玉米中與鐮孢屬穗黴菌抗性相關聯的基因座的製作方法

2023-04-24 20:49:56 1

專利名稱：玉米中與鐮孢屬穗黴菌抗性相關聯的基因座的製作方法
技術領域：
本公開涉及用於增強玉米植株中鐮孢屬(Fusarium)穗黴菌抗性的組合物和方法。
背景技術：
鐮孢屬穗黴菌(也稱為鐮孢屬穗腐病)是藤倉赤黴菌(Gibberella fuijkuroi) 複合種，即輪枝鐮孢菌(F. verticillioides)、層出鐮孢菌(F. proliferatum)和/或膠孢鐮孢菌(F. subglutinans.)引起的玉米破壞性病害。它主要存在於美國東南部、歐洲南部、 墨西哥、巴西、阿根廷和南非，並影響籽粒產量和質量。鐮孢屬穗黴菌也可導致若干種真菌毒素包括伏馬菌素(FUM)、串珠鐮孢菌素(MON)和/或白僵菌素的汙染，這些真菌毒素可引起許多人類和動物疾病。伏馬菌素例如與若干種動物中毒症相關，這些動物中毒症包括腦白質軟化(Marasas 等人(1988)Onderstepoort J. Vet. Res. 55 197-204 ;Wilson 等人 (1990)American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians :Abstracts 33rd Annual Meeting, Denver, Colo.，Madison, Wis.，USA)和豬肺水腫(Colvin 等人 (1992)Mycopathologia 117 :79-82)。伏馬菌素也是可疑致癌物(Geary 等人(1971) Coord. Chem. Rev. 7 :81 ；Gelderblom 等人(1991) Carcinogenesis 12 :1247-1251 ；Gelderblom 等人(1992) Carcinogenesis 13 :433-437)，並且與人類出生缺陷相關(Missmer 等人(2006) Environ Health perspect 114:237-41)。雖然穗的物理損害和特定環境條件可導致鐮孢屬穗黴菌出現，但是鐮孢屬穗黴菌的病原學知之甚少(Nelson等人(1992)Mycopathologia 117:29-36)。當真菌生長條件為最適宜時，現有的栽培技術都不足以將真菌毒素水平減小到被美國食品藥品監督管理局 (Food and Drug Administration))視為「安全」的水平。已鑑定出鐮孢屬穗黴菌遺傳抗性 (Gendloff 等人(1986)Phytopathology 76 :684-688 ；Holley 等人(1989)Plant Dis. 73 578-580)，並且經過若干次育種嘗試，已鑑定出具有可遺傳鐮孢屬穗黴菌抗性的玉米種質。 然而，在玉米自交系中引入該抗性很困難。採用表型選擇來鑑別抗性的基因滲入，這種方式不僅耗時而且困難，並且由於鐮孢屬穗黴菌對環境條件較敏感，所以僅僅基於表型來進行年復一年的抗性正選擇已被證明是不可靠的。此外，專門的病害篩查場所的運作高昂，並且植株必須生長成熟才能對抗性或易感性水平進行分類。通過使用與鐮孢屬穗黴菌抗性相關聯的分子標記進行選擇具有以下優點使得至少一些選擇僅基於子代的遺傳組合物進行。此外，鐮孢屬穗黴菌抗性在植株生命周期非常早的階段甚至早至種子期就可確定。使用與鐮孢屬穗黴菌抗性性狀相關聯的分子標記可獲得更高的選擇率，這就意味著鐮孢屬穗黴菌抗性的植物育種可更迅速地開展，從而在相對較短的時間內生成商業上可接受的抗性植株。因此，希望提供用於鑑定和選擇具有增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的玉米植物的組合物和方法。可在育種程序中使用這些植株，以便產生具有鐮孢屬穗黴菌抗性的高產雜交種。發明概述本發明提供用於鑑定和選擇具有增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的玉米植物的組合物和方法。在一個實施方案中，提供了選擇具有增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的玉米植物的方法。在這些方法中，獲取DNA並檢測至少一種標記等位基因的存在。標記等位基因可包括與任何下列標記等位基因連鎖並關聯的任何標記等位基因位於PHM8211-16的「T」、位於 PHM8711-14 的 「C」、位於 PHM14506-7 的 「T」、位於 PHM1934-37 的 「C」、位於 PHM8711-17 的 「C」、位於 PHM1754-20 的 「C」、位於 PHM3951-25 的 「T」、位於 PHM6929-3 的 「C」、位於 PHM10054-14 的 「A」、位於 PHM10721-9 的 「A」、位於 PHM10721-16 的 「A」、位於 PHM15661-21 的 「G」、位於 PHM9362-8 的 「G」、位於 PHMl 147-16 的 「G」、位於 PHMl 1850-3 的 「T」、位於 PHMl 1850-6 的 「C」、位於 PHM13773-6 的 「A」、位於 PHM13773-11 的 「C」、位於 PHM16422-11 的 「A」、位於 PHM1147-19 的 「T」、位於 PHM5280-41 的 「G」、位於 PHM9301-37 的 「T」 和位於 PHM4423-4的「T」。然後選擇具有與任何上文列出的標記等位基因連鎖並關聯的標記等位基因的玉米植物作為具有增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的玉米植物。在其他實施方案中，標記等位基因可與任何下列標記等位基因連鎖位於 PHM8211-16 的 「T」、位於 PHM8711-14 的 「C」、位於 PHM14506-7 的 「T」、位於 PHM1934-37 的 「C」、位於 PHM8711-17 的 「C」、位於 PHM1754-20 的 「C」、位於 PHM3951-25 的 「T」、位於 PHM6929-3 的 「C」、位於 PHM10054-14 的 「A」、位於 PHM10721-9 的 「A」、位於 PHM10721-16 的 「A」、位於 PHM15661-21 的 「G」、位於 PHM9362-8 的 「G」、位於 PHMl 147-16 的 「G」、位於 PHMl 1850-3 的 「T」、位於 PHMl 1850-6 的 「C」、位於 PHM13773-6 的 「A」、位於 PHM13773-11 的 「C」、位於 PHM16422-11 的 「A」、位於 PHMl 147-19 的 「T」、位於 PHM5280-41 的 「G」、位於 PHM9301-37 的 「T」 和位於 PHM4423-4 的 「T」，距離為 30cM、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、 2、1、0. 9,0. 8,0. 7,0. 6,0. 5,0. 4,0. 3,0. 2、或0. lcM，或它可以是任何下列的標記等位基因 位於 PHM8211-16 的「T」、位於 PHM8711-14 的「C」、位於 PHM14506-7 的「T」、位於 PHM1934-37 的 「C」、位於 PHM8711-17 的 「C」、位於 PHM1754-20 的 「C」、位於 PHM3951-25 的 「T」、位於 PHM6929-3 的 「C」、位於 PHM10054-14 的 「A」、位於 PHM10721-9 的 「A」、位於 PHM10721-16 的 「A」、位於 PHM15661-21 的 「G」、位於 PHM9362-8 的 「G」、位於 PHMl 147-16 的 「G」、位於 PHMl 1850-3 的 「T」、位於 PHMl 1850-6 的 「C」、位於 PHM13773-6 的 「A」、位於 PHM13773-11 的 「C」、位於 PHM16422-11 的 「A」、位於 PHMl 147-19 的 「T」、位於 PHM5280-41 的 「G」、位於 PHM9301-37 的 「T」 和位於 PHM4423-4 的 「T」。在一個實施方案中，提供了通過檢測玉米植物基因組中的標記基因座來鑑定具有增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的玉米植物的方法，所述檢測使用標記基因座的序列、標記基因座的部分序列、或標記基因座的互補序列、或其部分序列作為標記探針。標記探針在嚴格條件下與介於以下序列之間並包括以下序列的連續的DNA雜交SEQ ID NO :41或基於 Clustal V比對方法與SEQ ID NO :41具有95%同一性的核苷酸序列、以及SEQ ID NO 47 或基於Clustal V比對方法與SEQ ID NO 47具有95%同一性的核苷酸序列，並且標記基因座包含至少一個與增強的鐮孢屬穗黴菌抗性相關聯的等位基因。用該方法鑑定的玉米植物也是受關注的。在另一個實施方案中，提供了通過檢測玉米植物種質中至少一個與增強的抗性相關聯的標記等位基因來鑑定具有增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的玉米植物的方法。標記基因座可選自任何下列的標記基因座PHM和SSR標記PHM6929、bnlgl007、PHM8711、bnlgl083、 PHM8211、PHM14506、PHM1754、PHM3951、PHM1934、PHM10054、PHM10721 和 PHM15661 ；以及 SNP 標記 PHM8211-16-1、PHM8711-14-U、PHM14506-7-U、PHM1934-37-U、PHM8711-17-U、 PHM1754-20-U、 PHM395卜25_U、 PHM6929-3-U、 PHM10054-14-U、 PHM1072卜9-U、 PHM10721-16-U和PHM15661-21-U ；以及與這些標記連鎖的任何其他標記。標記基因座也可存在於1號染色體上的區間，所述區間包含並側接i. PHM6929 和 PHM1934，或ii. PHM6929 和 PHM14506。標記基因座包含至少一個與增強的鐮孢屬穗黴菌抗性相關聯的等位基因。用該方法鑑定的玉米植物也是受關注的。在另一個實施方案中，提供了通過檢測與增強的鐮孢屬穗黴菌抗性相關聯的玉米植物種質的單倍型來鑑定具有增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的玉米植物的方法。單倍型在一個或多個標記基因座包含等位基因，其中一個或多個標記基因座存在於1號染色體上的區間，所述區間包含並側接i. PHM6929 和 PHM1934，或ii. PHM6929 和 PHM14506。單倍型可包含至少一個下列等位基因位於PHM8211-16的「T」、位於PHM8711-14 的 「C」、位於 PHM14506-7 的 「T」、位於 PHM1934-37 的 「C」、位於 PHM8711-17 的 「C」、位於 PHM1754-20 的 「C」、位於 PHM3951-25 的 「T」、位於 PHM6929-3 的 「C」、位於 PHM10054-14 的 「A」、位於 PHM10721-9 的 「A」、位於 PHM10721-16 的 「A」 和位於 PHM15661-21 的 「G」。單倍型也可由下列構成i.位於 PHM6929-3 的 「C」、位於 PHM8211-16 的 「T」 和位於 PHM14506-7 的 「T」 ；ii.位於 PHM10054-14 的 「A」 和位於 PHM10721-9 的 「A」 ；以及iii.位於 PHM10054-14 的「A」、位於 PHM8211-16 的「T」和位於 PHM10721-9 的「A」。
用該方法鑑定的玉米植物也是受關注的。在另一個實施方案中，提供了選擇具有增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的植株的方法。 在一個方面，獲取具有標記基因座的至少一個等位基因的第一玉米植物，其中所述等位基因與增強的抗性相關聯。標記基因座可存在於1號染色體上的區間，所述區間包含並側接i. PHM6929 和 PHM1934，或ii. PHM6929 和 PHM14506。然後可將第一玉米植物與第二玉米植物雜交，並且可評估雜交所得子代植物的第一玉米植物的等位基因。可選擇具有第一玉米植物的等位基因的子代植物作為具有增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的植株。用該方法選擇的子代植物也是受關注的。在另一個實施方案中，提供了選擇具有增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的玉米植物的方法。在一個方面，獲取具有如下等位基因的第一玉米植物位於ΡΗΜ6 ^9-3的「C」、位於 ΡΗΜ8211-16 的「Τ」 和位於 ΡΗΜ14506-7 的「Τ」;位於 ΡΗΜ10054-14 的「Α」 和位於 ΡΗΜ10721-9的「A」;或位於 PHM10054-14 的「A」、位於 PHM8211-16 的「T」 和位於 PHM10721-9 的「A」。可將第一玉米植物與第二玉米植物雜交，並且可評估雜交所得子代植物的所述等位基因。可選擇具有所述等位基因的子代植物作為具有增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的植株。用該方法選擇的子代植物也是受關注的。在另一個實施方案中，提供了通過檢測玉米植物基因組中的標記基因座來鑑定具有增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的玉米植物的方法，所述檢測使用標記基因座的序列、標記基因座的部分序列、或標記基因座的互補序列、或其部分序列作為標記探針。標記探針在嚴格條件下與介於以下序列之間並包括以下序列的連續的DNA雜交SEQ ID NO :48或基於 Clustal V比對方法與SEQ ID NO 48具有95%同一性的核苷酸序列、以及SEQ ID NO 55 或基於Clustal V比對方法與SEQ ID NO :55具有95%同一性的核苷酸序列，並且標記基因座包含至少一個與增強的鐮孢屬穗黴菌抗性相關聯的等位基因。用該方法鑑定的玉米植物也是受關注的。在另一個實施方案中，提供了通過檢測玉米植物種質中至少一個與增強的抗性相關聯的標記等位基因來鑑定具有增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的玉米植物的方法。標記基因座可選自任何下列的標記基因座PHM和SSR標記PHM4423、bnlgl732、PHM9362、 PHI445613、PHM1147、PHM11850、PHM9301、umcl762、PHM5280、PHM13773 和 PHM16422 ；和 SNP 標記 PHM9362-8-U、PHM1147-16-U、PHM11850-3-U、PHM11850-6-U、PHM13773-6-U、 PHM13773-11-U、PHM16422-11_U、PHMl 147-19-U、PHM5280-41-U、PHM9301-37-U 禾P PHM4423-4-U,以及與這些標記連鎖的任何其他標記。標記基因座可存在於6號染色體上的區間，所述區間包含並側接PHM4423和PHM16422。標記基因座包含至少一個與增強的鐮孢屬穗黴菌抗性相關聯的等位基因。用該方法鑑定的玉米植物也是受關注的。在另一個實施方案中，提供了通過檢測玉米植物種質中的單倍型來鑑定具有增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的玉米植物的方法。單倍型在一個或多個標記基因座包含等位基因， 其中一個或多個標記基因座存在於6號染色體上的區間，所述區間包含並側接PHM4423和 PHM16422。單倍型與增強的鐮孢屬穗黴菌抗性相關聯，並且可包含至少一個下列等位基因 位於 PHM9362-8 的 「G」、位於 PHM1147-16 的「G」、位於 PHMl 1850-3 的「T」、位於 PHMl 1850-6 的 「C」、位於 PHM13773-6 的 「A」、位於 PHM13773-11 的 「C」、位於 PHM16422-11 的 「A」、位於 PHMl 147-19 的 「T」、位於 PHM5280-41 的 「G」、位於 PHM9301-37 的 「T」 和位於 PHM4423-4 的 「T」。單倍型也可由下列構成i.位於 PHM4423-4 的 「T」、位於 PHMl 1850-3 的 「T」 和位於 PHM13773-6 的 「A」;或ii.位於PHM9362-8的「G」和位於PHM13773-6的「A」。用該方法鑑定的玉米植物
