏葉提取物和β-環糊精包結物，再加入適量輔料，混勻，加20％聚維酮乙醇溶液適量，16目篩溼法制粒，60℃烘乾，整粒，加入適量崩解劑，壓製成片劑共計8000片，1g/片，口服，每次2片，一日3-4次。
實施例3稱取以下重量的原料羌活12kg，川芎8kg，三七8kg，葛根提取物0.6kg，山楂葉提取物0.6kg，銀杏葉提取物0.4kg。
按以下步驟進行製備，羌活、川芎飲片超臨界CO2流體提取揮髮油，揮髮油用β-環糊精包結，得β-環糊精包結物，藥渣備用；羌活、川芎藥渣加10倍量60％乙醇，回流提取2次，每次2小時，提取液合併，減壓回收乙醇，並繼續濃縮至在80℃下相對密度為1.30～1.31的稠膏，60℃減壓乾燥成羌活、川芎幹膏；三七粉碎成粗粉，加10倍量60％乙醇，回流提取3次，每次2小時，提取液合併，減壓回收乙醇，並繼續濃縮至在80℃下相對密度為1.30～1.31的稠膏，60℃減壓乾燥成三七幹膏；川芎、羌活幹膏和三七幹膏合併，粉碎成細粉，加入葛根提取物、山楂葉提取物、銀杏葉提取物和β-環糊精包結物，與適量的微晶纖維素混勻，加20％聚維酮(POP)乙醇溶液，16目篩制粒，60℃烘乾，整粒後加入羧甲基澱粉鈉和硬脂酸鎂，混勻，壓製成片劑共計8000片，1g/片，口服，每次2片，一日3-4次。
下面以實施例3的片劑(稱為三酮腦通片)進行以下藥效學實驗1.試驗材料1.1試驗藥品本發明的藥物由山東省中醫藥研究院提供，規格1g/片，口服，每次2片，一日3次。
對照藥血塞通片功用活血祛瘀、通脈活絡，抑制血小板聚集和增加腦血流量，用於腦絡瘀阻、中風偏癱、心脈瘀阻、胸痺心痛，腦血管後遺症屬上述症候者。雲南特安吶股份有限公司產品，規格50mg/片，口服，每次1-2片，一日三次，批號200206193742。
其它鹽酸腎上腺素注射液企業名稱天津津耀胺基酸有限公司(原人民製藥廠)批號020405。氨基甲酸乙酯曹州第二中學製藥廠，批號010307。
1.2試驗動物Wistar大鼠，山東大學醫學院實驗動物中心提供。
2.試驗方法與結果2.1對大鼠體內血栓形成時間的影響320-350g Wistar大鼠，60隻，♀♂各半，按體重、性別均衡隨機分為5組，分別為空白對照組1ml/100g·ig，本發明的藥物1.6g/kg、0.8g/kg、0.4g/kg(4倍、2倍、1倍臨床等效量)配成16％、8％、4％的水溶液1ml/100g·ig，陽性對照組為血塞通片54mg/kg(2倍臨床等效量)，配成0.54％的水溶液1ml/100g·ig，每日8Am給藥，連續7天，禁食12h，末次給藥90min後，氨基甲酸乙脂1g/kg(20％溶液，1ml/100g)腹腔麻醉，仰臥位固定大鼠，頸部皮膚碘酊消毒，行縱行約2.5cm切口，分離肌肉組織，暴露頸總動脈，玻璃紙隔離其他組織，近心端放置電刺激電極，遠心端放置溫度傳感器，1.5mA直流電刺激動脈7min，記錄血栓形成時間OT值，t檢驗進行組間統計比較，結果見表1表1本發明的藥物對大鼠體內血栓形成時間的影響 X±SD
注與空白對照組比較「*」P＜0.05，「**」P＜0.01。
試驗結果提示給予Wistar大鼠本發明的藥物對電刺激形成的頸總動脈血拴形成時間與對照組比較，有明顯的統計學意義。說明本發明的藥物對體內血栓形成有明顯的抑制作用，可明顯延長體內血栓形成時間，且與用藥劑量成線性相關。
2.2對大鼠凝血因子的影響大鼠分組、給藥同2.1，于禁食12h，末次給藥90min後，氨基甲酸乙脂1g/kg(20％水溶液，1ml/100g)腹腔麻醉，剖開腹腔，暴露下腔靜脈，下腔靜脈採血2ml，0.109mol/L枸櫞酸鈉抗凝液1∶9體積抗凝(1份抗凝液9份全血)，3000rpm離心10min，收集上層液(血漿)，MC-1000血凝儀測定凝血時間(TT)、凝血酶原時間(PT)、纖維蛋白原含量(FIB)，結果見表2。
