來自大麗輪枝菌的致病相關蛋白VdGRP1及其編碼基因的製作方法

2023-04-24 20:51:16 1

專利名稱：來自大麗輪枝菌的致病相關蛋白VdGRP1及其編碼基因的製作方法
技術領域：
本發明涉及來自大麗輪枝菌的致病相關蛋白及其編碼基因。
背景技術：
由土壤絲狀真菌大麗輪枝菌(Verticilliu dahliae Kleb.)所引起的棉花黃萎病是威脅棉花生產的主要病害，多年來一直嚴重影響著我國棉花的品質和產量。棉花黃萎病1914年始見於美國的費吉尼亞州，隨後在其它州和世界各植棉國先後發現(沈其益， 1992)，1935年隨引進美棉品種傳入我國，但危害不重。到二十世紀50年代以後，黃萎病在我國南北局部棉區陸續發生，擴散蔓延速度加快。，80年代末，黃萎病已遍及全國478個植棉縣(市)。進入90年代以來，我國棉花黃萎病擴展蔓延迅猛，尤其是1993，1995，1996， 2002年在全國範圍內連續大發生，損失嚴重。至今，我國大部分主產棉區已成為黃萎病重病區。黃萎病致病菌為大麗輪枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)，屬半知菌亞門，叢梗抱目，淡色孢科，輪枝菌屬。大麗輪枝菌的寄主範圍很廣，涉及十字花科、薔薇科、豆科、茄科、唇形花科、菊科等，目前已達660多種植物，並且還在逐年擴大。關於棉花黃萎病的致病機制有多種解釋，其中以導管堵塞和中毒兩種觀點為主。60年代人們對該病菌致病機制的認識是由於菌體在導管內定殖，並大量繁殖，同時刺激鄰近的薄壁細胞產生膠狀物質及侵填體而堵塞導管，阻礙水分的運轉，從而導致棉株萎焉(Garber，1966)。馬遠莉等(1990) 對棉花各部位黃萎病菌在導管中的分布情況研究後認為，正常的次生木質部導管的潛在輸水能力遠遠超過植物的總需水量，而且被堵塞的導管數佔整個維管束的比例不大(最大的有17.7%)，因此導管堵塞不是導致棉花萎焉的主要原因。Keen等(197 認為，黃萎病菌在代謝過程中產生的毒素為有毒的蛋白質，是一種酸性蛋白質一脂多糖的複合體。該複合物對感病棉花品種的葉片與根組織的細胞膜具有破壞作用，使細胞內K+和Na+大量滲漏。 而抗病品種的細胞膜不具備毒素作用的受體位點而不受毒素破壞。Wang等Q004)從黃萎病原菌的菌絲中分離到一個新的具有對棉花葉片有致萎作用的蛋白VdNEP。該蛋白可以誘導菸草葉片形成壞死斑，也可以使擬南芥產生抗病反應，因此該蛋白可能參與了黃萎病菌對棉花侵染時的互作反應。但目前尚不清楚該蛋白是否與以前已分離的毒素蛋白是同一物質。現在越來越多的研究表明，黃萎病菌分泌的毒素是導致黃萎病的關鍵生化因子，同時組織導管的阻塞影響水分運輸可能加劇了病症的產生。大麗輪枝菌是一種土傳真菌，在乾燥惡劣的環境下能夠產生其休眠結構微菌核， 從而在土壤中存活多年。所以微菌核的形成與其致病性息息相關。2004年，DobinsonKF等 (Dobinson,K. F. , et al.，2004)利用改造了的EZ: TN轉座系統，對來源於番茄的大麗輪枝菌的胰蛋白酶VTPl成功的進行了定向敲除。該基因能夠促進微菌核的形成，但是敲除以後沒有影響其致病性及生長特性。2005年，Dobinson KF等對來源於萵苣和番茄的大麗輪枝菌的細胞分裂素活化蛋白激酶基因VMKl進行了敲除。敲除VMKl後菌株對各種宿主的致病性嚴重衰退，說明MAP激酶介導的信號通路在真菌致病性上起著重要作用。並且基因的敲除減少了孢子的產生和微菌核的形成，說明該基因可能參與多個細胞進程。2006年Dobinson KF等(Klimes，A, et al,2006)又利用此系統對來源於番茄的大麗輪枝菌的類型2疏水蛋白基因VDHl進行了敲除。