一種基於微間隙陣列電極的酶催化電導免疫傳感器及其用於檢測血吸蟲的方法

2023-04-25 03:19:11 1

專利名稱：一種基於微間隙陣列電極的酶催化電導免疫傳感器及其用於檢測血吸蟲的方法
技術領域：
本發明屬於生物分析領域，具體涉及一種用於檢測血吸蟲的微間隙電極 陣列免疫傳感器及其檢測血吸蟲的方法。
技術背景血吸蟲病是一種危害性很大的寄生蟲傳染病，在亞非拉等地區非常猖獗。根據世界衛生組織(冊o)報導，每年有約二十億人被感染上血吸蟲病。現在已有一些檢測方法應用於臨床，例如免疫電泳沉積，酶聯免疫檢測，直接螢光檢測和放射性免疫分析等。但是這些方法比較複雜，費時，並且往往需要昂貴的儀器或放射性物質，更重要的是這些方法往往不能很好的對血吸蟲病進行早期診斷。因此隨著時間的推移，很有必要開發一種快速，靈敏，價廉的血吸蟲病診斷方法。 發明內容本發明的目的在於，為克服傳統血吸蟲病檢測方法靈敏度低、需精密儀 器定量檢測的不足，提出一種基於微間隙陣列電極的酶催化電導免疫傳感器 及其用於檢測血吸蟲的方法，用於檢測血吸蟲病具有高靈敏、快速、低成本 的特點。本發明的技術方案之一是，所述基於微間隙陣列電極的酶催化電導免疫 傳感器採用微間隙陣列金電極做基片，並採用以下步驟製得(1)取常規光刻印刷法製作的微間隙陣列金電極做基片，它為叉指式雙 電極，正負電極均為兩個梳形金電極，彼此交叉組成微間隙陣列金電極。 梳形齒D,寬為l|Lim—100^，間隙02為ljLim—100iLiin (參見圖1);(2) 微間隙陣列金電極的矽烷化處理，過程是a. 將微間隙陣列金電極用無水乙醇清洗三次，每次lmin;b. 將所述電極浸入l M的Na0H溶液中28min—32min，再用超純水清 洗該電極三次，每次lmin;吹乾；c. 將所述電極浸入含氨丙基三甲氧基矽垸5% (體積百分數)的乙醇溶 液中，室溫下靜置23小時一25小時；這樣可在微間隙陣列金電極間的基片 上形成一氨基矽烷自組裝單層；d. 用超純水清洗所述電極三次，吹乾，即獲得矽烷化的微間隙陣列金電極；(3) 免疫傳感器的製備，步驟是a. 將所述矽烷化的微間隙陣列金電極浸入質量分數為5%的戊二醛水 溶液，室溫下靜置0. 8小時一l. 2小時；b. 用超純水清洗所述電極三次後，在該電極上滴加3(VL日本血吸蟲 抗原溶液，該溶液中抗原濃度為10(Vg/mL (將日本血吸蟲抗原溶於0.01M、 pH 7. 4磷酸緩衝溶液即得所述日本血吸蟲抗原溶液)；室溫下靜置反應1小 時；這樣使得血吸蟲抗原通過戊二醛交聯劑固定在微間隙陣列金電極的基片上；c. 用超純水清洗所述電極三次，吹乾，即得免疫傳感器，保存於4°C備用o本發明的技術方案之二是，採用所述基於微間隙陣列電極的酶催化電導免疫傳感器檢測血吸蟲的方法，其步驟是(1) 將血吸蟲感染血清或正常血清樣品溶液3(VL滴加在固定有血吸蟲 抗原的免疫傳感器上，室溫下靜置反應0.4小時一0.6小時；這樣樣品中的血吸蟲抗體通過免疫反應被捕獲到傳感器表面上，並形成血吸蟲抗原一抗體 免疫複合物。(2) 在所述傳感器表面滴加2(VL鹼性磷酸酶標記的第二抗體溶液(將鹼性磷酸酶標記的羊抗人IgG抗體溶於0. 01M、 pH 7. 4磷酸緩衝溶液得到該 第二抗體溶液，抗體濃度為10昭/mL)，於室溫下靜置反應0.5小時；鹼性磷 酸酶標記的羊抗人IgG抗體由此通過與免疫複合物中的一抗發生反應而被捕 獲到傳感器表面上；(3)將所述傳感器置於銀沉積溶液中，該銀沉積溶液為lmM抗壞血酸磷酸酯，2mM AgN03的0. 1M甘氨酸-NaOH緩衝溶液，pH9. 0;室溫下靜置反 應8min—12min;再從該電極獲取與血吸蟲抗體濃度相關的電導(或電阻) 信號。該步驟(3)中，傳感器表面上鹼性磷酸酶催化其底物抗壞血酸磷酸酯 水解產生還原劑抗壞血酸，後者將溶液中銀離子還原成銀金屬並沉積在微間 隙陣列金電極上，使微間隙陣列金電極正負電極部分導通，從而增大微間隙 陣列金電極的電導(或降低電阻)，獲得與血吸蟲抗體濃度相關的電導(或 電阻)信號。本發明為一種基於微間隙陣列電極的酶催化電導免疫傳感器及其用於 檢測血吸蟲的方法，它的的優點有-1. 微間隙陣列電極製備簡單，可大批量、低成本生產；2. 檢測步驟簡單，檢測時間在lh內，檢測所需的儀器可用萬用電錶或自行研製的電阻量測裝置，便攜且價格低廉；3. 本免疫傳感器靈敏度高，可實現lfg/mL血吸蟲抗體的檢測，且背景幹擾很小。