表2本發明的藥物對大鼠凝血因子的影響X±SD
注與空白對照組比較「*」P＜0.05，「***」P＜0.001。
試驗結果提示高劑量組TT、PT、FIB，與對照組比較有明顯的統計學意義，中劑量TT、PT有明顯的統計學意義，高、中、低劑量值呈現線性相關，結果說明本品具有明顯的抗凝血作用，明顯延長凝血時間(TT)、凝血酶原時間(PT)，降低纖維蛋白原含量(FIB)。
2.3對大鼠血小板聚集功能、血漿TXB2和6-K-PGFla的影響大鼠分組、給藥情況同2.1，禁食12h，末次給藥90min後，麻醉方式同2.1，剖開腹腔，暴露下腔靜脈，下腔靜脈取血2ml置於防凝管中，進行血小板聚集試驗(誘導劑為300μmol/LAOP，美國Sigarm公司產品)；另取由0.1消炎痛-EDTA(解放軍總醫院東方放免所提供)抗凝，-4℃，3000rpm離心10min，取上清液(血漿)，放射免疫法測定TXB2和6-K-PGFla，結果見表3-4。
表3對大鼠血小板聚集功能的影響X±SD
注與空白對照組比較「*」P＜0.05，「**」P＜0.01。
試驗結果提示與空白對照組相比，給藥組血小板聚集率具有明顯的統計學差異。試驗說明本品能降低血小板聚集率，抑制血小板聚集功能。
表4對大鼠血漿TXB2和6-K-PGF1a含量的影響X±SD
注與空白對照組比較「*」p＜0.05，「**」P＜0.01，「***」P＜0.001。
試驗結果提示給藥組與空白對照組相比，三個劑量組均可顯著降低血漿TXB2含量，具有高度的統計學意義；提高6-Keto-PGF1a血漿含量高、中劑量組具有高度的統計學差異。試驗說明本品對血小板聚集、血栓形成促進因子TXB2有明顯降低作用，對抗血小板、抗血栓形成因子前列腺素6-Keto-PGFla有明顯促進作用，增加其血漿含量。
2.4對大鼠血漿t-pA、PAI活性及Plg含量的影響320-350g，Wistar大鼠60隻，♀♂各半，按性別、體重隨機均衡分為6組，分別為空白對照組，模型對照組，本發明的藥物高、中、低三個劑量組和陽性藥對照組。給藥情況同2.1，給藥第6天，皮下注射鹽酸腎上腺素0.9mg/kg，一小時後0℃冰水浸泡5分鐘，冰浴後一小時再次皮下注射同劑量鹽酸腎上腺素，給藥第7天重複第6天的操作過程，第二次造模後24小時，禁食12h，末次給藥90min後，氨基甲酸乙酯1g/kg(20％水溶液，1ml/100g)腹腔麻醉，剖開腹腔，暴露下腔靜脈，取2ml血液，待凝固後，3000rpm離心10min，免疫濁度法測定Plg含量，取上層液(血清)20μl，加入抗血清1ml，37℃水浴15min後，340nm處以抗血清調零，測定各管A值，然後測定參比管A值，按公式Plg含量(mg/L)＝(測定管A值/參比管A值)×參比管濃度(210mg/L)計算Plg含量；另取2ml血以0.109mol/L枸櫞酸鈉1∶9體積抗凝，-4～8℃，3000rpm，離心10min，分離上清液(血漿)，發色底物法測定t-pA、PAI活性，具體操作過程按說明書進行，測定結果見表5表5 對大鼠組織纖溶酶原活性 X±SD
注與空白對照組比較「*」P＜0.05，「**」P＜0.01，「***」P＜0.001；與模型對照組比較「#」P＜0.05，「##」P＜0.01，「###」P＜0.001。