也是受關注的。在另一個實施方案中，提供了選擇具有增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的玉米植物的方法。在一個方面，獲取具有標記基因座的至少一個等位基因的第一玉米植物，其中所述等位基因與增強的抗性相關聯。標記基因座可存在於染色體區間，所述染色體區間包含並側接 PHM4423和PHM16422。可將第一玉米植物與第二玉米植物雜交，並且可評估雜交所得子代植物的第一玉米植物的等位基因。可選擇具有第一玉米植物的等位基因的子代植物作為具有增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的植株。用該方法選擇的子代植物也是受關注的。在另一個實施方案中，提供了選擇具有增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的玉米植物的方法。在一個方面，獲取具有如下等位基因的第一玉米植物位於PHM4423-4的「T」、位於 PHMl 1850-3 的「T」 和位於 PHM13773-6 的「A」 或位於 PHM9362-8 的「G」 和位於 PHM13773-6 的「A」。可將第一玉米植物與第二玉米植物雜交，並且可評估雜交所得子代植物的所述等位基因。可選擇具有所述等位基因的子代植物作為具有增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的植株。用該方法選擇的子代植物也是受關注的。在另一個實施方案中，提供了通過檢測玉米植物種質中兩個單獨的標記基因座 (在本文中稱為標記基因座1和標記基因座幻的等位基因來鑑定具有增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的玉米植物的方法。標記基因座1位於1號染色體上的區間，所述區間包含並側接i. PHM6929 和 PHM1934，或ii. PHM6929 和 PHM14506 ；並且標記基因座2位於6號染色體上的區間，所述區間包含並側接PHM4423和 PHM16422。每個標記基因座包含至少一個與增強的鐮孢屬穗黴菌抗性相關聯的等位基因。 用該方法鑑定的玉米植物也是受關注的。在另一個實施方案中，提供了通過檢測玉米植物種質中的單倍型1和單倍型2來鑑定具有增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的玉米植物的方法。單倍型1和單倍型2在一個或多個標記基因座都包含等位基因。就單倍型1而言，標記基因座位於1號染色體上的區間，所述區間包含並側接 i. PHM6929 和 PHM1934，或ii. PHM6929 和 PHM14506 ；並且就單倍型2而言，標記基因座位於6號染色體上的區間，所述區間包含並側接 PHM4423和PHM16422。兩個單倍型都與增強的鐮孢屬穗黴菌抗性相關聯。單倍型1可包含i.位於 PHM6929-3 的 「C」、位於 PHM8211-16 的 「T」 和位於 PHM14506-7 的 「T，，，ii.位於 PHM10054-14 的 「A」 和位於 PHM10721-9 的 「A」 ；或iii.位於 PHM10054-14 的「A」、位於 PHM8211-16 的"T」和位於 PHM10721-9 的「A」;並且單倍型2可包含i.位於 PHM4423-4 的 「T」、位於 PHMl 1850-3 的 「T」 和位於 PHM13773-6 的 「A」;或ii.位於PHM9362-8的「G」和位於PHM13773-6的「A」。用該方法鑑定的玉米植物
也是受關注的。在另一個實施方案中，提供了選擇具有增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的玉米植物的方法。在一個方面，獲取具有第一標記基因座的至少一個等位基因和第二標記基因座的至少一個等位基因的第一玉米植物。第一標記基因座位於1號染色體上的區間，所述區間包含並側接 i. PHM6929 和 PHM1934，或ii. PHM6929 和 PHM14506，並且第二標記基因座位於6號染色體上的區間，所述區間包含並側接PHM4423和 PHM16422。第一標記基因座的至少一個等位基因和第二標記基因座的至少一個等位基因與增強的鐮孢屬穗黴菌抗性相關聯。可將第一玉米植物與第二玉米植物雜交，並且可評估雜交所得子代植物的第一玉米植物的等位基因。可選擇具有第一玉米植物的等位基因的子代植物作為具有增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的植株。用該方法選擇的子代植物也是受關注的。在另一個實施方案中，提供了選擇具有增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的玉米植物的方法。在一個方面，獲取在1號染色體QTL具有與增強的鐮孢屬穗黴菌抗性相關聯的單倍型並且在6號染色體QTL具有與增強的鐮孢屬穗黴菌抗性相關聯的單倍型的第一玉米植物。可將第一玉米植物與第二玉米植物雜交，並且可評估雜交所得子代植物的所述等位基因。可選擇具有所述等位基因的子代植物作為具有增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的植株。用該方法選擇的子代植物也是受關注的。附圖以及序列表的說明根據以下的詳細描述和附圖以及序列表，可更全面地理解本發明，以下的詳細描述和附圖以及序列表構成本專利申請的一部分。此序列表中以單個字母表示核苷酸，以三字母表示胺基酸，如 Nucleic Acids Research 13 :3021-3030 (1985)和 Biochemical Journal 219 (No. 2) :345-373(1984)所描述的IUPAC-IUBMB標準中所規定，它們以引用方式全文併入本文。用於核苷酸和胺基酸序列數據的符號和格式遵循在37C. F. R. § 1. 822中所列出的規定。圖IA至C示出了 1號染色體上已測序BAC的物理圖譜排列(得自網際網路上公開可用的 Maize Genome Browser ；http://www. maizesequence. org)，這些 BAC 裝配至丨J 由 PHM6929 (SEQ ID NO 41) ^P PHM1934(SEQ ID NO :47)限定並且包括它們的區域。圖中指示了本文所述PHM和SSR標記的位置；指示了 PHM參考序列的SEQ ID N0。圖2A和2B示出了 6號染色體上已測序的BAC的物理圖譜排列(得自網際網路上公開可用的 Maize Genome Browser ；http://www. maizesequence. org),這些 BAC 裝配成由 PHM4423 (SEQ ID NO :48)和PHM16422 (SEQ ID NO :55)限定並且包括它們的區域。圖中指示了本文所述PHM和SSR標記的位置；指示了 PHM參考序列的SEQ ID N0。圖3示出了高抗性品系PHG61和敏感品系1047之間的比較。圖4示出了用作鐮孢屬穗黴菌感染評分指南的FUSERS標度。圖5A和5B示出了在包含鐮孢屬穗黴菌QTLl的基因組區間中進行單個植株的單倍型分型時，設計用於hvader Plus 反應的寡核苷酸和探針的SEQ ID N0。圖6A和6B示出了在包含鐮孢屬穗黴菌QTL6的基因組區間中進行單個植株的單倍型分型時，設計用於hvader Plus 反應的寡核苷酸和探針的SEQ ID N0。圖7A、7B和7C示出了分別在包含鐮孢屬穗黴菌QTL5、QTL7和QTL8的基因組區間中進行單個植株的單倍型分型時，設計用於Evader Plus 反應的寡核苷酸和探針的SEQ ID N0。圖8示出了 PHCA5轉化數據。圖9示出了 PH5IH轉化數據。


圖10示出了 PH70R轉化數據。
圖11示出了 PH87H轉化數據。
圖12示出了 PHFCJ轉化數據。
圖13示出了 PH890轉化數據。
圖14示出了 PHBlV轉化數據。
圖15示出了在雜交中使用轉化品系作為親本與使用非轉化品系作為親本的表型結果。
圖16示出了 1號染色體上的標記基因座和非剛性莖杆亞群中鍵之間的關聯。
SEQIDNO1和SEQ ID NO 2是AFLP標記177的引物。
SEQIDNO3和SEQ ID NO 4是AFLP標記T292的引物。
SEQIDNO5和SEQ ID NO 6是AFLP標記D166的引物。
SEQIDNO7和SEQ ID NO :8是AFLP標記Cl 16的引物。
SEQIDNO9 和 SEQ ID NO :10 是 SSR 標記 bnlgl953 的引物。
SEQIDNO11和 SEQ ID NO :12 是 SSR 標記 LGI112958 的引物。
SEQIDNO13和 SEQ ID NO 14 是 SSR 標記 PHI445613 的引物。
SEQIDNO15和 SEQ ID NO 16 是 SSR 標記 PHI364545 的引物。
SEQIDNO17和 SEQ ID NO :18 是 SSR 標記 bnlgl732 的引物。
SEQIDNO19和SEQ ID NO 20是SSR標記umcl762的引物。
SEQIDNO21和 SEQ ID NO 22 是 SSR 標記 bnlgl007 的引物。
SEQIDNO23和 SEQ ID NO 24 是 SSR bnlgl083 的引物。
SEQIDNO25和 SEQ ID NO 26 是 SSR 標記 PHI256546 的引物。
SEQIDNO27和 SEQ ID NO 28 是 SSR bnlgll74 的引物。
SEQIDNO29和 SEQ ID NO 30 是 SSR umcl805 的引物。
SEQIDNO31和 SEQ ID NO 32 是 SSR umcl462 的引物。
SEQIDNO33是PHM8211正向外引物的序列。
SEQIDNO34是PHM8211正向內引物的序列。
SEQIDNO35是PHM8211反向內引物的序列。
SEQIDNO36是PHM8211反向外引物的序列。
SEQIDNO37是PHM1934正向外引物的序列。
SEQIDNO38是PHM1934正向內引物的序列。
SEQIDNO39是PHM1934反向內引物的序列。
SEQIDNO40是PHM1934反向外引物的序列。
SEQIDNO41是PHM6929的參考序列。
SEQIDNO42是PHM8711的參考序列。
SEQIDNO43是PHM8211的參考序列。
SEQIDNO44是PHM14506的參考序列。
SEQIDNO45是PHM17M的參考序列。
SEQIDNO46是PHM3951的參考序列。
SEQIDNO47是PHM1934的參考序列。
SEQIDNO48是PHM4423的參考序列。
SEQIDNO49是PHM9362的參考序列。
SEQIDNO50是PHMl 147的參考序列。
SEQIDNO51是PHMl 1850的參考序列。
SEQIDNO52是PHM9301的參考序列。
SEQIDNO53是PHM5280的參考序列。
SEQIDNO54是PHM13773的參考序列。
SEQIDNO55是PHM16422的參考序列。
SEQIDNO56是PHM9009的參考序列。
SEQIDNO57是PHM3171的參考序列。
SEQIDNO58是PHM3860的參考序列。
SEQIDNO59是PHM7942的參考序列。
SEQIDNO60是PHM678的參考序列。
SEQIDNO61是PHM8358的參考序列。
SEQIDNO62是PHM16415的參考序列。
SEQIDNO63是PHM737的參考序列。
SEQIDNO64是PHM9092的參考序列。
SEQIDNO65是PHM6929-3-U正向引物的序列。
SEQIDNO66是PHM69^-3-U反向引物的序列。
SEQIDNO67是PHM69^-3-U探針1的序列。
SEQIDNO68是PHM69^-3-U探針2的序列。
SEQIDNO69是PHM8711-14-U正向引物的序列。
SEQIDNO70是PHM8711-14-U反向引物的序列。
SEQIDNO71是PHM8711-14-U探針1的序列。
SEQIDNO72是PHM8711-14-U探針2的序列。
SEQIDNO73是PHM8211-16-1正向引物的序列。
SEQIDNO74是PHM8211-16-1反向引物的序列。
SEQIDNO75是PHM8211-16-1探針1的序列。
SEQIDNO76是PHM8211-16-I探針2的序列。
SEQIDNO77是PHM14506-7-U正向引物的序列。
SEQIDNO78是PHM14506-7-U反向引物的序列。
SEQIDNO79是PHM14506-7-U探針1的序列。
SEQIDNO80是PHM14506-7-U探針2的序列。
SEQIDNO81是PHM17M-20-U正向引物的序列。
SEQIDNO82是PHM1754-20-U反向引物的序列。
SEQIDNO83是PHM1754-20-U探針1的序列。
SEQIDNO84是PHM1754-20-U探針2的序列。
SEQIDNO85是PHM3951-25-U正向引物的序列。
SEQIDNO86是PHM3951-25-U反向引物的序列。
SEQIDNO87是PHM3951-25-U探針1的序列。
SEQIDNO88是PHM3951-25-U探針2的序列。
SEQIDNO89是PHM19;34-37-U正向引物的序列。
SEQIDNO90是PHM1934-37-U反向引物的序列。
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PHM13773-11-U探針1的序列。 PHM13773-11-U探針2的序列。 PHM16422-11-U正向引物的序列。 PHM16422-11-U反向引物的序列。 PHM16422-11-U探針1的序列。 PHM16422-11-U探針2的序列。 PHM9009-13-U正向引物的序列。 PHM9009-13-U反向引物的序列。 PHM9009-13-U探針1的序列。 PHM9009-13-U探針2的序列。 PHM3171-5-U正向引物的序列。 PHM3171-5-U反向引物的序列。 PHM3171-5-U探針1的序列。 PHM3171-5-U探針2的序列。 PHM3860-43-U正向引物的序列。 PHM3860-43-U反向引物的序列。 PHM3860-43-U探針1的序列。 PHM3860-43-U探針2的序列。 PHM7942-12-U正向引物的序列。 PHM7942-12-U反向引物的序列。 PHM7942-12-U探針1的序列。 PHM7942-12-U探針2的序列。 PHM678-22-U正向引物的序列。 PHM678-22-U反向引物的序列。 PHM678-22-U探針1的序列。 PHM678-22-U探針2的序列。 PHM8358-17-U正向引物的序列。 PHM8358-17-U反向引物的序列。 PHM8358-17-U探針1的序列。 PHM8358-17-U探針2的序列。 PHM16415-8-U正向引物的序列。 PHM16415-8-U反向引物的序列。 PHM16415-8-U探針1的序列。 PHM16415-8-U探針2的序列。 PHM737-215-U正向引物的序列。 PHM737-215-U反向引物的序列。 PHM737-215-U探針1的序列。 PHM737-215-U探針2的序列。 PHM9092-11-U正向引物的序列。
SEQIDNO170是PHM9092-11-U反向引物的序列。