圖l是微間隙陣列電極圖樣(黑色區域為金膜，白色區域為裸露的基片)。 掩膜圖樣與此相反(黑色區域為透明區，白色區域為不透明區)。它為叉指 式雙電極，正負電極均為兩個梳形金電極，彼此通過微米級絕緣間隙交叉組 成陣列式金電極。正負電極的梳形齒數5至20個，寬為1)um—100)Li。電極 間隙為1,—100,。
具體實施方式
實施例1:基於微間隙陣列電極的免疫傳感器檢測血吸蟲感染兔血清樣P口卩o1. 免疫傳感器的製備將微間隙陣列金電極用無水乙醇(100%)清洗三次(每次lmin)後， 將電極浸入1 M的NaOH溶液中30min;再用超純水清洗電極三次(每次lmin)， 吹乾；然後，將電極浸入含氨丙基三甲氧基矽烷5% (體積百分數)的乙醇溶 液中，室溫下靜置24小時；用超純水清洗三次後吹乾，獲得矽烷化的微間 隙陣列金電極。將矽垸化的微間隙陣列金電極浸入戊二醛水溶液(質量分數5%)，室溫 下靜置l小時；用超純水清洗三次後，在電極上滴加3(VL血吸蟲抗原溶液 (抗原濃度為100昭/mL，磷酸緩衝溶液，NaTO為0. OIM， pH 7.4)，室溫 下靜置反應l小時；用超純水清洗三次後吹乾備用。2. 血吸蟲感染兔血清樣品的檢測將感染血吸蟲45天的兔血清作一系列稀釋，將稀釋後的溶液(20^) 滴加在血吸蟲免疫傳感器上，室溫下靜置反應0.5小時。在傳感器表面滴加 20 鹼性磷酸酶標記的羊抗兔IgG抗體溶液(酶標抗體濃度為1(Vg/mL， 溶於磷酸緩衝溶液，其中Na3P04為0.01M， pH7.4)，於室溫下靜置反應0. 5 小時；將傳感器置於銀沉積溶液(lmM抗壞血酸磷酸酯，2mMAgN03的0. 1M甘 氨酸-NaOH緩衝溶液，pH9.0)中，室溫下靜置反應10min;然後，將免疫傳 感器正負極分別與電化學工作站(CHI 760C)的工作電極與對電極(參比電 極與對電極複合)連接，採用線性掃描伏安法在0 50mV電位範圍檢測，記 錄傳感器電流隨電位變化的響應曲線，並計算其斜率(即電導值)。根據不 同稀釋度血清的電導值，獲得工作曲線。使用所研製的血吸蟲免疫傳感器如上法對7個血吸蟲感染兔血清樣品和 3個正常血清樣品進行測定，根據樣品的電導響應值與工作曲線，求得對應的血吸蟲抗體濃度。與ELISA方法對照，所研製的免疫傳感器的結果與ELISA 的測定值的相對誤差都在5. 8%以內。實施例2:基於微間隙陣列電極的免疫傳感器檢測血吸蟲感染人血清樣叩o1. 免疫傳感器的製備將微間隙陣列金電極用無水乙醇(100%)清洗三次(每次lmin)後， 將電極浸入1 M的NaOH溶液中30min;再用超純水清洗電極三次(每次lmin)， 吹乾；然後，將電極浸入含氨丙基三甲氧基矽烷5% (體積百分數)的乙醇溶 液中，室溫下靜置24小時；用超純水清洗三次後吹乾，獲得矽烷化的微間 隙陣列金電極。將矽垸化的微間隙陣列金電極浸入戊二醛水溶液(質量分數5%)，室溫 下靜置1小時；用超純水清洗三次後，在電極上滴加3(VL血吸蟲抗原溶液 (抗原濃度為10(Vg/mL，磷酸緩衝溶液，Na3P04為O.OIM， pH 7.4)，室溫下靜置反應l小時；用超純水清洗三次後，吹千，備用。2. 血吸蟲感染人血清樣品的檢測將感染血吸蟲的人血清作一系列稀釋，將稀釋後的溶液(2(VL)滴加在 血吸蟲免疫傳感器上，室溫下靜置反應0. 