試驗結果提示與模型對照組相比，給藥組高、中劑量組可以非常明顯的提高t-pA活性，降低PAI活性，與空白對照組比較則無統計學差異，給藥低劑量組和陽性藥對照組與模型對照組相比，具有明顯的統計學意義，同時與空白對照組比較也具有明顯的統計學差異，給藥高劑量組降低Plg含量與模型組合空白對照組比較都有統計學差異。試驗結果說明本品能提高血瘀模型大鼠的t-pA活性，降低PAI活性，且達到正常水平，而降低纖溶酶原含量。
2.5複方三酮腦通片對中動脈結紮大鼠的保護作用2.5.1造模方法參考Kawamura等的方法，選用直徑為0.185mm的尼龍線，經酒精燈處理使頭端變鈍，每段截取長度為25mm，浸泡0.1％的新潔爾滅溶液中消毒待用。
Wistar大鼠適應性飼養一周，採用大腦中動脈栓塞法(MCAO)造成局灶性腦缺血模型。大鼠經0.4％戊巴比妥鈉lml/100g腹腔注射麻醉後，仰位固定，頸部正中碘酒消毒，取正中切口，逐層分離至氣管，玻璃分針分離出右側頸總動脈，沿頸總動脈向上分離出頸內動脈和頸外動脈(注意保護頸內動脈神經叢)，穿線結紮頸總動脈近心端後，提起頸總動脈，在距離頸內動脈和頸外動脈分叉處遠端約3mm處剪開一小口，用處理過的尼龍線沿剪口插入頸內動脈19～21mm，結紮遠端，剪去並測量實際穿入的線長，提起的組織恢復原位，逐層縫合皮膚。假手術對照組穿入尼龍線長為10mm，其餘操作與模型組完全相同。試驗結束取腦組織時觀察記錄穿線到達的部位並測量實際穿入的線長，再次驗證模型的成功複製與否，有不符者，不計入數據處理。
2.5.2分組與給藥動物分組手術後大鼠清醒即刻進行評分，參考Zea Longa5分制評分標準評分(0分，無神經損傷症狀；1分，不能伸展對側前爪；2分，向外側轉圈；3分，向對策傾倒；4分，不能自發行走，意識喪失)，凡出現神經損傷症狀的均視為造模成功，按性別、體重均衡隨機分組，分別為假手術對照組，模型對照組，尼莫地平對照組，複方三酮腦通片高、中、低三個劑量組，每組10隻。
給藥劑量與途徑假手術對照組、模型對照組給予0.9％生理鹽水，尼莫地平對照組1g/kg配成10％水溶液，複方三酮腦通片1.6g/kg、0.8g/kg、0.4g/kg(4倍、2倍、1倍臨床等效量)配成16％、8％、4％的水溶液，各組按1ml/100g·ig，每天評分後8Am給藥，連續14天。
2.5.3對MCAO大鼠神經體徵變化的影響各組大鼠用藥前評分並依據評分情況進行分組，除假手術對照組外，各組間評分無顯著性差異(P＞0.05)，用藥後第二周再次評分，結果見表6。
表6對MCAO大鼠神經體徵變化的影響X±SD
注與用藥前比較「##」P＜0.01，「###」P＜0.001；與模型組比較「*」P＜0.05，「**」P＜0.01。
試驗結果提示用藥組第二周低劑量組和中劑量組評分下降程度較大(P＜0.001)，高劑量組也有所下降，但不如中、低劑量組明顯(P＜0.01)，尼莫地平對照組下降沒有統計學意義；與模型對照組比較中、低劑量組有顯著性差異。說明本品能明顯促進神經體徵的恢復。
2.5.4對Morris水迷宮試驗逃避潛伏期、平臺象限內活動及時間的影響大鼠給藥7天後進行Morris水迷宮訓練，在圓桶上緣等距離設東、西、南、北4個標記點，以4個標記點在水面上和水桶底部的投影點，將水面和水桶分成4個象限。按試驗要求，將平臺設置於東北象限，試驗時將水桶加水至40cm，水溫控制在23～25℃，站臺頂端平面低於水平面1～2cm，每天將試驗動物按東、西、南、北四個入水點分別放入水池中。記錄動物的入水時間，井記錄動物自入水到找到平臺後四肢爬上平臺時所需要的時間，作為逃避潛伏期。最大潛伏期取60秒，若大鼠在60秒內未能找到水池中的站臺或未能爬上站臺，將大鼠放置於站臺上休息10秒，10秒後將大鼠從站臺上取下，休息30～60秒後，再進行下一次訓練。該訓練每日一次，共五天，第六天進行測試，四方向取均值為平均潛伏期，t檢驗進行組間比較，結果如表7，並記錄各組大鼠經過平臺的次數，t檢驗進行組間比較，結果如表8。