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SEQIDNO173是PHM10054的參考序列。
SEQIDNO174是PHM10721的參考序列。
SEQIDNO175是PHM15661的參考序列。
SEQIDNO176是PHM12872的參考序列。
SEQIDNO177是PHM8711-17-U正向引物的序列。
SEQIDNO178是PHM8711-17-U反向引物的序列。
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SEQIDNO182是PHM10054-14-U反向引物的序列。
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SEQIDNO189是PHM10721-16-U正向引物的序列。
SEQIDNO190是PHM10721-16-U反向引物的序列。
SEQIDNO191是PHM10721-16-U探針1的序列。
SEQIDNO192是PHM10721-16-U探針2的序列。
SEQIDNO193是PHM15661-21-U正向引物的序列。
SEQIDNO194是PHM15661-21-U反向引物的序列。
SEQIDNO195是PHM15661-21-U探針1的序列。
SEQIDNO196是PHM 15661-21-U探針2的序列。
發明詳沭
本發明提供了玉米中的等位基因組合物以及鑑定和
菌抗性的玉米植物的方法。提供以下定義以利於理解本發明。術語「等位基因」指在特定基因座處存在的兩個或更多個不同核苷酸序列的其中一個。「等位基因頻率」指等位基因存在於個體、品系、或一組品系中的基因座上的頻率 (比例或百分比)。例如，就等位基因「A」而言，基因型「AA」、「Aa」、或「aa」的二倍體個體分別具有1. 0,0. 5、或0. 0的等位基因頻率。人們能夠通過平均化來自品系的個體樣品的等位基因頻率來估計該品系中的等位基因頻率。同樣地，人們能夠通過平均化構成種群的品系的等位基因頻率來計算該種群品系中的等位基因頻率。就一組限定數目的個體或品系而言，可將所有等位基因頻率表示為包含等位基因的個體或品系(或任何其他指定組)的計數。
「擴增子」是被擴增的核酸，例如使用任何可用的擴增方法(例如PCR、LCR、轉錄等)通過擴增模板核酸製備的核酸。在核酸擴增的情況下術語「擴增」是其中產生附加拷貝的選擇核酸(或其轉錄形式)的任何過程。一般的擴增方法包括基於多種聚合酶的複製方法，包括聚合酶鏈反應 (PCR)、連接酶介導的方法如連接酶鏈反應(LCR)、以及基於RNA聚合酶的擴增(例如通過轉錄)方法。術語「裝配」應用於BAC以及它們聚集以形成連續的DNA片段的傾向。BAC基於序列比對「裝配」成重疊群(如果BAC進行測序)，或者經由它的BAC指紋與其他BAC指紋的比對「裝配」成重疊群。可使用網際網路上公開可用的Maize Genome Browser找到所述裝配。當等位基因與性狀關聯時，以及當存在的等位基因是期望的性狀或性狀形式將發生在包含等位基因的植物中的指示時，等位基因與性狀「關聯」。「BAC」或細菌人工染色體是來源於大腸桿菌(Escherichia coli)天然存在的F因子的克隆載體。BAC能夠接受DNA序列的較大插入序列。在玉米中，已經將許多BAC或細菌人工染色體裝配成重疊群(重疊的連續的基因片段，或「連續的DNA」)，它們每個包含玉米基因組DNA的較大插入序列。「回交」指其中雜交子代反覆與其中一個親本回交的過程。在一個回交方案中，「供體」親本指具有將被滲入的期望基因或基因座的親本植物。「受體」親本(使用一次或多次) 或「輪迴」親本(使用兩次或多次)指將基因或基因座滲入其中的親本植物。例如，參見 Ragot,M. ^A (1995)Marker-assisted backcrossing -.a practical example,Techniques et Utilisations des Marqueurs Moleculaires Les Colloques,第 72 卷，第 45-56 頁，禾口 Openshaw^Α (1994)Marker-assisted Selection in Backcross Breeding,Analysis of Molecular Marker Data，第41-43頁。初始雜交產生Fl代；於是術語「BC1 」是指輪迴親本的第二次使用，「BC2」是指輪迴親本的第三次使用，以此類推。釐摩(「cM」)是重組頻率的量度單位。一 cM等於經過單代雜交在一個基因座上的標記將與在第二基因座上的標記分離的的概率。如本文所用，術語「染色體區間」指位於植物單個染色體上的基因組DNA的連續的線性區域。位於單染色體區間上的遺傳因子或基因是物理上連鎖的。不特別限定染色體區間的大小。在一些方面，位於單個染色體區間內的遺傳因子在遺傳上連鎖，遺傳重組距離通常為例如小於或等於20cM，或者小於或等於10cM。即，位於單個染色體區間內的兩個遺傳因子以小於或等於20%或10%的頻率進行重組。「染色體」也可稱為「連鎖群」。在本專利申請中，短語「緊密連鎖」指兩個連鎖基因座間重組的發生頻率為等於或小於約10% (即在基因圖譜上的分離距離不超過IOcM)。換句話說，緊密連鎖的基因座至少90%的情況下共分離。當標記基因座顯示與期望性狀(例如病原體抗性)共分離(連鎖)的顯著概率時，它們在本發明中尤其有用。緊密連鎖的基因座如標記基因座和第二基因座可顯示10 %或更低，優選約9 %或更低，更優選約8 %或更低，更優選約7 %或更低，更優選約6 %或更低，更優選約5 %或更低，更優選約4 %或更低，更優選約3 %或更低，更優選約2%或更低的基因座內重組頻率。在高度優選的實施方案中，關聯基因座顯示約或更低的重組頻率，例如約0. 75%或更低，更優選約0. 5%或更低，更優選約0. 25%或更低的重組頻率。位於相同染色體上，並且它們間的距離使得兩個基因座間的重組發生頻率小於 10% (例如約 9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0. 75%,0. 5%,0. 25%、或更低)的兩個基因座也稱為彼此「鄰近」。在某些情況下，兩個不同標記能夠具有相同的基因圖譜坐標。在那種情況下，兩個標記彼此足夠接近使得它們之間的重組發生頻率低至無法檢測。術語「互補序列」指與給定核苷酸序列互補的核苷酸序列，即所述序列通過鹼基配對原則連鎖。術語「連續的DNA」指重疊的連續的基因片段。當涉及兩個遺傳因子間的關係時，例如有助於抗性的遺傳因子和鄰近的標記，「相弓丨」相連鎖指示下述狀態其中在抗性基因座上的「有利」等位基因與相應連鎖的標記基因座的「有利」等位基因物理上關聯在相同染色體鏈上。在相引相中，兩個有利等位基因被繼承了該染色體鏈的子代一起繼承。術語「雜交的」或「雜交」指經由授粉產生子代(例如細胞、種子或植物)的配子融合。該術語包括有性雜交(一株植物被另一株植物授粉)和自交(自花授粉，例如當花粉和胚珠來自相同植物時)。術語「雜交」指經由授粉產生子代的配子融合行為。本文稱為「二倍體」的植物具有兩組染色體(基因組)。「病害抗性」是植物的一種特徵，其中該植物避免了由植物-病原體相互作用造成的病害症狀，所述植物-病原體相互作用例如玉米和鐮孢屬輪枝鐮孢菌、層出鐮孢菌和/或膠孢鐮孢菌之間的相互作用。即，防止了病原體導致植物病害和相關的病害症狀，或者，病原體導致的病害症狀被最小化或減弱了。本領域的技術人員將會知道，本文所公開的組合物和方法可與本領域中可用的其他組合物和方法一起被用於保護植物免受病原體攻擊。本文稱為「雙單倍體」的植物通過倍增單倍體染色體組進行生長。認為雙單倍體植物是純合植物。「優良品系」或「優良品種」是由育種以及優異農學特性正選擇產生的任何品系。「增強的抗性」是指對特定病原體、廣譜病原體、或病原體引起的感染具有增強的抗性水平。對真菌病原體輪枝鐮孢菌(Fv)、層出鐮孢菌(Fp)和膠孢鐮孢菌(Fs)的抗性水平增加，例如造成了「增強」的或提高的真菌抗性。本發明的實施方案將增強或提高植物病原真菌抗性，使得植物對一種或多種真菌病原體的抗性增加，繼而增加了對真菌病原體引起的病害的抗性。術語「增強」是指提高、增加、擴大、倍增、提升、上升等。在本文中，本發明的植物描述為由於在本發明基因座存在特異性等位基因而具有對鐮孢屬輪枝鐮孢菌、層出鐮孢菌和膠孢鐮孢菌和/或由這些病原體引起的穗黴菌的「增強的抗性」。「外來玉米品種」或「外來玉米種質」是來源於不屬於可利用優良玉米品系或品種的種質的玉米的品種或種質。在雜交發生在兩個玉米植物或品種的種質之間的情況下，外來種質的子代不與它雜交的優良種質密切相關。最常見的是外來種質不來源於任何已知的玉米優良品系，而是選擇將新遺傳因子(通常新等位基因)導入育種程序。輪枝鐮孢菌、層出鐮孢菌和膠孢鐮孢菌是玉米中引起鐮孢屬穗黴菌(或穗腐病) 的真菌病原體。真菌病原體本文還總稱為鐮孢屬。「有利等位基因」是在特定基因座上賦予或有助於農學上所期望的表型，例如增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的等位基因。標記的有利等位基因是與有利表型共分離的標記等位基因。「片段」旨在表示核苷酸序列的一部分。使用本文所公開的方法，片段可用作雜交探針或PCR引物。如本文所用，「真菌抗性」是指與野生型植物的對應性質相比，對真菌病原體增強的抗性或耐受性。效果可以從對真菌病原體的影響的耐受性的略微增加(例如部分抑制)， 直至使得植物不受真菌病原體存在的影響這樣的完全抗性。「鐮孢屬穗黴菌」有時稱為鐮孢屬穗腐病，是由藤倉赤黴菌複合種，即輪枝鐮孢菌、 層出鐮孢菌和/或膠孢鐮孢菌引起的病害。「基因圖譜」是對給定物種中一個或多個染色體上的基因座間的基因連鎖關係的描述，一般以圖表或表格形式描述。對於每個基因圖譜，基因座之間的距離通過它們之間的重組頻率量度，並且基因座之間的重組可使用多種分子遺傳標記(也稱分子標記)檢測。基因圖譜是作圖的種群、使用的標記的類型、以及不同種群間各個標記的多態性潛力的產物。 一個基因圖譜與另一個基因圖譜在基因座之間的順序和遺傳距離可能不同。例如，在內源基因圖譜上(本文也將Pioneer Hi-Bred稱為「PHB」)的IOcM大概等同於在IBM2 2005 neighbors框圖譜(在玉米⑶B上可用的高解析度圖譜)上的25_30cM。然而，使用常見標記的通用框能夠將一個圖譜與另一個圖譜的信息關聯。本領域的普通技術人員可使用常見標記的框架來鑑定在各個個體基因圖譜上的標記位置和受關注的其他基因座。「基因圖譜位置」是在相同連鎖群上，相對於圍繞的遺傳標記在基因圖譜上的位置，其中能夠在給定種群中發現指定標記。「基因作圖」是限定基因座的連鎖關係的方法，該方法通過使用遺傳標記、標記的種群分離、以及重組頻率的標準遺傳原則進行。「遺傳標記」是種群中的多態核酸，並且其中可通過一種或多種分析方法檢測並區分出它們的等位基因，例如RFLP、AFLP、同功酶、SNP、SSR等。該術語也指與基因組序列互補的核酸序列，如用作探針的核酸。對應於種群成員之間的遺傳多態性的標記能夠通過本領域已建立的方法進行檢測。這些方法包括例如基於PCR的序列特異性擴增方法、限制性片段長度多態性檢測(RFLP)、同功酶標記檢測、通過等位基因特異性雜交(ASH)進行的多核苷酸多態性檢測、植物基因組的擴增可變序列檢測、自主序列複製檢測、簡單重複序列檢測(SSR)、單核苷酸多態性檢測(SNP)、或擴增片段長度多態性檢測(AFLP)。已經建立的方法也已知用於檢測表達序列標籤(EST)和來源於EST序列的SSR標記以及隨機擴增的多態性 DNA(RAPD)。「遺傳重組頻率」是兩個基因座之間的交換事件(重組)的頻率。在標記和/或減數分裂後性狀的分離後可觀察到重組頻率。「基因組」指總DNA或整套基因，由染色體或染色體組攜帶。術語「基因型」是個體(或個體組)在一個或多個基因座上的基因組成，它與可觀察到的性狀(表型)形成對照。基因型由一個或多個已知基因座的等位基因限定，個體已經從其親本中繼承了所述基因座。術語基因型可被用於指個體在單個基因座上的基因組成，在多個基因座上的基因組成，或者更一般的，術語基因型可被用於指個體在其基因組中的所有基因的基因組成。「種質」指個體(例如一個植株)、一組個體(例如一個植物品系、品種或家族)、或
1來源於一個品系、品種、物種、或培養物的克隆的或從其中得到的遺傳物質。種質可為生物或細胞的部分，或者可從生物或細胞中分離得到。種質通常提供遺傳物質與特異性分子構成，該分子構成提供生物或細胞培養物的一些或全部遺傳性狀的物理基礎。如本文所用，種質包括可從中生長出新植物的細胞、種子或組織，或者植物部分如葉、莖、花粉、或細胞，它們能夠被培養成整個植株。稱為「單倍體」的植物具有一組染色體(基因組)。「單倍型」是單個染色體上的多個基因座的基因型，即等位基因組合。單倍型描述的基因座通常是物理上和遺傳上連鎖的，即在相同染色體片段上。術語「單倍型」可指在特定基因座的多態性，如單標記基因座，或者在沿染色體片段的多個基因座上的多態性。術語「異質」用於指明一組內的個體在一個或多個特定基因座上基因型不同。「雜種優勢群」包含一組基因型，它們當與來自不同雜種優勢群的基因型雜交時表現良好(Hallauer 等人(1998) Corn breeding,第 463-564 頁。在 G. F. Sprague 和 J.W.Dudley (編輯)的Corn and corn improvement中)。將自交系歸類為雜種優勢群，並且將其進一步細分為雜種優勢群內的家族，所述分類基於若干個標準如家譜、基於分子標記的關聯、以及雜交體組合的性能(Smith等人(1990), Theor. Appl. Gen. 80 :833-840)。美國兩個最廣泛使用的雜種優勢群稱為「Iowa Stiff Stalk Synthetic」(BSSS)和「Lancaster」 或「Lancaster Sure Crop」 (有時稱為NSS或非剛性莖杆)。術語「雜合子」指其中不同等位基因位於同源染色體上的對應基因座的基因條件。術語「同質」指一組成員在一個或多個特定基因座上具有相同基因型。術語「純合子」指其中相同等位基因位於同源染色體上的對應基因座的基因條件。術語「雜交體」指至少兩個基因相異的親本間雜交獲得的子代。「雜交」或「核酸雜交」指互補RNA和DNA鏈配對以及互補DNA單鏈配對。術語「雜交」指核酸鏈的互補區域之間形成鹼基對。「IBM 基因圖譜」是指任何下列圖譜IBM、IBM2、IBM2neighbors、IBM2 FPC0507、 IBM2 2004 neighbors、IBM2 2005 neighbors、或 IBM2 2005 neighbors 框。IBM 基因圖譜基於B73XMol7種群，其中來自初始雜交的子代在構建重組自交系用於作圖前隨機交配產生多代。較新的版本反映了基因和BAC作圖基因座的加入以及由於包含來自其他基因圖譜的信息帶來的圖譜精細度的提高。術語「自交」指已經進行育種以獲得遺傳同質性的品系。術語「插入缺失(indel) 」指插入或缺失，其中可將一個品系相對於第二品系稱為插入，或者可將第二品系相對於第一品系稱為具有缺失。術語「滲入」指基因座的期望等位基因從一種遺傳背景傳遞到另一種遺傳背景的現象。例如在特定基因座的期望等位基因通過滲入、經由相同物種的兩個親本間的有性雜交可被傳遞到至少一個子代，其中至少一個親本在其基因組中具有期望的等位基因。作為另外一種選擇，例如等位基因的傳遞能夠通過兩個供體基因組之間的重組而發生，例如在融合原生質體中，其中至少其中一個供體原生質體在其基因組中具有期望的等位基因。期望的等位基因可為例如標記的選擇等位基因、QTL、轉基因等。在任何情況下，能夠將包含期望等位基因的子代與具有期望遺傳背景的品系反覆回交並對期望的等位基因進行正選擇以產生固定在選擇遺傳背景中的等位基因。例如，本文所述的1號染色體基因座和/或6號染色體基因座可滲入到對引起穗黴菌的鐮孢屬和/或穗黴菌本身無抗性或僅有部分抗性的輪迴親本。於是具有滲入基因或基因座的輪迴親本品系具有對引起穗黴菌的鐮孢屬和 /或穗黴菌本身的增強的抗性。當重複「基因滲入」過程兩次或更多次時，該過程常被稱為「回交」。「品系」或「品種」是一組具有相同親本的個體，它們一般是某種程度的自交體，並且一般在大多數基因座是純合的和同質的(同基因的或接近同基因的)。「亞系」指子代的自交體亞群，它們與相同祖先來源的其他相似自交體亞群遺傳上不同。如本文所用，術語「連鎖」用於描述一個標記基因座與另一個標記基因座或一些其他基因座(例如鐮孢屬穗黴菌抗性基因座)關聯的程度。分子標記和表型之間的連鎖關係用「概率」或「調整概率」表示。連鎖可以用期望的限度或範圍表達。例如在一些實施方案中，當標記分離距離為小於50、40、30、25、20、或15圖譜單位(或cM)時，任何標記與任何其他標記連鎖(遺傳上和物理上)。在一些方面，限定加括號的連鎖範圍是有利的，例如介於 10和20cM之間，介於10和30cM之間，或者介於10和40cM之間。標記與第二基因座的連鎖越緊密，標記對第二基因座的指示效果越好。因此，「緊密連鎖的基因座」如標記基因座和第二基因座顯示10 %或更低，優選約9 %或更低，更優選約8 %或更低，更優選約7 %或更低，更優選約6 %或更低，更優選約5 %或更低，更優選約4 %或更低，更優選約3 %或更低， 更優選約2%或更低的基因座內重組頻率。在高度優選的實施方案中，關聯基因座顯示約