該基因的敲除減少了微菌核的產生，但不影響其致病性。對孢子的產生也沒有影響，但影響了孢子對乾燥環境的耐受力。說明VDHl基因的功能是多方面的，可能與大麗輪枝菌在土壤中長期的生存有關。2008年Dobinson KF等又研究了在微菌核的形成過程中VDHl基因的調控和表達，發現VDHl基因在微菌核、菌絲融合體及孢子中特異表達，進一步證明了該基因與微菌核的形成相關。由於棉花黃萎病危害的嚴重性和寄主的廣泛性，世界上不少國家的科技工作者對其進行了深入研究。植物在與病原物的長期協同進化過程中獲得了一系列複雜的防禦機制保護自己，抗性表現為組成型抗性和誘導型抗性，誘導型抗性又包括組織結構抗性和生理生化抗性。對黃萎病抗性不同的棉花品種在組織結構方面存在一定差異，已被國內外不少研究證實。抗病品種木質部的細胞間隙較小，細胞壁較厚，且木質部中含有較多的髓射線。 另外，抗病品種的導管腔和木質部的纖維腔直徑小於感病品種，說明棉花品種對黃萎病的抗性與其具有堅實的木質部有關。棉花的生理生化抗病性方面已有過較多的研究，研究較多的抗病相關因子包括植保素、單寧、可溶性糖、胺基酸及多種酶類。棉株在遭受病菌侵襲後，內部產生多種抑菌物質，主要包括棉酚、植保素、單寧等，另外還與一些酶類、蛋白以及小分子物質如h202。它們的作用是非專化性，與植物的基礎抗性相關。棉花抗黃萎病的機制是一個非常複雜的問題，涉及的因素眾多，因此不斷深入研究這些抗病反應產物在基因表達水平上的規律，對於進一步深入了解抗病機制和利用基因工程手段改造棉花品種抗性具有重要意義。抗病基因的獲得是選育抗病品種的重要基礎，目前通過分子生物學手段已經克隆的植物抗病基因大概有39個以上，其中抗病原真菌的大概有20多個，如擬南芥抗白粉病基因RPW8，番茄抗枯萎病基因泌Ve，高梁抗普通銹病(Puccinia Sorghi)基因Rpl_D，且在海島棉上已經克隆了 NBS-LRR類抗病基因。在常規育種上，國內外棉花育種者一直重視抗源的篩選和創造。1983-1986年李成葆等161對911份陸地棉資源進行了抗黃萎病鑑定，篩選了抗性較好的一批抗(耐)病品種。K.V.Srinvasin鑑定了 1 個海島棉品種的抗性， 結果顯示表現耐病和抗病的佔85%。無論是通過常規方法尋找抗源，還是通過分子生物學手段克隆抗病基因都已經取得了一定的進展，但還沒有找到真正防治棉花黃萎病的有效辦法。根本原因在於棉花等作物遺傳背景複雜，很難在分子水平進行更深入的研究，另外黃萎病菌〔大麗輪枝菌，Veriicillium dahliae)小種分化變異性強等原因也為抗病遺傳育種帶來重重困難。因此，研究棉花黃萎病病原大麗輪枝菌與寄主植物互作的分子機理就至關重要。根癌農桿菌是一種革蘭陰性土壤桿菌，它能夠在植物的受傷部位侵染植物細胞， 將其Ti質粒(tumor inducing plamid，腫瘤誘導質粒)上的T-DNA (transfer DNA，轉化 DNA)轉入植物細胞並整合到植物的基因組，最終導致植物腫瘤的發生。因為這一機制，根癌農桿菌及其Ti質粒被用來進行植物細胞的轉化，而且一直沿用至今。Bimdock等首次採用根癌農桿菌介導的方法進行了釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的轉化；deGroot 等也利用根癌農桿菌介導的方法成功地實現了絲狀真菌的遺傳轉化。這些開創性的工作將 AMT應用於除了植物以外的其他宿主，並為絲狀真菌的遺傳轉化開闢了一條全新而有效的途徑。隨著方法的不斷完善，根癌農桿菌將在絲狀真菌的轉化中得到越來越廣泛的應用，也為構建真菌T-DNA插入突變體庫，克隆致病相關基因，深入研究棉花黃萎病病原大麗輪枝菌與寄主植物互作的分子機理，控制黃萎病的發生奠定了基礎。