表7對MCAO大鼠Morris水迷宮平均逃避潛伏期的影響 X±SD
注與假手術對照組比較「#」P＜0.05；與模型對照組比較「*」P＜0.05。
試驗結果提示四個方向取平均值為平均潛伏期，結果用藥組與模型對照組比較均有顯著性差異(P＜0.05)，以低劑量組最明顯，與假手術對照組相比較均無顯著性差異(P＞0.05)，本品可縮短Morri s水迷宮平均逃避潛伏期，接近假手術對照組水平。試驗說明本品對急性腦缺血大鼠Morris水迷宮的空間學習記憶功能有明顯的恢復作用。
表8對MCAO大鼠Morris水迷宮經過平臺次數的比較 X±SD
注與假手術對照組比較「##」P＜0.01，「###」P＜0.001；與模型對照組比較「*」P＜0.05，「***」P＜0.001。
試驗結果提示各組與模型對照組比較有非常顯著的差異(P＜0.001)，給藥高劑量組與假手術對照組比較有顯著性差異(P＜0.01)，其中以中劑量最好。說明本品可以提高急性腦缺血大鼠Morris水迷宮的空間學習記憶功能。促進學習記憶功能的恢復。
第七天撤走平臺，進行大鼠遊泳軌跡錄像給藥完畢後再進行訓練三天，第四天測試，第五天應用錄像機錄大鼠遊泳軌跡，記錄大鼠各平臺象限內遊泳的距離和時間，結果如表9；計算平臺象限遊泳距離比值和時間比值，結果如表10。
表9對平臺及非平臺象限遊泳距離與時間的影響X±SD
注與假手術組比較「#」P＜0.05，「##」P＜0.01，「###」P＜0.001；與模型組比較「*」P＜0.05，「**」P＜0.01，「***」P＜0.001；與尼莫地平組比較「」P＜0.05。
試驗結果提示平臺象限遊泳距離模型對照組、尼莫地平組、中劑量組與假手術對照組比較有顯著性差異(P＜0.05)，其它組比較則無顯著性差異(P＞0.05)；非平臺象限的遊泳距離各組相比無顯著性差異(P＞0.05)。平臺象限遊泳時間假手術對照組、高劑量組與模型對照組比較有非常高的顯著性差異(P＜0.001)，尼莫地平對照組與模型組比較也有較大的顯著性差異(P＜0.01)，高劑量組與尼莫地平組比較有顯著性差異(P＜0.05)；非平臺象限遊泳時間高劑量和加手術對照組與模型對照組比較有非常高的顯著性差異(P＜0.001)，高劑量組與尼莫地平組比較有顯著性差異(P＜0.05)。試驗說明本品可以增加平臺象限內遊泳距離和遊泳時間，降低非平臺象限內遊泳距離和遊泳時間。說明本品可以一定程度的恢復MCAO大鼠造成的記憶功能。
表10對遊泳平臺象限距離比與時間比的影響 X±SD
注與模型組比較「*」P＜0.05；與假手術對照組比較「#」P＜0.05；與尼莫地平對照組比較「」P＜0.05。
試驗結果提示用藥後高、中劑量組與模型對照組比較平臺象限遊泳距離比有顯著性差異(P＜0.05)，且與假手術對照組比較無統計學意義；平臺象限遊泳時間百分比也為高、中劑量組明顯優於尼莫地平對照組和低劑量組，與模型對照組有顯著性差異(P＜0.05)，而與假手術組比較無顯著性差異(P＞0.05)。試驗說明本品可以增加平臺象限內遊泳距離比和遊泳時間比，說明本品可以恢復MCAO大鼠造成的記憶功能。
2.5.5對MCAO大鼠避暗試驗的影響試驗裝置分為明暗兩室，明室為40cm×25cm×25cm。上方懸掛一40W鎢絲燈。暗室為20cm×15cm×25cm。兩室之間有一直徑為7.5cm的圓洞，兩室底部中間位置的銅柵可以通電，採用40V電壓，暗室與計時器相連，可以自動記錄潛伏期時間。利用大鼠的趨暗性，記錄每隻大鼠從放入明室到進入暗室遇到電擊所需的時間，為潛伏期。記錄進入暗室的動物數、潛伏期和5min內的電擊次數(即錯誤次數)。造模前訓練一天，動物進入暗室立即通電，共進行5min，第二天斷電後進行測試潛伏期與5min內的錯誤次數，造模及給藥後再進行一次訓練與測試。觀察潛伏期及錯誤次數，結果如下表11。