或更低的重組頻率，例如約0. 75%或更低，更優選約0. 5%或更低，更優選約0. 25%或更低的重組頻率。位於相同染色體上，並且它們間的距離使得兩個基因座間的重組發生頻率小於 10% (例如約 9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0· 75%,0. 5%,0. 25%、或更低)的兩個基因座也稱為彼此「鄰近」。因為一 cM是顯示出的重組頻率的兩個標記之間的距離，任何標記與接近的任何其他標記緊密連鎖(遺傳上和物理上)，例如等於或小於IOcM的距離。在相同染色體上的兩個緊密連鎖的標記可被彼此定位於9、8、7、6、5、4、3、 2、1、0. 75,0. 5 或 0. 25cM 或更小。術語「連鎖不平衡」指基因座或性狀(或者兩者都有)非隨機地分離。在任一情況下，連鎖不平衡意味著相關的基因座沿著一段染色體在物理上足夠接近，以便它們以大於隨機(即非隨機)的頻率一起分離(在共分離性狀的情況下，產生該性狀的基因座彼此足夠接近)。顯示連鎖不平衡的標記被認為是連鎖的。連鎖基因座在超過50%的情況下共分離，例如約51%至約100%的情況。換句話說，共分離的兩個標記具有小於50% (並且根據定義，在相同染色體上分離距離小於50cM)的重組頻率。如本文所用，連鎖可存在於兩個標記或者標記和表型之間。標記基因座可與性狀，例如鐮孢屬穗黴菌抗性相「關聯」(連鎖)。測量分子標記與表型性狀的連鎖程度，例如分子標記與表型共分離的統計學概率。連鎖不平衡最常見地用量度r2測量，它通過Hill，W.G.和Robertson，A, Theor. App 1. Genet. 38 =226-231 (1968)所述的公式計算。當r2 = 1時，兩個標記基因座間存在完全的LD，意味著標記還未進行重組分離並且具有相同的等位基因頻率。r2值大於1/3指示足夠強的 LD 將被用於作圖(Ardlie 等人，Nature Reviews Genetics 3 :299-309 (2002)) 因此，當成對標記基因座間的r2值大於或等於0. 33、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、或1. 0時， 等位基因處於連鎖不平衡。如本文所用，「連鎖平衡」描述其中兩個標記獨立地分離的情況，即，在子代中隨機分離。認為顯示連鎖平衡的標記不連鎖(無論它們是否位於相同染色體上)。「基因座」是基因或標記位於染色體上的位點。「優勢對數(LOD)值」或「L0D 評分」 (Risch, Science 255 :803-804(1992))用於區間作圖以描述兩個標記基因座之間的連鎖程度。兩個標記間LOD評分為三指示連鎖概率比無連鎖的概率高1000倍，而LOD評分為二指示連鎖概率比無連鎖的概率高100倍。大於或等於二的LOD評分可用於檢測連鎖。「玉米」指玉米屬(Zea mays L. ssp. mays)植物，也稱為「玉蜀黍」。術語「玉米植物」包括整個玉米植物、玉米植物細胞、玉米植物原生質體、可從其中再生玉米植物的玉米植物細胞或玉米組織培養物、玉米植物愈傷組織和玉米植物中的完整玉米植物細胞或玉米植物部分，如玉米種子、玉米芯、玉米花、玉米子葉、玉米葉、玉米莖、 玉米芽、玉米根、玉米根尖等。「標記」是用作參考點的核苷酸序列或其編碼產物(例如蛋白)。對於用於檢測重組的標記，它們需要在被監測的種群內檢測差異、或多態性。對於分子標記，這意味著由於多核苷酸序列差異(例如SSR、RFLP、FLP、SNP)而存在DNA水平上的差異。基因組可變性可為任何一種起源，例如插入、缺失、複製、重複元件、點突變、重組事件、或轉座因子的存在和序列。分子標記可來源於基因組或表達的核酸(例如EST)，並且也可指用作探針或引物對的核酸，所述引物對能夠通過使用基於PCR的方法擴增序列片段。很多玉米分子標記是本領域已知的，並且被公布於或得自多個來源，例如Maize⑶B網際網路資源和University of Arizona Si^ W Arizona Genomics Institute罾ill。對應於種群成員之間的遺傳多態性的標記能夠通過本領域已建立的方法進行檢測。這些方法包括例如DNA測序、基於PCR的序列特異性擴增方法、限制性片段長度多態性檢測(RFLP)、同功酶標記檢測、通過等位基因特異性雜交(ASH)進行的多核苷酸多態性檢測、植物基因組的擴增可變序列檢測、自主序列複製檢測、簡單重複序列檢測(SSR)、單核苷酸多態性檢測(SNP)、或擴增片段長度多態性檢測(AFLP)。已經建立的方法也已知用於檢測表達序列標籤(EST)和來源於EST序列的SSR標記以及隨機擴增的多態性DNA(RAPD)。「標記等位基因」或者「標記基因座的等位基因」可以指種群中位於標記基因座的多個多態性核苷酸序列的其中一個，它就標記基因座而言是多態的。「標記輔助選擇」(或MAQ是一種基於標記基因型進行表型選擇的方法。「標記輔助反選擇」是一種通過它將標記基因型用於鑑定植物的方法，所述植物將不被選擇，使得它們被從育種程序或種植中去除。「標記單倍型」是指在標記基因座的等位基因的組合。「標記基因座」是物種基因組中的特定染色體位點，其中可存在特定標記。「標記基因座」可用於追蹤存在的第二連鎖基因座，例如編碼或有助於表達表型性狀的連鎖基因座。 例如標記基因座能夠用於監控等位基因在某一基因座的分離，例如QTL或單基因，它們與標記基因座在遺傳上或在物理上連鎖。「標記探針」是可用於通過核酸雜交鑑定標記基因座存在與否的核酸序列或分子， 例如與標記基因座序列互補的核酸分子探針。包含標記基因座的30個或更多連續的核苷酸(「所有或部分」標記基因座序列)的標記探針可用於核酸雜交。作為另外一種選擇，在某些方面標記探針指能夠區別(即基因型)存在於標記基因座上的特定等位基因的任何類型的探針。如上所述，當鑑定連鎖基因座時，術語「分子標記」可用於指遺傳標記，或其用作參照點的編碼產物(例如，蛋白質)。標記能夠來源於基因組核苷酸序列或來源於表達的核苷酸序列(例如來源於剪接的RNA、cDNA等)，或來源於編碼的多肽。該術語也指與標記序列互補或側接標記序列的核酸序列，如用作探針或能夠擴增標記序列的引物對的核酸。「分子標記探針」是可用於鑑定標記基因座存在與否的核酸序列或分子，例如與標記基因座序列互補的核酸探針。作為另外一種選擇，在某些方面標記探針指能夠區別(即基因型)存在於標記基因座上的特定等位基因的任何類型的探針。當核酸在溶液中特異性雜交時，例如根據Watson-Crick鹼基配對原則雜交，核酸是「互補的」。當位於插入缺失區域，例如本文所述的非共線區域時，本文所述的一些標記也稱為雜交標記。這是因為，根據定義，插入區域是關於無插入的植物的多態性。因此，標記僅需要指明插入缺失區域是否存在。任何合適的標記檢測技術都可用於鑑定此類雜交標記，例如SNP技術用於本文提供的實例。當等位基因與性狀關聯時，以及當存在的等位基因是期望的性狀或性狀形式將不發生在包含等位基因的植物中的指示時，等位基因與性狀「負」相關。「核苷酸序列」、「多核苷酸」、「核酸序列」和「核酸片段」可互換使用，並且指作為單鏈或雙鏈的RNA或DNA聚合物，任選含有合成的、非天然的或改變的核苷酸鹼基。「核苷酸」是構成DNA或RNA聚合物的單體單元，它由嘌呤或嘧啶鹼基、戊糖和磷酸基組成。核苷酸(通常以它們的5'-單磷酸形式存在)通過它們的單字母命名指代如下「A」指腺苷酸或脫氧腺苷酸(分別用於RNA或DNA)，「C」指胞苷酸或脫氧胞苷酸，「G」指鳥苷酸或脫氧鳥苷酸，「U」指尿苷酸，「T」指脫氧胸苷酸，「R」指嘌呤(A或G)，「Y」指嘧啶(C或T)，「K」指G 或T，「H」指A或C或T，「 I 」指肌苷，「N」指任何核苷酸。術語「表型」、或「表型性狀」或「性狀」是指生物的一個或多個性狀。表型可用肉眼或者本領域已知的任何其他評估手段觀察到，例如顯微鏡法、生物化學分析、或電裝置檢測分析法。在某些情況下，表型由單個基因或基因座直接控制，即「單基因性狀」。在其他情況下，表型是若干個基因的結果。命名為「PHM」後跟編號(例如PHM6929)的標記代表當用於巢式PCR時擴增特定 DNA片段的兩組引物(外部和內部)。外部的一組引物用於第一輪PCR，之後內部序列用於對第一輪PCR的產物進行第二輪PCR。這提高了反應的特異性。PHM標記(由兩組引物組成) 的退火溫度是55°C。SNP被標識並命名為「PHM」後跟標記編號、短劃線和SNP標識符編號。 高通量標記可使用任何高通量平臺，包括但不限於化￥3(16『 . (Third Wave Technologies) 平臺、hvader Plus 、或Illumina測序技術針對有用SNP多態性而開發。本文所述的高通量SNP標記被命名為PHM後跟PHM標記的編號、短劃線、SNP識別符編號、另一個短劃線、 以及指明使用的技術的字母。基因組的「物理圖譜」是顯示染色體DNA上可辨認的界標(包括基因、標記等)的線性順序的圖譜。然而與基因圖譜相比，界標間的距離是絕對的(例如在鹼基對或分離的和重疊的連續的基因片段中的測量)並且不基於基因重組。「植物」可為整個植株、其任何部分、或來源於植物的細胞或組織培養物。因此，術語「植物」可指如下任何一種整個植株、植物組分或器官(例如葉、莖、根等)、植物組織、種子、植物細胞和/或它們的子代。植物細胞是從植物中獲取的細胞或來源於從植物中所獲取細胞經培養出的細胞。當等位基因與性狀連鎖時，以及當存在的等位基因是期望的性狀的指示或性狀形式將發生在包含等位基因的植物中的指示時，等位基因與性狀「正」相關。「多態性」是DNA中的變型，它過於常見而不僅僅由突變產生。多態性在種群中必須具有至少的頻率。多態性可以是單核苷酸多態性或SNP、或插入/缺失多態性，所述插入/缺失多態性本文也稱為「插入缺失」。「概率值」或「P值」是表型的特定組合和特定標記等位基因的存在或不存在是否隨機的統計學概率。因此，概率評分越低，表型和特定標記將共分離的可能性越大。在某些方面，認為概率評分是「顯著的」或「不顯著的」。在一些實施方案中，認為隨機分離的概率評分為0.05(p = 0.05，或5%的概率)是共分離的顯著性指示。然而，可接受的概率可為小於50% (p = 0. 5)的任何概率。例如，顯著概率可小於0. 25、小於0. 20、小於0. 15、小於 0. 1、小於0. 05、小於0. 01、或小於0. 001。術語「子代」指雜交產生的後代。「子代植物」從兩個植株間的雜交生成。術語「數量性狀基因座」或「QTL」指在至少一種遺傳背景下(例如在至少一個育種種群或子代中)，具有與表型性狀的差異表達關聯的至少一個等位基因的多態基因座。QTL 能夠通過單基因機制或多基因機制發揮作用。1號染色體和6號染色體上的QTL在本文中分別稱為「QTL1」和「QTL6」。「參考序列」是用作序列比對基準的限定序列。參考序列通過基因分型在該基因座的多個品系、在序列比對程序(例如kquencher)中比對核苷酸序列、然後獲取比對的共有序列而獲得。參考序列的實例是PHM6^9參考序列。對多個品系中的PHM6^9標記進行基因分型，並且進行序列比對以獲得比對的共有序列，所述共有序列本文稱為「參考序列」。在「相斥」相連鎖中，在受關注基因座上的「有利」等位基因與在鄰近的標記基因座上的「不利」等位基因物理上連鎖，並且兩個「有利」等位基因不被一起繼承(即這兩個基因座彼此「異相」)。「頂交測試」是通過將每一親本與相同測試者(通常是純合品系)雜交而進行的子代測試。測試親本可為自由授粉的品種、雜交品系或自交系。短語「在嚴格條件下」指在該條件下探針或多核苷酸將與特定核酸序列雜交，雜交通常在核酸混合物中進行，但是基本上無其他序列。嚴格條件是序列依賴性的並將因不同的環境而異。較長序列具體地講在較高溫度下雜交。特定序列在限定離子強度、pH的情況下，嚴格條件通常選擇比熱解鏈溫度(Tm)低約5-10°C。Tm是(在限定離子強度、pH和核酸濃度的情況下)50%與靶互補的探針平衡雜交到靶序列上(因為存在的靶序列過多，在Tm 50% 的探針被平衡佔用)的溫度。嚴格條件將是如下那些條件在PH 7.0至8.3下鹽濃度低於約1. OM鈉離子，通常約0. 01至1. OM鈉離子濃度(或其他鹽)，並且對於短探針(例如10 至50個核苷酸)溫度為至少約30°C，而對於長探針(例如多於50個核苷酸)溫度為至少約60°C。嚴格條件也可以通過加入諸如甲醯胺之類的去穩定劑來實現。就選擇性雜交或特異性雜交而言，陽性信號是至少兩倍於背景，優選10倍於背景雜交。示例性的嚴格雜交條件通常是50%的甲醯胺，5x SSC，和SDS，在42°C孵育，或者切SSC，1 % SDS，在65°C孵育，並用0. h SSC以及0. SDS在65°C洗滌。就PCR而言，約36°C的溫度是典型的低嚴格擴增，而退火溫度取決於引物長度可介於約32°C和48°C之間。決定雜交參數的附加準則在多個參考文獻中提供。標記的「不利等位基因」是與不利植物表型共分離的標記等位基因，因此提供鑑定能從育種程序或栽培中移除的植物的有益效果。術語「產量」指具有商業價值的特定植物產品每單位面積的產量。例如玉米產量一般以每季每英畝種子蒲式耳數或每季每公頃種子公噸數來測量。產量同時受到遺傳和環境因素的影響。「農學」、「農學性狀」和「農學特性」是指在整個生長季節的過程中有助於產量的給定植物品種的性狀(和相關的遺傳因子)。單個農學特性包括出苗活力、營養勢、脅迫耐受性、病害抗性或耐受性、除草劑抗性、發生分枝、開花、結實率、種子大小、種子密度、 抗倒伏性、脫粒率等等。因此產量是所有農學性狀的最終結果。序列比對和同一性百分比可用設計用於檢測同源序列的多種比較方法來測定， 這些方法包括但不限於LASERGENE 生物信息計算包(DNASTAR Inc. (Madison, WI)) 的MEGALIGN 程序。除非另外說明，本文提供的序列的多重比對用Clustal V比對方法 (Higgins和Sharp, CABI0S. 5 :151-153(1989))採用默認參數(空位罰分=10，空位長度罰分=10)執行。用Clustal V方法進行成對比對和蛋白質序列的百分比同一性計算的默認參數為 KTUPLE = 1、空位罰分=3、窗口(WINDOW) = 5 和 DIAGONALS SAVED = 5。對於核酸，這些參數為KTUPLE = 2，空位罰分=5，窗口 = 4和DIAGONALS SAVED = 4。在序列比對後，使用Clustal V程序，通過參閱相同程序上的「序列距離」表可能獲得「百分比同一性」 和「趨異度」值；除非另外說明，本文提供的和申明的同一性百分比和趨異度是以該方式計笪弁。本文使用的標準重組DNA和分子克隆技術是本領域所熟知的並且在如下文獻中有更全面的描述Sambrook， J. , Fritsch, Ε. F.禾口 Maniatis， Τ. Molecular Cloning A Laboratory Manual ；Cold Spring Harbor Laboratory Press :Cold Spring Harbor, 1989 (下文稱為 「Sambrook」 )。在詳述本發明之前，應當了解本發明不受特定實施方案的限制。也應當了解本文所用的術語僅是為了描述特定實施方案，而不旨在進行限制。當在本文和所附權利要求中使用時，除非內容清楚地表明，單數和單數形式的術語包括複數指代。