發明內容
本發明的目的在於提供一種來自大麗輪枝菌的致病相關蛋白及其編碼基因。本發明提供的致病相關蛋白，命名為VdGRPl(Glutamic acid-Rich Protein 1)， 來自大麗輪枝菌(Verticilliu dahliae Kleb.)，是如下1)或2)的蛋白質1)由序列表中序列2所示的胺基酸序列組成的蛋白質；幻將序列表中序列2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與真菌致病相關的由1)衍生的蛋白質。上述致病相關蛋白的編碼基因(命名為VdGRPl)也很屬於本發明的保護範圍之內。上述致病相關蛋白的編碼基因為如下1)-4)中任一所述的基因1)其編碼序列是序列表中序列1的自5'末端第132-407位；2)其核苷酸序列是序列表中的序列1 ；3)在嚴格條件下與1)或2、的基因雜交且編碼所述蛋白的基因；4)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的基因。上述嚴格條件可為用0. IX SSPE (或0. 1XSSC)，0. SDS的溶液，在DNA或者RNA 雜交實驗中65°C下雜交並洗膜。序列1由5 個脫氧核苷酸組成，自序列表中序列1的自5』端第132-407位核苷酸為ORF區，編碼序列2中所述胺基酸殘基序列的蛋白質，將序列2所示的蛋白命名為 VdGRPl JfVdGRPl蛋白的編碼基因命名為VdGRPl。擴增上述VdGRPl基因全長或其任一片段的引物對也屬於本發明的保護範圍。含有上述VdGRPl基因的重組載體、轉基因細胞系或重組菌也屬於本發明的保護範圍。本發明的另一目的在於提供一個DNA片段，其核苷酸序列是如下a)或b)a)序列表中序列3的第22位至240位所示的序列；b)序列表中序列3所示的序列。含有上述DNA片段的重組載體、轉基因細胞系或重組菌也屬於本發明的保護範圍；所述重組載體優選是將序列表中序列3所示的片段插入pSUlPH-TN載體的多克隆位點構成的重組載體；所述pSUlPH-TN載體是序列表中序列4所示的片段插入pSULPH-GFP質粒構成的載體。本發明的又一目的在於提供一種培育致病性降低的真菌的方法。本發明提供的方法包括如下步驟降低所述真菌中的上述VdGRPl基因的表達，得到所述致病性降低的真菌。進一步講，降低所述真菌中的上述VdGRPl基因的表達是通過將序列表中序列3所示的片段導入所述真菌中實現的。更進一步講，上述序列表中序列3所示的片段可以通過含有上述DNA片段的重組載體導入所述真菌中。上述真菌為含有述VdGRPl基因的菌，具體可為大麗輪枝菌；所述致病性為致黃萎病性。本發明的發明人通過篩選農桿菌介導的T-DNA插入技術建立的大麗輪枝菌突變體庫，獲得了致病性減弱的突變菌株vdgrpl。Southern雜交證實該突變菌株為T-DNA單插入突變體。本發明的發明人通過TAIL-PCR技術，獲得了突變基因。通過基因互補試驗，證實是該基因的突變導致了菌株vdgrpl致病性的減弱，說明該基因為真菌致病相關基因。另外，從表型上分析，基因VdGRPl與菌核的發育有一定的關係。Northern雜交證實在菌株從孢子到菌絲的整個發育階段，基因VdGRPl都有較高的表達，隨著培養時間延長成遞增之勢。基因VdGRPl在菌核期處於低表達水平狀態。在液體培養菌液中加入棉花提取液，能提高基因VdGRPl的表達。表明大麗輪枝菌侵染棉花時，該基因可能受棉花誘導，並在致病過程中可能起著一定的作用。另外，基因VdGRPl的表達還受到環境脅迫如缺糖以及高滲脅迫如高濃度NaCl、高濃度甘露醇的誘導。