表11對MCAO大鼠避暗試驗潛伏期和錯誤次數的影響X±SD
注與假手術組比較「#」P＜0.05。
試驗結果提示各組對避暗試驗錯誤次數與模型組比較無明顯的影響(P＞0.05)，對潛伏期尼莫地平組與假手術組比較有顯著性差異，而其它組則無明顯影響。試驗說明複方三酮腦通片對mcao大鼠避暗試驗潛伏期和錯誤次數無明顯的影響。
2.5.6對MCAO大鼠血液中的NO、ET、SOD、MDA、GSH-PX的影響給藥兩周後，仰臥位固定大鼠，0.8％硫化鈉溶液頸部脫毛，碘酊消毒，經頸靜脈抽血4ml。2ml注入含7.5％EDTA-Na230μl和抑肽酶40μl的塑料試管內，4℃低溫3500rpm離心10min，分離上層液(血漿，黃色)，-70℃保存；另取2ml血，不抗凝，待血凝固後，3000rpm離心10min，分離上層液(血清)，備用。按說明書操作測定NO、ET、SOD、MDA、GSH-PX。結果如表12～13。
表12對MCAO大鼠血液ET-1、NO含量的影響X±SD
注與假手術組比較「#」P＜0.05；與模型組比較「*」P＜0.05，「**」P＜0.01；與尼莫地平組比較「」P＜0.05。
試驗結果提示低劑量組NO水平與模型對照組、尼莫地平對照組相比明顯降低(P＜0.05)，模型對照組與假手術對照組比較有顯著性差異(P＜0.05)；各用藥組ET水平與假手術對照組、模型對照組比較無明顯差異(P＞0.05)。說明給藥組可以使急性腦缺血大鼠血液中升高的NO水平降低至正常水平，而對血液中ET的影響卻不明顯。
表13對MCAO大鼠血液SOD、MDA、GSH-PX含量的影響 X±SD
注與假手術對照組比較「#」P＜0.05，「###」P＜0.001；與模型對照組比較「*」P＜0.05，「***」P＜0.001；與尼莫地平對照組比較「」P＜0.05。
試驗結果提示高、低劑量、尼莫地平組血清總SOD活力水平較模型對照組明顯升高(P＜0.001)，與假手術對照組比較，中劑量組有顯著性差異，對血清MDA的影響與對照組比較，中劑量組有顯著性差異(P＜0.05)。試驗結果說明本品可以升高MCAO大鼠的總SOD水平，對MDA、GSH-PX影響不明顯。
2.5.7對MCAO大鼠腦組織形態改變及iNOS表達的影響大鼠給藥14天後，0.4％戊巴比妥鈉1ml/100g，腹腔麻醉，迅速斷頭取腦組織，4％多聚甲醛浸泡，做病理切片，觀察腦組織形態結構變化，並選擇海馬的CA1區高倍視野(40×)計數該區域神經元的死亡個數，以細胞出現濃染、核固縮、核碎裂為陽性，計算100個神經細胞的死亡率，結果如表14。
表14對MCAO大鼠海馬擦CA1區神經元死亡率的影響 X±SD
注與假手術組比較「###」P＜0.001；與模型組比較「***」P＜0.001；與尼莫地平對照組比較「」P＜0.01。
試驗結果提示假手術對照組海馬CA1區神經元細胞無明顯的死亡，模型對照組神經元死亡率高達38.33％，各用藥組的神經元死亡率在22％左右，與模型對照組比較有高度的統計學意義(P＜0.001)，與尼莫地平對照組比較，高劑量組有顯著性差異(P＜0.01)，試驗說明本品可以顯著減少急性MCAO大鼠腦缺血後海馬CA1區神經元的死亡。
免疫組化法製備腦組織中性樹膠封片，光學顯微鏡下選擇大腦缺血區神經細胞，以細胞漿出現鮮豔的棕黃色染色為陽性細胞，計數每高倍鏡視野下(40×)的陽性細胞光密度值，觀察大腦缺血區神經細胞表達光密度及血管iNOS表達陽性，結果如表15。