因此，例如術語「一個植物」也包括多個植物；取決於上下文，使用的術語「植物」也可包括該植物遺傳相似或相同的子代；使用的術語「核酸」任選地包括該核酸分子的多個拷貝；現在來看實施方案鐮孢屬穗黴菌抗件鐮孢屬穗黴菌(也稱為鐮孢屬穗腐病)是藤倉赤黴菌複合種，即輪枝鐮孢菌、層出鐮孢菌和/或膠孢鐮孢菌引起的玉米破壞性病害。與鐮孢屬穗黴菌抗性相關聯的分子標記和分子標記的等位基因的鑑定允許抗性的正選擇僅基於子代的遺傳組成。本文提供了通過基因組成評估(如使用分子標記及其等位基因評估)來鑑定和選擇具有增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的玉米植物的方法。基因作圖在很長一段時間裡，人們已經認識到與特定表型例如鐮孢屬穗黴菌抗性相關聯的特定基因座可在生物的基因組中作圖。有利的是，植物育種人員可使用分子標記通過檢測標記等位基因鑑定期望的個體，所述標記等位基因顯示與期望表型共分離的統計意義上顯著的概率，表現為連鎖不平衡。通過鑑定與受關注的性狀共分離的分子標記或分子標記簇， 植物育種人員能夠對合適的分子標記等位基因進行正選擇(該過程稱為標記輔助選擇或 MAS)從而迅速選擇期望表型。本領域熟知的多種方法可用於檢測與受關注的性狀例如鐮孢屬穗黴菌抗性共分離的分子標記或分子標記簇。這些方法的基本原理是檢測具有顯著不同平均表型的供選擇基因型(或等位基因)的標記。因此，比較標記基因座之間的供選擇基因型(或等位基因) 之間的差異大小或差異顯著性水平。推斷性狀基因位於最靠近一個或多個標記的位置，所述標記與基因型差異具有最大的關聯性。用於檢測受關注的性狀基因座的兩種此類方法是1)基於種群的關聯分析和2) 傳統的連鎖分析。在基於種群的關聯分析中，從具有多個創始者(例如優良育種品系)的已有種群中獲取品系。基於種群的關聯分析依靠連鎖不平衡(LD)的弱化和以下觀點在非結構化的種群中，在如此多代隨機交配之後，僅有控制受關注性狀的基因和與這些基因緊密連鎖的標記之間的關聯將保存下來。實際上，大多數已有種群具有種群亞結構。因此，通過把個體分配到種群中，使用得自無規分布於基因組的標記的數據，採用結構關聯方法有助於控制種群結構，從而最小化由於單個種群(也稱為亞種群)內的種群結構帶來的不平衡。表型值與在亞群中每個品系的每個標記基因座上基因型(等位基因)進行比較。顯著的標記-性狀關聯指示標記基因座和涉及該性狀表達的一個或多個基因座接近。傳統連鎖分析採用同樣的原理；然而，LD是用少量創始者構建種群而產生的。選擇創始者以最大化結構化種群內的多態性水平，並且評估多態性位點與給定表型的共分離水平。許多統計學方法已經用於鑑定顯著的標記-性狀關聯。一種此類方法是區間作圖方法(Lander 和 Botstein，Genetics 121 :185-199 (1989)，其中測試沿基因圖譜(IcM 的區間)的許多位點中的每一個位點處控制受關注性狀的基因位於該位點的概率。基因型/表型數據用於計算每個測試位點的LOD評分(概率比率的對數)。當LOD評分大於閾值時，存在控制受關注性狀的基因位點位於基因圖譜上的該位點上的顯著證據(它將位於兩個特定標記基因座之間)。本發明提供展示統計意義上的顯著的與鐮孢屬穗黴菌抗性共分離的玉米標記基因座，所述共分離如傳統連鎖分析所確定。這些基因座或附加連鎖基因座的檢測可用於標記輔助玉米育種程序，以產生具有增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的植物。標記組合物本文鑑定了與鐮孢屬穗黴菌抗性相關聯的標記。方法涉及檢測玉米植物的種質中與增強的抗性相關聯的一個或多個標記等位基因的存在。玉米植物可以是雜交體或自交體。就1號染色體上鑑定的QTL而言，標記基因座可選自圖IA至1C、表2A、或表3 中提供的任何標記基因座，包括PHM和SSR標記PHM6929、bnlgl007、PHM8711、bnlgl083、 PHM8211、PHM14506、PHM1754、PHM3951、PHM1934、PHM10054、PHM10721 禾Π ΡΗΜ15661 ；以及 SNP 標記 ΡΗΜ8211-16-1、PHM8711-14-U、PHM14506-7-U、PHM1934-37-U、PHM8711-17-U、 PHM1754-20-U、 ΡΗΜ395卜25_U、 PHM6929-3-U、 PHM10054-14-U、 ΡΗΜ1072卜9-U、
26PHM10721-16-U和PHM15661-21-U ；以及與這些標記連鎖的任何其他標記(連鎖標記可從 Maize⑶B來源測定)。就6號染色體上鑑定的QTL而言，標記基因座可選自圖2A和2B或表2B中提供的任何標記基因座，包括 PHM 和 SSR 標記 PHM4423、bnlgl732、PHM9362、PHI445613、PHMl 147、 PHM11850、PHM9301、umcl762、PHM5280、PHM13773 和 PHM16422 ；以及 SNP 標記 PHM9362-8-U、 PHM1147-16-U、 PHMl1850-3-U、 PHMl1850-6-U、 PHM13773-6-U、 PHM13773-11-U、 PHM16422-ll-U、PHM1147-19-U、PHM5280-41-U、PHM9301-37-U 和 PHM4423-4-U ；以及與這些標記連鎖的任何其他標記(連鎖標記可以從Maize⑶B來源測定)。QTL的物理圖譜位置遺傳因子或位於單個染色體上的基因組DNA的連續的線性片段上的基因是物理上連鎖的。在連鎖作圖分析中，發現PHM8211和PHM1934繪製於1號染色體上的鐮孢屬穗黴菌抗性基因座。然而，PHM6^9-3在許多品系中也與增強的抗性共分離，並且PHM6^9-3位於PHM8211-PHM1934區間的外部。因此，1號染色體QTL區間可擴大到包括任何位於包含並側接PHM6^9和PHM1934的區間之間的標記(圖IA至1C)。能與介於以下序列之間並包括它們的連續的DNA裝配的任何多核苷酸可覆蓋與鐮孢屬穗黴菌抗性性狀相關聯的標記基因座SEQ ID NO :41 (PHM6929的參考序列)或基於Clustal V比對方法與SEQ ID NO 41具有95%同一性的核苷酸序列和SEQ ID NO :47 (PHM1934的參考序列)或基於Clustal V比對方法與SEQ ID NO 47具有95%同一性的核苷酸序列。圖IA至IC示出了已測序的 BAC的物理圖譜排列，所述BAC組成介於PHM6^9和PHM1934之間並且包括它們的連續的 DNA片段。缺口(以虛線表示)不是連續的DNA片段本身的缺口，而是未測序的BAC裝配至物理圖譜的區域。在連鎖作圖分析中，發現bnlgl732和umcl762繪製於6號染色體上的鐮孢屬穗黴菌抗性基因座。然而，PHM4423-4和PHM13773-6在許多品系中也與增強的抗性共分離，並且 PHM4423-4 和 PHM13773-6 位於 bnlgl732_umcl762 區間的外部。此外，PHM16422 和 PHM13773 是緊密連鎖的。因此，6號染色體QTL區間可擴大到包括任何位於包含並側接PHM4423和 PHM16422的區間中的標記。能與介於以下序列之間並包括它們的連續的DNA裝配的任何多核苷酸可覆蓋與鐮孢屬穗黴菌抗性性狀相關聯的標記基因座SEQ ID N0:48(PHM4423的參考序列)或基於Clustal V比對方法與SEQ ID NO :48具有95%同一性的核苷酸序列和 SEQ ID NO 55 (PHM 16422的參考序列)或基於Clustal V比對方法與SEQ ID NO 55具有 95%同一性的核苷酸序列。圖2A和2B示出了已測序的BAC的物理圖譜排列，所述BAC組成介於PHM4423和PHM16422之間並且包括它們的連續的DNA片段。缺口(以虛線表示) 不是連續的DNA片段本身的缺口，而是未測序的BAC裝配至物理圖譜的區域。連鎖關係連鎖的常見量度是性狀共分離的頻率。這可以共分離百分比(重組頻率)表示， 或者以釐摩(cM)表示。cM是基因重組頻率的量度單位。一 cM等於由於在一代中的交換導致的在一個基因座上的性狀將與在另一個基因座上的性狀分離的概率為(意味著性狀99%的情況下共分離)。因為染色體距離與性狀間交換事件的頻率大約成比例，有與重組頻率關聯的近似物理距離。
標記基因座本身是性狀，並且在分離期間能夠通過跟蹤標記基因座、根據標準連鎖分析進行評估。因此，一 cM等於經過單代雜交的標記基因座將與在另一個基因座分離的
的概率。標記距離控制受關注性狀的基因越近，則標記作為期望性狀的指示越有效和有利。緊密連鎖的基因座顯示約10%或更低，優選地約9%或更低，更優選地約8%或更低， 更優選地約7 %或更低，更優選地約6 %或更低，更優選地約5 %或更低，更優選地約4 %或更低，更優選地約3%或更低，更優選地約2%或更低的基因座間交換頻率。在高度優選的實施方案中，相關基因座(例如標記基因座和靶基因座)顯示約或更低的重組頻率，例如約0. 75%或更低，更優選地約0. 5%或更低，或更優選地約0. 25%或更低的重組頻率。 因此，所述基因座分開距離為約 10cM、9cM、8cM、7cM、6cM、5cM、4cM、3cM、2cM、lcM、0. 75cM、 0.5cM或0.25cM或更低。換句話說，位於相同染色體上，並且它們間的距離使得兩個基因座間的重組發生頻率小於10% (例如約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0. 75%, 0. 5%,0. 25%、或更低)的兩個基因座稱為彼此「接近」。儘管特定標記等位基因可顯示與鐮孢屬穗黴菌抗性表型共分離，但重要的是注意到標記基因座不一定是負責表達鐮孢屬穗黴菌抗性表型。例如，不要求標記多核苷酸序列是賦予增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的基因的部分(例如是基因開放閱讀框的部分)。特定標記等位基因與增強的鐮孢屬穗黴菌抗性表型的關聯，是由於在等位基因從中起源的祖先玉米品系中，標記等位基因和等位基因之間的最初「相引」相連鎖。最後通過反覆重組，標記和基因座間的交換事件能夠改變這種取向。正是因為這個原因，有利標記等位基因可根據存在於耐受性親本中的相連鎖發生改變，所述耐受性親本用於製備分離種群。這不改變可使用標記監控表型分離的事實。它僅僅改變在給定分離種群中認為哪個標記等位基因是有利的。對於1號染色體上的QTL，圖IA至1C、表2A、或表3中列出的標記可用於推測玉米植物中鐮孢屬穗黴菌抗性性狀的狀態。這包括在PHM和SSR標記PHM6929、bnlgl007、 PHM8711、bnlgl083、PHM8211、PHM14506、PHM1754、PHM3951、PHM1934、PHM10054、PHM10721 和 PHM15661 ；以及 SNP 標記 PHM8211-16-1、PHM8711-14-U、PHM14506-7-U、PHM1934-37-U、 PHM8711-17-U, PHMl754-20-U、 PHM395卜25_U、 PHM6929-3-U、 PHM10054-14-U、 PHM10721-9-U、PHM10721-16-U 和 PHM15661-21-U 50cM 內的任何標記。對於6號染色體上的QTL，圖2A和2B或表2B中列出的標記可用於推測玉米植物中鐮孢屬穗黴菌抗性性狀的狀態。這包括在PHM和SSR標記PHM4423、bnlgl732、PHM9362、 PHI445613、PHM1147、PHM11850、PHM9301、umcl762、PHM5280、PHM13773 和 PHM16422 ；以及 SNP 標記 PHM9362-8-U、PHM1147-16-U、PHM11850-3-U、PHM11850-6-U、PHM13773-6-U、 PHM13773-11-U、PHM16422-11_U、PHMl 147-19-U、PHM5280-41-U、PHM9301-37-U 禾P PHM4423-4-U50cM內的任何標記。染餼體區間提供與鐮孢屬穗黴菌抗性關聯的染色體區間。本領域熟知的多種方法可用於鑑定染色體區間。此類染色體區間的邊界擴展到涵蓋將與控制受關注性狀的基因連鎖的標記。 換句話說，擴展染色體區間使得位於區間內的任何標記(包括限定區間邊界的末端標記) 可用作鐮孢屬穗黴菌抗性標記。每個區間包含至少一個QTL，此外甚至可包含一個以上的
28QTL0相同區間中非常接近的多個QTL可攪亂特定標記與特定QTL的關聯，因為一個標記可顯示與一個以上的QTL連鎖。相反地，例如如果非常接近的兩個標記顯示與期望表型性狀共分離，有時分不清楚是否那些標記中的每一個鑑定相同QTL或兩個不同的QTL。無論如何，完成或實施本發明不需要了解在特定區間中有多少QTL。如下所述區間示出了與鐮孢屬穗黴菌抗性共分離的標記簇。該簇標記發生在染色體上相對小的結構域內，並且指示那些染色體區域中的一個或多個QTL的存在。區間擴展到涵蓋與鐮孢屬穗黴菌抗性共分離的標記。區間被它們末端的標記限定，其中區間涵蓋在區間內作圖的標記以及限定末端的標記。通過限定區間端點的末端標記描述的區間將包括末端標記和位於該染色體結構域內的任何標記，無論這些標記目前是否已知。對於1號染色體上的QTL，區間可被如下標記限定並且包括它們a)PHM6^9和 PHM1934 ；或b) PHM6929和PHM14506。對於6號染色體上的QTL，區間可被PHM4423和 PHM16422限定並且包括它們。位於這些區間內的任何標記可用作鐮孢屬穗黴菌抗性的標記。染色體區間也可通過與QTL標記連鎖(表現出連鎖不平衡)的標記限定，r2是關聯性研究中連鎖不平衡(LD)的常見量度。如果在例如位於PHM6^9和PHM1934區間內的1號染色體標記基因座，與另一個緊鄰的1號染色體標記基因座之間的LD的r2值大於 l/3(Ardlie 等人，Nature Reviews Genetics 3 :299-309 Q002))，這兩個基因座彼此連鎖不平衡。標記等位基因和單倍型組合本發明的標記也可為一個或多個標記基因座上的等位基因的組合。如下所述的等位基因可單獨或組合用於鑑定和選擇具有增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的玉米植物。本文鑑定了在1號染色體QTL上的有利的SNP等位基因(即與增強的鐮孢屬穗黴菌抗性相關聯的)，包括位於PHM8211-16的「T」、位於PHM8711-14的「C」、位於PHM14506-7 的 「T」、位於 PHM1934-37 的 「C」、位於 PHM8711-17 的 「C」、位於 PHM1754-20 的 「C」、位於 PHM3951-25 的 「T」、位於 PHM6929-3 的 「C」、位於 PHM10054-14 的 「A」、位於 PHM10721-9 的 "A，，、位於 PHM10721-16 的 『『A」 和位於 PHM15661-21 的"G，，。本文鑑定了在6號染色體QTL上的有利的SNP等位基因(即與增強的鐮孢屬穗黴菌抗性相關聯的)，包括位於PHM9362-8的「G」、位於PHMl 147-16的「G」、位於PHMl 1850-3 的 「T」、位於 PHMl 1850-6 的 「C」、位於 PHM13773-6 的 「A」、位於 PHM13773-11 的 「C」、位於 PHM16422-11 的「A」、位於 PHM1147-19 的「T」、位於 PHM5280-41 的「G」、位於 PHM9301-37 的 「T」 和位於 PHM4423-4 的 「T，，。雖然與增強的鐮孢屬穗黴菌抗性相關聯的單倍型可包含如上所述的任何等位基因，但下列單倍型不僅與增強的鐮孢屬穗黴菌抗性相關而且可用於標記輔助選擇，以對具有增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的玉米植物進行正選擇a)位於 PHM6929-3 的 「C」、位於 PHM8211-16 的 「T」 和位於 PHM14506-7 的 「T」 ；b)位於 PHM4423-4 的 「T」、位於 PHMl 1850-3 的 「T」 和位於 PHM13773-6 的 「A」 ；c)位於 PHM10054-14 的 「A」 和位於 PHM10721-9 的 「A」 ；d)位於 PHM10054-14 的 「A」、位於 PHM8211-16 的 「T」 和位於 PHM10721-9 的 「A，，。e)位於 PHM9362-8 的 「G」 和位於 PHM13773-6 的 「A」。