說明基因VdGRPl在大麗輪枝菌應對環境脅迫的過程中有著一定的功能。為了通過基因沉默技術進一步驗證基因VdGRPl的功能，本發明的發明人又構建了基因VdGRPl的RNAi敲除載體。通過農桿菌介導的轉化，本發明的發明人獲得了三株轉基因菌株。Northern雜交證實，三個RNAi敲除菌株中VdGRPl的表達下調。致病性鑑定結果表明，與野生型相比，致病性減弱。說明能夠通過基因沉默技術獲得大麗輪枝菌致病性減弱的突變體。同時也進一步說明了該基因為真菌致病相關基因。


圖1、突變菌株vdgrpl與野生型菌株V592生長性狀的比較圖示。圖2、突變菌株vdgrpl與野生型菌株V592致病性比較圖示。圖3、突變菌株vdgrpl的southern雜交圖示。圖4、不同的生長時期，VdGRPl基因表達水平的northern雜交檢測。圖5、不同的環境脅迫及高滲脅迫下，VdGRPl基因表達水平的northern雜交檢測。圖6、菌核期及棉花汁液誘導條件下，VdGRPl基因表達水平的northern雜交檢測。圖7、菌絲及孢子中VdGRPl基因表達水平的northern雜交檢測。圖8、突變菌株vdgrpl經過互補試驗獲得的互補菌株vdgrpl/VdGRPl的致病性鑑定圖示。圖1、圖2和圖8中的592是構建突變體庫所用的野生型菌株，vdgrpl是從突變體庫中篩選到的致病性減弱的突變菌株，vdgrpl/VdGRPl是把VdGRPl基因的ORF序列構建到組成型表達的啟動子下，轉入突變體vdgrpl，通過菌落生長性狀和恢復致病性鑑定的互補菌株，Control是對照。圖9、野生型菌株V592與VdGRPl RNAi敲除菌株中VdGRPl基因表達水平的 northern雜交檢測圖示。圖10、野生型菌株V592與VdGRPl RNAi敲除菌株的致病性鑑定圖示。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但本發明並不限於以下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規方法。實施例1、大麗輪枝菌突變體庫的構建大麗輪枝菌菌株V592 (菌株V592是採自新疆棉花田，記載該材料的文獻是棉花植株內黃萎病菌致病類型的快速檢測.新疆農業科學2010，47 (4) :827-831，公眾可從中科院微生物所獲得)在PDA平板上25°C培養後將孢子接種於查氏液體培養基Qg NaN03,lg KH2P04, Ig MgSO4. 7H20, Ig KCUmg FeSO4. 7H20 和 30g 蔗糖/L)中振蕩培養 5-8 天直至孢子濃度為1. OX 107mL，孢子培養液用4層無菌紗布過濾以除去菌絲。4000rpm離心IOmin得到孢子並用誘導培養基加AS (乙酞丁香酮)200mM將孢子濃度調節到1.0Χ106_7!Λ。將農桿菌(該農桿菌含PLL16質粒，PLL16質粒由美國普渡大學徐金榮教授饋贈， 現保存於本發明人實驗室，需要通過美國普渡大學徐金榮教授授權獲得)在30ml基本培養基(MM)〔含有 Kan 50mg/L, Rif 25mg/L)中培養 48h，4000rpm，離心 lOmin，沉澱用誘導培養基(IM)洗兩次，重懸農桿菌至OD值為0. 2-0. 3並加200mM AS (乙酞丁香酮)、40mM MES以及Kan (50mg/L) ,28°C, 200rpm振蕩培養6h。然後吸取100 μ L上述培養物與100 μ 1 的分生孢子懸浮液混合，潑於放在共培養基上的孔徑為45 μ m的47mm直徑的纖維素膜上， 在培養36h。