5小時；在傳感器表面滴加2(VL鹼 性磷酸酶標記的羊抗人IgG抗體溶液(酶標抗體濃度為1(Vg/mL，磷酸緩衝溶液，Na3P04為0.01M， pH7.4)，於室溫下靜置反應0. 5小時；將傳感器置 於銀沉積溶液(lmM抗壞血酸磷酸酯，2mM AgN03的0. 1M甘氨酸-NaOH緩衝 溶液，pH9.0)中，室溫下靜置反應10min;按照實施案例1的方法測定傳感 器的電導，得到工作曲線。使用所研製的血吸蟲免疫傳感器如上法對5個正常人與10個血吸蟲病 人的血清樣品進行測定，根據樣品的電導響應值與工作曲線，求得對應的血吸蟲抗體濃度。與ELISA方法對照，所研製的免疫傳感器的結果與ELISA的 測定值的相對誤差都在6. 9%以內。
權利要求
1.一種基於微間隙陣列電極的酶催化電導免疫傳感器，其特徵是，採用微間隙陣列金電極做基片，並採用以下步驟製得(1)取常規光刻印刷法製作的微間隙陣列金電極做基片，它為叉指式雙電極，正負電極均為兩個梳形金電極，彼此交叉組成微間隙陣列金電極。梳形齒寬為1μm-100μm，間隙為1μm-100μm；(2)微間隙陣列金電極的矽烷化處理，過程是a.將微間隙陣列金電極用無水乙醇清洗三次，每次1min；b.將所述電極浸入1M的NaOH溶液中28min-32min，再用超純水清洗該電極三次，每次1min；吹乾；c.將所述電極浸入含氨丙基三甲氧基矽烷5％(體積百分數)的乙醇溶液中，室溫下靜置23小時-25小時；這樣可在微間隙陣列金電極間的基片上形成一氨基矽烷自組裝單層；d.用超純水清洗所述電極三次，吹乾，即獲得矽烷化的微間隙陣列金電極；(3)免疫傳感器的製備，步驟是a.將所述矽烷化的微間隙陣列金電極浸入質量分數為5％的戊二醛水溶液，室溫下靜置0.8小時-1.2小時；b.用超純水清洗所述電極三次後，在該電極上滴加30μL日本血吸蟲抗原溶液，室溫下靜置反應1小時；該日本血吸蟲抗原溶液是將所述抗原溶於0.01M、pH 7.4磷酸緩衝溶液而得，溶液中所述抗原濃度為100μg/mL；c.用超純水清洗所述電極三次，吹乾，即得免疫傳感器。
2、 一種採用所述基於微間隙陣列電極的酶催化電導免疫傳感器檢測血 吸蟲的方法，其特徵是，該方法的歩驟為(1)將血吸蟲感染血清或正常血清樣品溶液30)tiL滴加在固定有血吸蟲抗原的免疫傳感器上，室溫下靜置反應0.4小時一0.6小時；這樣樣品中的 血吸蟲抗體通過免疫反應被捕獲到傳感器表面上，並形成血吸蟲抗原一抗體 免疫複合物。(2) 在所述傳感器表面滴加2(VL鹼性磷酸酶標記的第二抗體溶液，於室溫下靜置反應0. 5小時；該第二抗體溶液為鹼性磷酸酶標記的羊抗人IgG抗體溶液，抗體濃度為10昭/mL，它是將所述抗體溶於0. OIM、 pH 7. 4磷酸 緩衝溶液而得；鹼性磷酸酶標記的羊抗人IgG抗體由此通過與免疫複合物中 的一抗發生反應而被捕獲到傳感器表面上；(3) 將所述傳感器置於銀沉積溶液中，該銀沉積溶液為lmM抗壞血酸磷酸酯，2mM AgN03的0. 1M甘氨酸-NaOH緩衝溶液，pH9. 0;室溫下靜置反 應8min—12min;再從該電極獲取與血吸蟲抗體濃度相關的電導或電阻信號。
全文摘要
本發明提供了一種基於微間隙陣列電極的酶催化電導免疫傳感器及其用於檢測血吸蟲的方法，傳感器包括微間隙陣列電極、矽烷化處理的電極基片、具有良好導電性的酶沉積物。本發明利用微間隙電極陣列免疫傳感器，對日本血吸蟲抗體進行檢測，提供了一種快速，靈敏，高通量的血吸蟲病診斷方法，可望為血吸蟲病的早期診斷與現場篩查提供有效的技術手段。
文檔編號G01N33/535GK101271112SQ20081003132
公開日2008年9月24日 申請日期2008年5月16日 優先權日2008年5月16日
發明者俞汝勤, 霞 楚, 沈國勵, 蔣健暉, 勇 黃 申請人:湖南大學