技術人員將期望可能存在附加的多態性位點，所述位點位於本文鑑定的1號染色體和6號染色體標記內部的以及周圍的標記基因座上，其中一個或多個多態性位點與單倍型的一個或多個多態性位點上的等位基因連鎖不平衡(LD)。在不同多態性位點上的兩個特定等位基因據稱處於LD，如果在其中一個位點上存在等位基因，則易於推測在相同染色體上的其他位點上存在等位基因(Stevens, Mol. Diag. 4 :309-17 (1999))。技術人員將理解等位基因頻率(進而單倍型頻率)可因種質庫不同而不同。種質庫由於成熟期差異、雜種優勢群、地理分布等等而不同。因此，SNP和其他多態性可能在一些種質庫中無法提供信息。標記輔助詵擇分子標記可用於多種植物育種應用(如參見Maub等人(1996) Hortscience 31 729-741 ；Tanksley (1983)Plant Molecular Biology Reporter. 1 :3_8)。受關注的主要領域之一是使用標記輔助選擇(MAQ增加回交和基因滲入的效率。展示出與影響期望表型性狀的基因座連鎖的分子標記提供了在植物種群中選擇性狀的有用工具。當表型難以測定(例如很多病害抗性性狀)，或表型發生在植物發育的晚期(例如籽粒特徵)時，尤其如此。由於DNA標記測定比田間表型分析更省力並且佔用的物理空間更小，可測定更大的種群，增加了發現具有從供體品系移動至受體品系的靶片段的重組體的概率。連鎖越緊密，標記越有用，這是因為重組不太可能發生於標記和引起性狀的基因之間，所述重組可導致假陽性。由於需要雙重組事件，側接標記減少了假陽性選擇發生的概率。理想情況是基因本身具有標記，使得標記和基因之間的重組不能發生。此類標記稱為「完美標記」。當基因通過MAS滲入時，不僅引入了基因而且引入了側接區域(G印ts. (2002). Crop Sci ；42 :1780-1790) 0這稱為「連鎖累贅」。在供體植株與受體植株極不相關的情況下，這些側接區域攜帶可編碼農學上不良性狀的附加基因。該「連鎖累贅」也可導致產量減少或其他負面農學特性，即便與優良玉米品系回交多個周期後。這有時也稱為「產量累贅」。側接區域的大小可通過附加的回交而減小，雖然這並不總是成功的，因為育種人員不能控制該區域或重組斷點的大小(Young等人(1998) Genetics 120 :579-585)。在經典育種中，通常只是單憑偶然因素選取有助於減小供體片段大小的重組(Tanksley等人(1989). Biotechnology 7 :257-264)。即使在此類回交次數達20次後，可預期找到的仍與所選基因連鎖的供體染色體還是具有相當大的片段。然而如果使用標記的話，就可能選取那些在受關注的基因附近經歷了重組的稀有個體。在150株回交植株中，至少一株植株經歷交換有 95%的概率，所述交換在基於單次減數分裂圖距的IcM基因內進行。標記使得能夠明確鑑定這些個體。對於300株植株的一次附加回交，在基因另一側的IcM單次減數分裂圖距內有95%的交換概率，從而產生在基於單次減數分裂圖距小於2cM的靶基因附近的片段。用標記時在兩代就可實現，而不用標記時則需要平均100代(參見Tanksley等人，上文)。當基因的確切位置已知時，圍繞基因的側接標記可用於在不同的種群大小中對重組進行正選擇。例如，在更小的種群中，預期重組可進一步遠離基因，因此需要更遠端的側接標記來檢測重組。包含增強密度的公開玉米標記的玉米基因組整合連鎖圖譜的可用性促進了玉米基因作圖和MAS。參見，如IBM2 Neighbors圖譜，該圖譜可在Maize⑶B網站上在線獲取。MAS具體實施的關鍵部分為(i)限定種群，在該種群中將確定標記-性狀關聯，該種群可以是分離種群、或隨機或結構化種群；(ii)監控相對於性狀的多態性標記的分離或關聯，並且使用統計方法確定連鎖或關聯；(iii)基於統計分析的結果限定一組所期望的標記，以及(iv)將該信息用於和/或外推出當前組育種種質，使基於標記的選擇決定得以作出。本公開中描述的標記，以及其他標記類型例如SSR和FLP，可用於標記輔助選擇方案。SSR可定義為長度為6bp或更小的相對較短串聯重複DNA序列(Tautz (1989) Nucleic Acid Research 17 :6463-6471 ；Wang φ 人(1994)Theoretical and Applied Genetics, 88 :1-6) 0多態性由於重複單元數量變化而發生，可能由DNA複製過程中的滑動引起(Levinson 和 Gutman (1987)Mol Biol Evol 4:203-221)。重複長度的變化可通過在保守的非重複側接區域設計PCR引物來檢測(Weber和May (1989) Am J Hum Genet. 44 388-396)。SSR非常適於作圖和MAS，因為它們是多等位基因的、共顯性的、可再現的，並且適合高通量自動化(Rafalski 等人(1996)Generating and using DNA markers in plants。選自Non-mammaIian genomic analysis -.a practical guide,Academic press, 第 75-1 頁)。可生成各種類型的SSR標記，並且來自抗性品系的SSR特徵圖可通過擴增產物的凝膠電泳獲取。標記基因型的評分基於擴增片段的大小。由位於 Saint-Jean-sur-Richelieu, Quebec, Canada 的 DNA Landmarks 依據合同規定向公眾提供玉米的SSR服務。也可生成各種類型的FLP標記。最常見地，擴增引物用於生成片段長度多態性。 此類FLP標記在很多方面類似於SSR標記，不同的是由引物擴增的區域通常不是高度重複區域。通常由於插入或缺失，擴增區域或擴增子在種質間還具有足夠的可變性，使得由擴增引物產生的片段能夠在多態性個體中區分開，並且已知此類插入缺失常常發生於玉米中 (Bhattramakki 等人 Q002)，Plant Mol Biol 48，539-547 ；Rafalski (2002b)，同上文)。SNP標記檢測單鹼基對核苷酸取代。在所有分子標記類型當中，SNP是最多的， 因此具有提供最高基因圖譜解析度的能力(Miattramakki等人2002 Plant Molecular Biology 48 :539447)。SNP可在甚至比SSR更高的通量水平上進行檢測，即以所謂的「超高通量」模式進行檢測，因為它們不需要大量DNA，並且可直接進行自動化檢測。SNP也具有成為相對低成本系統的前景。這三個因素一起使得SNP對在MAS中的應用具有高度吸引力。若干種方法可用於SNP基因分型，包括但不限於雜交、引物延伸、寡核苷酸連接、核酸酶酶解、 微測序和編碼球。此類方法在下列文獻中有所綜述Gut (2001) Hum Mutat 17，第475-492 頁；ShU2001)Clin Chem 47，第 164-172 頁；KwokQ000)Pharmacogenomics 1，第 95-100 頁；Bhattramakki 禾口 Rafalski (2001)Discovery and application of single nucleotide polymorphism markers in plants,選自R. J. Henry 編輯，Plant Genotyping :The DNA Fingerprinting of Plants, CABI Publishing, Wallingford0 許多可商購獲得的技術利用這些和其他方法來巡查SNP，包括Masscode. TM. (Qiagen)、Invader . (Third Wave Technologies)禾口 Invader Plus > SnapShot . (Applied Biosystems) > Taqman .(AppliedBiosystems)禾口 Beadarrays · (Illumina)0許多一起在單條序列內、或跨越連鎖序列的SNP可用於描述任何特定基因型的單倍型(Ching 等人 Q002)，BMC Genet. 3 :19 ；Gupta 等人 2001 ；Rafalski (2002b)，Plant Science 162:329-333).單倍型可比單個的SNP提供更多信息，並且可描述較多的任何特定基因型。例如，單個的SNP可以是具有鐮孢屬穗黴菌抗性的特定品系或品種的等位基因 「T」，但是等位基因「T」也可發生在用於輪迴親本的玉米育種種群中。在這種情況下，單倍型例如在連鎖SNP標記上的等位基因組合可提供較多的信息。一旦已經將唯一的單倍型分配給供體染色體區域，該單倍型可用於種群或其任何亞群以確定是否個體具有特定基因。參見例如W020030M229。使用本領域普通技術人員已知的那些自動化高通量標記檢測平臺使得這一方法高效和有效。由於存在插入/缺失多態性，很多PHM標記可易於用作FLP標記來對1號和6號染色體上的基因座進行正選擇。PHM標記的引物也可用於將這些標記轉化為在相同區域內的SNP或其他結構上類似或功能上等同的標記(331 、04 、插入缺失等)。一種非常高效的 SNP 轉化方法在 Rafalski (2002a) Current opinion in plant biology 5(2) :94-100 和 Rafalski (2002b) Plant Science 162 :3四_333中有所描述。使用PCR時，引物用於擴增來自個體(優選地自交體)的DNA片段，所述個體代表受關注種群的多樣性。將PCR產物在一個或兩個方向直接測序。比對所得的序列並且鑑定多態性。多態性不限於單核苷酸多態性(SNP)，還包括插入缺失、CAPS、SSR和VNTR(可變數目串聯重複)。具體地講，針對本文所述的精細圖譜信息，人們可易於使用本文提供的信息來獲取在通過本公開列出的引物擴增的區域內的附加多態性SNP (和其他標記)。可將在所述圖譜區域內的標記雜交到BAC或其他基因組文庫，或與基因組序列電子比對，以便在與所述標記的基本近似的位置處查找新序列。除了如上所述的SSR、FLP和SNP以外，其他類型的分子標記也廣泛使用，包括但不限於表達序列標籤(EST)、來源於EST序列的SSR標記、隨機擴增多態性DNA(RAPD)和其他基於核酸的標記。在一些情況下，同功酶特徵圖和連鎖的形態學特徵也可間接用作標記。儘管它們不直接檢測DNA差異，它們通常也受特定的遺傳差異影響。然而，檢測DNA變異的標記遠遠多於同功酶或形態學標記並且更具多態性(Tanksley(1983)Plant Molecular Biology Reporter 1 :3_8)。序列比對或重疊群也可用於查找本文列出的特定標記的上遊或下遊序列。這些新序列靠近本文所述的標記，然後被用於發現和開發功能等同的標記。例如將不同的物理和 /或基因圖譜進行比對以定位等同標記，所述標記不在所述公開中描述，但是位於相似區域內。這些圖譜可在玉米物種中，或者甚至包括已經與玉米進行了遺傳上或物理上的比對的其他物種，如大米、小麥、大麥或高粱。一般來講，MAS使用的多態性標記是經鑑定具有與表型例如鐮孢屬穗黴菌抗性共分離的顯著概率的那些。推測此類標記在圖譜上接近產生植物鐮孢屬穗黴菌抗性表型的一個或多個基因，並且認為此類標記是期望性狀的指示、或標記。測試植物是否在標記中存在期望的等位基因，並且期望在一個或多個基因座上包含期望基因型的植物將期望基因型與期望表型一起轉移到它們的子代。本文提供了鑑定具有增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的玉米植物的方法，該方法通過鑑定具有與增強的鐮孢屬穗黴菌抗性相關聯的等位基因的植株進行，所述等位基因位於本文所述的任何一個1號染色體標記基因座，包括PHM和 SSR 標記 PHM6929、bnlgl007、PHM8711、bnlgl083、PHM8211、PHM14506、PHM1754、PHM3951、 PHM1934、PHM10054、PHM10721 和 PHM15661 ；以及 SNP 標記 PHM8211-16-1、PHM8711-14-U、
32PHM14506-7-U、PHM1934-37-U、PHM8711-17-U、PHM1754-20-U、PHM3951-25-U、PHM6929-3-U、 PHM10054-14-U、PHM10721-9-U、PHM10721-16-U 和 PHM15661-21-U，和 / 或位於本文所述的任何一個6號染色體標記基因座，包括PHM和SSR標記PHM4423、bnlgl732、PHM9362、 PHI445613、PHM1147、PHM11850、PHM9301、umcl762、PHM5280、PHM13773 和 PHM16422 ；以及 SNP 標記 PHM9362-8-U、PHM1147-16-U、PHM11850-3-U、PHM11850-6-U、PHM13773-6-U、 PHM13773-11-U、PHM16422-11_U、PHMl 147-19-U、PHM5280-41-U、PHM9301-37-U 禾P PHM4423-4-U。本文提供的區間用於MAS中，以選擇表現出增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的植株。在1 號染色體區間內繪製的任何標記可用於此目的，所述區間由如下標記限定並且包括它們i. PHM6929 和 PHM1934，或ii. PHM6929 和 PHM14506。同樣地，在6號染色體區間內繪製的任何標記可用於此目的，所述區間由PHM4423 和PHM16422限定並且包括它們。單倍型也可用於MAS中，以將增強的鐮孢屬穗黴菌抗性引入敏感玉米品系或品種。單倍型可包含至少一種下列標記等位基因位於PHM8211-16的「T」、位於PHM8711-14 的 「C」、位於 PHM14506-7 的 「T」、位於 PHM1934-37 的 「C」、位於 PHM8711-17 的 「C」、位於 PHM1754-20 的 「C」、位於 PHM3951-25 的 「T」、位於 PHM6929-3 的 「C」、位於 PHM10054-14 的 「A」、位於 PHM10721-9 的 「A」、位於 PHM10721-16 的 「A」、位於 PHM15661-21 的 「G」、位於 PHM9362-8 的 「G」、位於 PHMl 147-16 的 「G」、位於 PHMl 1850-3 的 「T」、位於 PHMl 1850-6 的 「C」、位於 PHM13773-6 的 「A」、位於 PHM13773-11 的 「C」、位於 PHM16422-11 的 「A」、位於 PHMl 147-19 的 「T」、位於 PHM5280-41 的 「G」、位於 PHM9301-37 的 「T」 和位於 PHM4423-4 的 「T」。此外，下列單倍型可用於標記輔助選擇，以對具有增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的玉米植物進行正選擇a)位於 PHM6929-3 的 「C」、位於 PHM8211-16 的 「T」 和位於 PHM14506-7 的 「T」 ；b)位於 PHM4423-4 的 「T」、位於 PHMl 1850-3 的 「T」 和位於 PHM13773-6 的 「A」 ；c)位於 PHM10054-14 的 「A」 和位於 PHM10721-9 的 「A」 ；d)位於 PHM10054-14 的 「A」、位於 PHM8211-16 的 「T」 和位於 PHM10721-9 的 「A，，；e)位於 PHM9362-8 的 「A」 和位於 PHM13773-6 的 「A」。