表15對缺血區神經細胞NOS表達平均光密度的影響 X±SD
注與假手術對照組比較「###」P＜0.001；與模型對照組比較「***」P＜0.001；與尼莫地平對照組比較「」P＜0.001。
試驗結果提示與模型對照組比較給藥三個劑量組及尼莫地平組均具有高度的統計學意義(P＜0.001)，與假手術組比較，給藥低劑量組和尼莫地平組有高度的統計學差異，與尼莫地平對照組比較，給藥高、中劑量組具有高度統計學差異。試驗說明本品可以減弱神經細胞iNOS的表達，使之恢復接近假手術組的水平，且與用藥劑量成線性相關。
2.5.8對MCAO大鼠腦梗死面積的影響大鼠腦組織切片(每鼠5片)，置TT染色，37℃孵育30min，非缺血區為玫瑰紅，梗死區為白色，立即由掃描儀掃描，圖像處理系統(IPP系統，美國MediA，cydenetics公司)，計算各鼠缺血面積，並計算佔大鼠腦組織切片的面積百分比，t檢驗進行組間統計比較，結果如表16表16對MCAO大鼠腦組織梗死面積的影響X±SD
與假手術對照組比較「###」P＜0.001；與模型對照組比較「*」P＜0.05，「***」P＜0.001。
試驗結果提示與假手術對照組相比各組均有高度的統計學差異(P＜0.001)；與模型對照組相比高劑量組和尼莫地平組有顯著性差異(P＜0.05)，中、低劑量組有高度的統計學差異(P＜0.001)；各給藥組與尼莫地平組相比沒有明顯的差別。試驗說明本品可以縮小MCAO大鼠腦梗死面積，對腦梗死具有保護作用，以中劑量最為明顯。
權利要求
1.一種治療缺血性腦病的藥物，其特徵在於是由以下重量配比的原料和藥用輔料製成，羌活6-12g，川芎6-12g，三七6-12g，葛根提取物0.2-0.8g，山楂葉提取物0.2-0.8g，銀杏葉提取物0.2-0.8g。
2.根據權利要求1所述的藥物，其特徵在於所述原料的重量配比為，羌活8-10g，川芎8-10g，三七8-10g，葛根提取物0.4-0.6g，山楂葉提取物0.4-0.6g，銀杏葉提取物0.4-0.6g。
3.根據權利要求1或2所述的藥物，其特徵在於所述的藥物為片劑。
4.一種權利要求3所述的藥物的製備方法，其特徵在於包括以下步驟，(1)羌活、川芎飲片超臨界CO2流體提取揮髮油，揮髮油用β-環糊精包結，得β-環糊精包結物，藥渣備用；(2)羌活、川芎藥渣加10倍量60％乙醇，回流提取2次，每次2小時，提取液合併，減壓回收乙醇，並繼續濃縮至在80℃下相對密度為130～1.31的稠膏，60℃減壓乾燥成羌活、川芎幹膏；(3)三七粉碎成粗粉，加10倍量60％乙醇，回流提取3次，每次2小時，提取液合併，減壓回收乙醇，並繼續濃縮至在80℃下相對密度為1.30～1.31的稠膏，60℃減壓乾燥成三七幹膏；(4)川芎、羌活幹膏和三七幹膏合併，粉碎成細粉，加入葛根提取物、山楂葉提取物、銀杏葉提取物和β-環糊精包結物，再加入適量輔料，混勻，加20％聚維酮乙醇溶液適量，16目篩溼法制粒，60℃烘乾，整粒，加入適量崩解劑，壓製成片劑。
全文摘要
本發明涉及一種治療缺血性腦病的純中藥製劑，以及上述藥物的製備方法。本發明的藥物，是由以下重量配比的原料和藥用輔料製成，羌活6－12g，川芎6－12g，三七6－12g，葛根提取物0.2－0.8g，山楂葉提取物0.2－0.8g，銀杏葉提取物0.2－0.8g。上述本發明藥物，羌活、川芎飲片採用超臨界CO
文檔編號A61K9/20GK1772069SQ20051004500
公開日2006年5月17日 申請日期2005年11月1日 優先權日2005年11月1日
發明者李貴海, 楊書斌, 於宗淵, 蘇本正 申請人:山東省中醫藥研究院