實施例提供以下實施例以示出受權利要求書保護的本發明，但本發明不受以下實施例的限制。應當理解本文所述的實施例和實施方案僅用於例證性的目的，並且本領域的技術人員將認識到在不脫離本發明精神或所附權利要求範圍的情況下可改變多種試劑或參數。實施例1鐮孢屬穗黴菌抗性的大效應QTL作圖作圖群體由360株F7:8重組自交系(RIL)組成的作圖群體來源於非剛性莖杆組中的高抗性品系PHG61和敏感剛性莖杆自交體1047之間的雜交。(圖3示出了來自抗性品系PHG61的穗和來自敏感品系1047的穗之間的比較)。在非選擇性環境中進行家族的連續自交。通常將在每行中的首個五株植株自交，並且收割來自最接近該行中心的兩株植株的穗。一些產生禿穗的品系被自然淘汰。基因分型從F7:8幼苗的凍幹葉片樣品提取DNA，並且在533個AFLP標記的每一個處收集基因型數據，該標記覆蓋總共1380. 6cM，並且標記之間的平均距離為2. 6cM。表型分析在天然感染條件下對RIL種群中的品系評估了可見穗黴菌，所述評估於1998年和 1999 年在美國的兩個測試點進行Winterville(WT)，Pitt County, North Carolina 和 Walnut Grove (CA)，San Joaquin County, California。真菌生長和星放射狀(果皮上的白色條痕，與籽粒的長軸平行延伸)被視為穗黴菌的徵兆和症狀。根據圖4中示出的1至 9標度對穗堆進行可見穗黴菌評分。QTL 作圖使用1999 年發布的 PLABQTL 軟體包(Utz 和 Melchinger (1996) J. Quant. Trait Loci 2(1))1. 1版對未轉化數據進行QTL分析。複合區間作圖(cov SEL命令)用於檢測推定的QTL。如果QTL在兩個位置均檢出並且如果在至少一個位置是顯著的，則說明QTL為真實的。QTL分析鑑定出1號、5號、6號、7號和8號染色體上鐮孢屬穗黴菌抗性的主效QTL。 1號染色體上的QTL本文稱為QTLl，並且位於AFLP標記177和T292之間。6號染色體上的 QTL本文稱為QTL6，並且位於AFLP標記D166和C116之間。SEQ ID NO 1至8是描繪QTLl 和QTL6的AFLP標記的引物序列。實施例2QTLl和QTL6的驗證和精細作圖為了測試鑑定的QTL的效應和效用，構建了在以下三個敏感遺傳背景中的近等基因系(NIL) 1047 (如上所述)、PH24E和PH1BC。PHG61具有8至9 (基於1至9標度)的鐮孢屬穗黴菌歷史分數；而1047、PH24E和PHlBC具有3至4、4. 0和5. 0的歷史分數。將來自實施例1的攜帶QTLl或QTL6的RIL與初始敏感親本1047回交兩次，接著連續自交3代，從而製成BC3S3品系。NIL也通過將抗性親本PHG61與兩個其他敏感自交體(PH24E和PH1BC)雜交生成。 對於每個雜交，將Fl種群的個體與相應的輪迴親本回交，生成BC2種群，然後BC2家族連續自交進行3代。標記輔助選擇(MAS)用於構建NIL，以對每代中相應的QTL區域進行正選擇。一組 76個SSR用於MAS。其中四個SSR用於QTLl或QTL6(來源於PHG61)的正選擇，而剩餘的 72個用於PHG61的負選擇。具體地講，bnlgl953用於選擇QTL1，而LGI112958、PHI445613 和PHI364545用於選擇QTL6。最新IBM2圖譜上這些標記的位置，與它們相應的引物序列一起，可見於表1中。表1 用於對PHG61的QTLl和QTL6區域進行ιΗ選擇的SSR標記
染色體 IBM2 2008
引物
bnlgl953 LGIl 12958 PHI445613 PHI364545
6 6 6
170 n/a 375.8 428.4
SEQ ID NO:9 和 10 SEQ ID NO: 11 和 12 SEQ ID NO:13 和 14 SEQ ID NO: 15 和 16然後鑑定了純合BC3S3(對於在1047背景中構建的NIL)和BC2S3 (對於在PHME 和PHlBC背景中構建的NIL)重組體。使用圖4中的標度在美國的以下四個測試點對在天然感染條件下的純合重組體進行可見穗黴菌評分Camden，Camden County, North Carolina ； Cairo, Grady County, Georgia ；Woodland, San Joaquin County, California ；禾口 Waimea, Kauai, Hawaii。在與輪迴親本1047、PH24E和PHlBC進行比較時，包含QTLl的NIL使鐮孢屬穗黴菌的評分增加1至2分(基於圖4中1至9的標度)，而包含QTL6的NIL使鐮孢屬穗黴菌的評分增加2至4分。玉米的整合基因和物理圖譜用於鑑定所有位於QTLl和QTL6兩個區域的BAC重疊群。來自這些重疊群的低拷貝BAC末端序列和PHM標記用於開發與hvader 或Invader Plus 技術一起使用的CAP標記和/或SNP標記。在這兩個區域的許多標記位置處對純合重組體進行評估。對於QTL1，重組數據將QTLl置於這樣的區域內，該區域由標記PHM8211 (SEQ ID NO 33至36)和PHM1934(SEQ ID NO :37至40)限定並且包括它們，而QTL6則置於6號染色體這樣的區域內，該區域由標記bnlgl732(SEQ ID NO 17和18)和umcl762 (SEQ ID NO 19和20)限定並且包括它們。實施例3優良自交體轉化株儘管PHG61覆蓋鐮孢屬穗黴菌抗性等位基因，但PHG61的農學特性較差。因此，許多優良自交體通過來自PHG61的QTLl和/或QTL6的基因滲入而「轉化」為具有增強的鐮孢屬穗黴菌抗性。然後育種人員可利用這些轉化株將QTL從PHG61移動至它們的育種種質。 轉化株由優良自交體 PHCA5、PH51H、PH70R、PH87H、PHFCJ、PH890 和 PHBlV 通過將 PHG61 (供體親本)與每個相應的自交體(輪迴親本)雜交而產生。然後將子代與輪迴親本回交五次， 然後自交三代。在每個BC種群中，SSR標記用於QTL區域的正選擇。使用bnlgl007(SEQ ID NO :21 和 22)、bnlgl083(SEQ ID NO :23 和 24)和 PHI256546 (SEQ ID NO :25 和洸)進行 QTLl 的正選擇，並且使用 bnlgll74(SEQ ID NO :27 和 28)和 umcl805(SEQ ID NO 29 和 30)進行QTL6的正選擇。然而，在BC5種群和BC5F2種群中，使用umcl462(SEQ ID NO: 31和32)和PHI445613(SEQ ID NO :13和14)進行QTL6的正選擇。然後使用SNP標記代替SSR選擇BC5F3個體。對於QTL1，正選擇的等位基因為位於PHM8211-16的「T」、位於 PHM8711-14 的「C」、位於 PHM14506-7 的「T」 和位於 PHM1934-37 的「C」。對於 QTL6，正選擇的等位基因為位於PHM9362-8的「G」、位於PHM1147-16的「G」、位於PHM11850-6的「C」、 位於PHM13773-11的「C」和位於PHM16422-11的「A」。參見圖5A和5B (對於QTL1)以及圖 6A和6B (對於QTL6)，獲取這些SNP每一個的標記信息。來自選擇的BC5F3個體和對應的非轉化自交體的種子採用裂區設計進行種植，其中基因型(QTL)嵌套在自交體內。在3個位置(Cremona, Italy ；Cairo, GA ；和Woodland，CA)的每個中都有3個重複；然而Cairo，GA和Cremona，Italy位置無病害壓力，並且不可評分。在WoodlancbCA，整個田間的病害壓力良好，但是若干自交體是禿穗的或具有散布的籽粒。理想的是，表型可通過評估穗堆的分數來量度，所述穗堆具有6個或更多個籽粒灌漿分數為3或更高的穗。然而，由於籽粒散布的問題，評分在非常差的穗堆上進行，並且很多項目根本不能評分。PHBlV具有良好的穗堆，並且評分是充分的。使用圖4中提供的標度進行表型評分，並且對於 QTLl 在標記 PHM8711-17、PHM8211-16、PHM1754-20 和 PHM3951-25 進行基因分型，並且對於 QTL6 在標記 PHM9362-8、PHMl 147-16、PHMl 147-19、PHMl 1850-6、 PHM5280-41和PHM9301-37進行基因分型。參見圖5A、5B、6A和6B，獲取SNP標記的信息； 具體地講，圖中列出了每個引物和探針序列的SEQ ID標識符。評估許多其他標記以確定其他鑑定的QTL(參見實施例1)是否與表型結果矛盾。對於QTL5，這些標記是PHM9009-13、 PHM3171-5 和 PHM3860-43 ；對於 QTL7，這些標記是PHM7942-12、PHM678_22 和 PHM8358-17 ； 對於 QTL8，這些標記是PHM16415-8、PHM737-215 和 PHM9092-11。參見圖 7A 至 7C，獲取 Invader Plus 平臺使用的引物和探針序列。圖8至14示出了優良自交體轉化株的結果。 在每個表中，「c0rr_vearm0ld」是具有籽粒灌漿充分的6個或更多個穗的穗堆的校正分數。 「stddev」表示標準偏差。用深灰色突出的單元格表示PHG61等位基因，並且用淺灰色突出的單元格表示標記基因座在該等位基因處分離，或表示用於檢測SNP的技術不能確定存在哪個等位基因。只示出了那些獲取表型數據的SI_ID(種子庫_標識號；指示種子來源)。 「EQV」意指不能稱為多態性；「NF」意指數據未找到。PHCA5、PH51H、PH70R和它們相應的轉化株具有嚴重的籽粒散布問題，使其評分極
其困難。PHCA5具有4. 0的鐮孢屬穗黴菌歷史分數；然而，在此實驗中，它不可評分。PHG61 和 PHCA5 在 PHM8711-17、PHM1754-20、PHMl 147-16、PHM3171-5、PHM678-22 和 PHM9092-11 不具有多態性。11510073和11710277在QTLl表現出分離，並且可能具有來源於PHG61 的QTL6。11510073和11710277分別具有4. 0和5. 5的分數。分數都為4的11510074和 11710275具有來源於PHG61的QTLl但不具有QTL6。分數為4. 0的11510082沒有來源於 PHG61的QTLl，並且可能具有QTL6。圖8示出了 PHCA5轉化數據。PH51H具有3. 6的鐮孢屬穗黴菌歷史分數；然而，在此實驗中，它具有4. 7的分數。 PHG61 和 PH51H 在 PHM5280-41、PHM3171-5、PHM3860-43、PHM678-22 和 PHM737-215 不具有多態性。由於QTL7的幹擾，11066837、11066811、11066836和11066839表現出具有矛盾的表型數據。分數為5. 0的11066837可能對於QTLl是分離的，可能具有QTL6，並且表現出具有QTL7。分數為5. 5的11066809可能對於QTLl是分離的，並且可能具有來源於PHG61的 QTL6。分數為6. 0的11066839對於QTLl表現出分離，不具有QTL6，並且表現出具有QTL7。 分數為6. 3的11066838對於QTLl和QTL7 二者是分離的，並且可能具有來源於PHG61的 QTL6。分數為6. 7的11066841和分數為7. 5的11066811不具有QTL1，並且對於QTL6和 QTL7表現出分離。由於存在QTLl、QTL6和/或QTL7，轉化株的分數與PH51H相比顯著增加。圖9示出了 PH51H轉化數據。PH70R具有3. 6的鐮孢屬穗黴菌歷史分數；然而，在此實驗中，它具有3. 0的分數。PHG61 和 PH70R 在 PHM8711-17、PHM1754-20、PHM3951-25、PHMl 1850-6、PHM5280-41、 PHM9301-37、PHM3171-5、PHM3860-43、PHM678-22、PHM16415-8、PHM737-215 和 PHM9092-11不具有多態性。分數為3. 0的11067135不具有QTLl，並且可能具有來源於PHG61的QTL6。 11067046具有3. 0的分數，並且表現出具有來源於PHG61的QTLl。分數為4. 0的11067168 在 QTLl 和 QTL6 均表現出分離。11067139、11067095 和 11062329 分別具有 3. 5,4. 7 和 5. 0 的分數，並且所有都表現出具有來源於PHG61的QTL1，並且對於QTL6是分離的。11067060、 11067174和11067126分別具有5. 0,5. 0和5. 5的分數，並且它們表現出具有來源於PHG61 的QTLl，並且可能具有QTL6。
圖10示出了 PH70R轉化數據。PH87H、PHFCJ、PH890和它們相應的轉化株具有籽粒散布問題，雖然較不嚴重。PH87H具有5. 0的鐮孢屬穗黴菌歷史分數；然而，在此實驗中，它具有5. 5的分數。 PHG61 和 PH87H 在 PHM8711-17、PHM1147-16、PHM678-22 和 PHM9092-11 不具有多態性。分數為3. 7的110663 具有來源於PHG61的QTLl和QTL5，並且對於QTL6和QTL8表現出分離。分數為4. 0的110663 在QTLl和QTL8表現出分離，並且可能具有來源於PHG61的 QTL6。分數為4. 0的11066314具有來源於PHG61的QTLl和QTL5，並且可能具有QTL6和 QTL8。分數為4. 3的11066230沒有來源於PHG61的QTLl或QTL6，但是可能具有QTL5。分數都為6. 0的11066235和11066277不具有來源於PHG61的QTL6，但是可能具有QTLl和 QTL8。分數為6. 0的11066377在QTLl和QTL5表現出分離，並且可能具有來源於PHG61的 QTL6。分數為6. 0的11062279具有來源於PHG61的QTLl和QTL5，並且可能具有QTL6。分數為6. 0的11066321具有來源於PHG61的QTL1，並且在QTL5、QTL6和QTL8表現出分離。
圖11示出了 PH87H轉化數據。PHFCJ具有4. 0的鐮孢屬穗黴菌歷史分數；然而，在此實驗中，它具有5. 3的分數。PHG61 禾Π PHFCJ 在 ΡΗΜ8211-16、ΡΗΜ9362-8、PHMl 147-16、ΡΗΜ9301-37、ΡΗΜ8358-17、 ΡΗΜ16415-8和ΡΗΜ737-215不具有多態性。分數為3. 7的11066486在QTLl表現出分離，並且具有來源於PHG61的QTL6。分數為4. 0的11066514具有來源於PHG61的QTL6，並且可能具有QTLl。分數為4. 0的110665522在QTLl和QTL6表現出分離。
圖12示出了 PHFCJ 轉化數據。ΡΗ890具有4. 5的鐮孢屬穗黴菌歷史分數；然而，在此實驗中，它具有3. 5的分數。 PHG61 和 ΡΗ890 在ΡΗΜ8711-17、ΡΗΜ1754_20、ΡΗΜ1147-16 和 ΡΗΜ9092-11 不具有多態性。分數為4. 4的11066544沒有來源於PHG61的QTL6，並且可能具有QTLl。分數為4. 0的11062297 不具有來源於PHG61的QTL1，並且在QTL6表現出分離。11066659和11066639分別具有3. 0 和4. 0的分數，並且它們不具有來源於PHG61的QTL1，但是具有QTL6。11062294具有5. 0 的分數，並且具有來源於PHG61的QTL6和QTLl。11066672具有3. 7的分數，並且在QTLl 表現出分離。11066707、11066601、11066680 和 11066565 分別具有 2. 5,4. 0,4. 0 和 5. 0 的分數，它們具有來源於PHG61的QTL1，並且在QTL6表現出分離。分數為4. 5的11066600具有來源於PHG61的QTLl和QTL6。
圖13示出了 ΡΗ890轉化數據。PHBlV具有4. 0的鐮孢屬穗黴菌歷史分數；然而，在此實驗中，它具有4. 2的分數。PHG61 禾Π PHBlV 在 ΡΗΜ11850-6、ΡΗΜ5280-41、ΡΗΜ9301-37、ΡΗΜ3171-5、ΡΗΜ3860-43、 ΡΗΜ8358-17、ΡΗΜ16415-8 和 ΡΗΜ737-215 不具有多態性。11066911 和 11066896 分別具有 4. 0和4. 4的分數，並且它們兩者都不具有來源於PHG61的QTLl或QTL6。分數為6. 0的 11066988 沒有來源於 QTLl 的 QTLl，並且可能具有 QTL6。11066895、11066923、11067017 和 11067023分別具有4. 0,5. 3,6. 6和6. 8的分數，並且具有來源於PHG61的QTLl，但是不具有QTL6。11066930具有5.0的分數，並且具有來源於PHG61的QTL1。11066981具有7. 0 的分數，其在QTLl表現出分離，並且可能具有來源於PHG61的QTL6。11067002具有8. 0的分數，其具有來源於PHG61的QTL1，並且可能在QTL6分離。
圖14示出了 PHBlV轉化數據。實施例4雜交體中的功效將PHFCJ、PH70R、PH890和PH51H的轉化株與自交系雜交產生雜交體，然後與類似的雜交進行比較，在該類似的雜交中非轉化PHFCJ、PH70R、PH890和PH51H自交系用作親本。關於那些具有「良好」抗性單倍型(類似於PHG61)的品系和那些不具有「良好」抗性單倍型的品系之間的鐮孢屬穗黴菌分數的比較，參見
圖15A和15B。評估QTLl的標記包括 PHM6929-3, PHM8211-16 和 PHM14506-7。評估 QTL6 的標記包括ΡΗΜ4423_4、ΡΗΜ9362-8、 ΡΗΜ1147-19 和 PHMl1850-6 當非轉化PHFCJ品系與PHlJC雜交時，所得雜交體具有2. 8的平均鐮孢屬穗黴菌分數。對於由PHFCJ轉化品系和PHlJC之間雜交產生的植株，ΡΗΜ9362-8和PHMl 147-19給出了出乎意料的等位基因結果，並且ΡΗΜ8211-16未提供信息。然而，12022402和12022385 分別具有3. 2和3. 5的分數並且具有QTL6，而12022384具有3. 3的分數並且表現出具有 QTLl。當非轉化PH70R品系與PH3RC雜交時，所得雜交體具有5. 5的平均鐮孢屬穗黴菌分數。在PH70R轉化品系和PH3RC之間的雜交中，由於具有一個或兩個QTL，因此除了一個雜交之外所有雜交的平均分數都等於或大於5. 5。大概由於存在QTL1，12022393和 12022394分別具有5. 5和6. 2的分數。分數為7. 2的12022395具有QTL6，並且可能具有 QTLl。12022396、12022397和12022398分別具有5. 0,7. 2和5. 5的分數，並且所有三個都具有QTLl和QTL6。當非轉化ΡΗ890品系與PH4CN雜交時，所得雜交體具有3. 8的平均鐮孢屬穗黴菌分數。在ΡΗ890轉化品系和PH4CN之間的雜交中，雜交的平均分數等於或大於3. 8。12022391 只具有 QTL6,並且具有 3. 8 的分數。12022387、12022388、12022389 和 12022390 具有 QTLl 和QTL6，因此分數分別為5. 8、4. 7、5. 5和4. 8。當非轉化ΡΗ51Η品系與PHEKJ雜交時，所得雜交體具有2. 0的平均鐮孢屬穗黴菌分數。在ΡΗ51Η轉化品系和PHEKJ之間的雜交中，雜交的平均分數大於2.0。一個雜交具有 3. 3的分數，並且可能具有QTL6。另外兩個雜交分別具有6. 0和5. 0的分數，並且表現出具有QTLl，並且可能具有QTL6。當非轉化ΡΗ51Η品系與PHFlJ雜交時，所得雜交體具有7. 3的平均鐮孢屬穗黴菌分數，該分數指示已經具有高水平的抗性。在ΡΗ51Η轉化品系和PHFlJ之間的雜交中，一個雜交具有7. 0的平均分數，並且可能攜帶QTLl。另一個雜交具有7. 3的平均分數，並且可能具有QTLl和QTL6。第三個雜交也具有7. 3的平均分數，並且具有QTLl，可能具有QTL6。當非轉化ΡΗ51Η品系與PH1W2雜交時，所得雜交體具有5. 3的平均鐮孢屬穗黴菌分數。在ΡΗ51Η轉化品系和PH1W2之間的雜交中，每個雜交具有大於5. 3的平均分數，並且具有QTLl，可能具有QTL6。實施例5用於鐮孢屬穗黴菌抗性植株的標記輔助選擇的高通量標記的鑑定
緊密連鎖的標記具有與在QTLl和/或QTL6的抗性等位基因連鎖不平衡的等位基因，所述緊密連鎖的標記可有效地用於對具有增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的子代植物進行正選擇。本文所述的標記，以及其他在遺傳上或物理上作圖至相同染色體片段的標記，可用於對具有增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的玉米植物進行正選擇。表2A和2B示出了本文所述的標記和它們在內源基因圖譜(PHB)和IBM2圖譜(灰色區域指示QTL所在位置)的位置。圖 IA至IC和2A至2B分別示出了 QTLl區域和QTL6區域的物理圖譜；每個PHM參考序列的 SEQ ID NO都在圖中示出。表2A 以物理圖譜順序排列的QTLl區域
標記PHBΙΒΜ2bnlgl95370.45170PI1M692976.12183.8bnlgl776.93139.7PHM871179.68198.4bnlgl08380.54201.3PIIM1005480.33n/aPIIM821 178.3n/aPI-IM 1287281.72n/aPHM 1072180.77198.4PIIM 1566184.31n/aPHM1450681.88201.5PHM175483.76198.4PHM395184.39226.4PHM193484.39198.4ΡΗΙ25654690.98226.4 表2B 以物理圖譜順序排列的QTL6區域
權利要求
1.選擇具有增強的鐮孢屬(Fusarium)穗黴菌抗性的玉米植物的方法，所述方法包括a.獲取可用於分析的DNA;b.在所述玉米植物中檢測與第二標記等位基因連鎖並關聯的第一標記等位基因，所述第二標記等位基因選自1.位於PHM8211-16 的 「T」，ii.位於PHM8711-14 的 「C」，iii.位於PHM14506-7 的 「T，，，iv.位於PHM1934-37 的 「C」，v.位於PHM8711-17 的 「C」，vi.位於PHM1754-20 的 「C」，vii.位於PHM3951-25 的"T，，，viii.位於PHM69^-3 的 「C」，ix.位於PHM10054-14 的"A，，， χ.位於 PHM10721-9 的 「A，，，xi.位於PHM10721-16 的"A，，，xii.位於PHM15661-21 的 「G，，，xiii.位於PHM9362-8 的"G，，，xiv.位於PHMl 147-16 的 「G，，， XV.位於 PHMl 1850-3 的 「T，，，xvi.位於PHMl 1850-6 的 「C」，xvii.位於PHM13773-6 的 「A」，xviii.位於PHM13773-11 的 「C」，xix.位於PHM16422-11 的 「A」， XX.位於 PHMl 147-19 的 「T，，，xxi.位於PHM5280-41 的 「G」，xxii.位於PHM9301-37 的 「T」，和xxiii.位於PHM4423-4 的 「Τ」 ；以及c.選擇具有所述第一標記等位基因的所述玉米植物。
2.權利要求1的方法，其中所述第一標記等位基因以20cM的距離與所述第二標記等位基因連鎖。
3.權利要求1的方法，其中所述第一標記等位基因以IcM的距離與所述第二標記等位基因連鎖。
4.選擇具有增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的玉米植物的方法，所述方法包括a.獲取可用於分析的DNA;b.在所述玉米植物中檢測至少一個標記等位基因，所述標記等位基因選自i.位於PHM8211-16 的 「T」，ii.位於PHM8711-14 的 「C」，iii.位於PHM14506-7 的 「T，，，iv.位於PHM1934-37 的 「C」，v.位於PHM8711-17 的 「C」，vi.位於PHM1754-20 的 「C」，vii.位於PHM3951-25 的"T，，，viii.位於PHM69^-3 的 「C」，ix.位於PHM10054-14 的"A，，，χ.位於 PHM10721-9 的 「A，，，xi.位於PHM10721-16 的"A，，，xii.位於PHM15661-21 的 「G，，，xiii.位於PHM9362-8 的"G，，，xiv.位於PHMl 147-16 的 「G，，，XV.位於 PHMl 1850-3 的 「T，，，xvi.位於PHMl 1850-6 的 「C」，xvii.位於PHM13773-6 的 「A」，xviii.位於PHM13773-11 的 「C」，xix.位於PHM16422-11 的 「A」，XX.位於 PHMl 147-19 的 「T，，，xxi.位於PHM5280-41 的 「G」，xxii.位於PHM9301-37 的 「T」，和xxiii.位於PHM4423-4 的 「Τ」 ；以及c.選擇具有所述至少一個標記等位基因的玉米植物。
5.鑑定顯示增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的玉米植物的方法，所述方法包括在玉米植物中檢測標記基因座，其中a.將包含所有或一部分所述標記基因座、或其互補序列的標記探針在嚴格條件下與連續的DNA雜交，所述連續的DNA介於以下序列之間並包括以下序列SEQ ID NO :41或基於 Clustal V比對方法與SEQ ID NO :41具有95%同一性的核苷酸序列、以及SEQ ID NO 47 或基於Clustal V比對方法與SEQ ID NO 47具有95%同一性的核苷酸序列；以及b.所述標記基因座包含與所述增強的鐮孢屬穗黴菌抗性相關聯的至少一個等位基因。
6.鑑定顯示增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的玉米植物的方法，所述方法包括在所述玉米植物的種質中檢測標記基因座的等位基因，其中a.所述標記基因座位於染色體區間內，所述染色體區間包含並側接PHM6^9和 PHM1934 ；並且b.所述等位基因與增強的鐮孢屬穗黴菌抗性相關聯。
7.權利要求6的方法，其中所述標記基因座位於染色體區間內，所述染色體區間包含並側接 PHM6^9 和 PHM14506。
8.鑑定顯示增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的玉米植物的方法，所述方法包括在所述玉米植物的種質中檢測在一個或多個標記基因座包含等位基因的單倍型，其中a.所述一個或多個標記基因座位於染色體區間內，所述染色體區間包含並側接 PHM6929 和 PHM1934 ；並且b.所述單倍型與增強的鐮孢屬穗黴菌抗性相關聯。
9.權利要求8的方法，其中所述一個或多個標記基因座位於染色體區間內，所述染色體區間包含並側接PHM6^9和PHM14506。
10.權利要求8或9的方法，其中所述單倍型包含a.位於PHM69^-3 的 「C」、位於 PHM8211-16 的 「T」 和位於 PHM14506-7 的 「T」 ；b.位於PHM10054-14 的 「A」 和位於 PHM10721-9 的 「A」 ；或c.位於PHM10054-14 的 「A」、位於 PHM8211-16 的 「T」 和位於 PHM10721-9 的 「A，，。
11.選擇顯示增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的玉米植物的方法，所述方法包括a.獲取具有標記基因座的至少一個等位基因的第一玉米植物，其中所述標記基因座位於包含並側接PHM6^9和PHM1934的染色體區間內，並且所述等位基因與增強的鐮孢屬穗黴菌抗性相關聯；b.將所述第一玉米植物與第二玉米植物雜交；c.評估子代植物的所述第一玉米植物的所述等位基因；以及d.選擇具有所述第一玉米植物的所述等位基因的子代植物。
12.權利要求11的方法，其中所述標記基因座位於染色體區間內，所述染色體區間包含並側接PHM6^9和PHM14506。
13.選擇顯示增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的玉米植物的方法，所述方法包括a.獲取第一玉米植物，所述第一玉米植物的基因組內包含i.位於PHM6929-3 的 「C」、位於 PHM8211-16 的 「T」 和位於 PHM14506-7 的 「T」ii.位於PHM10054-14 的 「A」 和位於 PHM10721-9 的 「A，，；或iii.位於PHM10054-14 的 「A，，、位於 PHM8211-16 的 「T」 和位於 PHM10721-9 的 「A」；b.將所述第一玉米植物與第二玉米植物雜交；c.評估子代植物的所述等位基因；以及d.選擇具有所述等位基因的子代植物。
14.鑑定顯示增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的玉米植物的方法，所述方法包括在玉米植物中檢測標記基因座，其中a.將包含所有或一部分所述標記基因座、或其互補序列的標記探針在嚴格條件下與介於以下序列之間並包括以下序列的連續的DNA雜交SEQ ID NO :48或基於Clustal V比對方法與SEQ ID NO :48具有95%同一性的核苷酸序列、以及SEQ ID NO :55或基於Clustal V比對方法與SEQ ID NO 55具有95%同一性的核苷酸序列；以及b.所述標記基因座包含與所述增強的鐮孢屬穗黴菌抗性相關聯的至少一個等位基因。
15.鑑定顯示增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的玉米植物的方法，所述方法包括在所述玉米植物的種質中檢測標記基因座的至少一個等位基因，其中a.所述標記基因座位於包含並側接PHM4423和PHM16422的染色體區間內；並且b.所述標記基因座包含與增強的鐮孢屬穗黴菌抗性相關聯的至少一個等位基因。
16.鑑定顯示增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的玉米植物的方法，所述方法包括在所述玉米植物的種質中檢測在一個或多個標記基因座包含等位基因的單倍型，其中a.所述一個或多個標記基因座位於染色體區間內，所述染色體區間包含並側接 PHM4423 和 PHM16422 ；並且b.所述單倍型與增強的鐮孢屬穗黴菌抗性相關聯。
17.權利要求16的方法，其中所述單倍型包含a.位於PHM4423-4 的 「T」、位於 PHMl 1850-3 的 「T」 和位於 PHM13773-6 的 「A」；或b.位於PHM9362-8 的 「A」 和位於 PHM13773-6 的 「A」。
18.選擇顯示增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的玉米植物的方法，所述方法包括a.獲取具有標記基因座至少一個等位基因的第一玉米植物，其中所述標記基因座位於染色體區間內，所述染色體區間包含並側接PHM4423和PHM16422，並且所述等位基因與增強的鐮孢屬穗黴菌抗性相關聯；b.將所述第一玉米植物與第二玉米植物雜交；c.評估子代植物中的所述第一玉米植物的所述等位基因；以及d.選擇具有所述第一玉米植物的所述等位基因的子代植物。
19.選擇顯示增強的鐮孢屬穗黴菌抗性的玉米植物的方法，所述方法包括a.獲取第一玉米植物，所述第一玉米植物的基因組內包含i.位於PHM4423-4 的 「T」、位於 PHMl 1850-3 的 「T」 和位於 PHM13773-6 的 「A」；或ii.位於PHM9362-8 的 「A」 和位於 PHM13773-6 的 「A」 ；b.將所述第一玉米植物與第二玉米植物雜交；c.評估子代植物中的所述等位基因；以及d.選擇具有所述等位基因的子代植物。
20.通過權利要求5、6至9、10和14至17的方法中的任意方法鑑定的玉米植物。
21.通過權利要求1至4、11至13和18至19的方法中的任意方法選擇的植物。
全文摘要
本發明涉及鑑定和選擇具有增強的鐮孢屬(Fusarium)穗黴菌抗性的玉米植物的方法和組合物。通過本發明的所述方法生成的玉米植物也是本發明的特徵。
文檔編號A01H5/10GK102395687SQ201080016703
公開日2012年3月28日 申請日期2010年4月13日 優先權日2009年4月13日
發明者A·託馬斯, D·普拉達, K·辛科克斯, S·拉克 申請人:納幕爾杜邦公司