用2mL基本培養基洗膜，收穫真菌和細菌培養物，然後取200兩塗於含 ΙΟΟμ g/mL氯嘧磺隆(Cholorimuron)的選擇培養基平板上，抑制農桿菌的生長，挑取單個轉化子轉至選擇培養基平板進行二次篩選並保存轉化子。實施例2、突變體vdgrpl的獲得通過菌株侵染水培棉花來鑑定突變體的致病性，從而篩選出致病性改變的突變體。挑選飽滿的棉種(新陸早-16，購於新疆石河子大學農學院)，用15%的次氯酸鈉浸泡 30min後，無菌水衝洗2-3遍，再用無菌水浸泡催芽過夜後平鋪在培養盒中保溼，待芽長至 3cm，種於發芽盒中。在泡沫板上打取直徑2cm、間距3cm的孔洞，用海綿條纏繞發芽棉子的根芽交界處，塞入泡沫板的孔洞中。將泡沫板置於盛滿清水的塑料盒(高8-lOcm)上，於 25°C，光照16h，黑暗下培養他。待真葉長出時將清水換成1/3的MS培養液，每周更換一次培養液，1片真葉展平時接種。將_80°C保存的菌株經PDA平板活化3-4d，從菌落邊緣挑取菌塊放入查氏培養液，250C，220rpm搖培5d，過濾，濾液5000g離心5min，，清水稀釋孢子，血球計數板計數，將濃度調至IX IO7個孢子/ml。將調好濃度的孢子懸浮液加入空塑料盒中， 棉苗浸根40min後接種。之後用1/3的MS培養液25°C光照16h，黑暗下繼續培養棉苗8h。 每盒中種12株苗，每個品種3個重複，對照棉苗用清水浸泡40min。通過上述方法，本發明的發明人獲得了菌核的產生及致病性均減弱的突變菌株 vdgrpl (圖 1、圖 2)。實施例3、突變基因的獲得1)、Southern雜交確定突變體T-DNA插入拷貝數(圖3)A、基因組DNA的提取方法如下在液體查氏培養基中，200rpm振蕩培養菌絲。震蕩培養的液體IOOOOrpm離心IOmin後用液氮研磨。加入500 μ L的提取緩衝液(IOOmmol/ LTris-HCl, PH8. 0,100mmol/L EDTA, 250mmol/L NaCl)，渦流使菌粉與提取緩衝液充分混合，然後加入50 μ L 20% SDS，輕搖Eppendorf管，使混合物混合均勻，置於37°C水浴lh，取出並加入75L 5mol/L NaCl，輕輕混勻，再加入65 μ L 10% CTAB及0. 75mol/LNaCl溶液，輕輕混勻，然後放入65°C水中溫育20min，取出後加入700yL氯仿/異戊醇04 1)溶液， 混勻，12000rpm離心12min，取上清液，加入2倍體積的冰凍無水乙醇，混勻後放入_20°C冰箱中至少30min，取出後在IOOOOrpm離心2min，棄上清，用70%酒精洗鹽2次，乾燥後，加入 40 μ L TE 溶解。B、提取的DNA分別用EcoR I和KpnI酶切酶切體系
權利要求
1.一種蛋白，是如下1)或幻的蛋白質1)由序列表中序列2所示的胺基酸序列組成的蛋白質；2)將序列表中序列2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與真菌致病相關的由1)衍生的蛋白質。
2.權利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.根據權利要求2所述的編碼基因，其特徵在於所述蛋白的編碼基因為如下1)-4) 中任一所述的基因1)其編碼序列是序列表中序列1的自5'末端第132-407位；2)其核苷酸序列是序列表中的序列1；3)在嚴格條件下與1)或幻的基因雜交且編碼權利要求1所述蛋白的基因；4)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼權利要求1所述蛋白的基因。
4.含有權利要求2或3所述基因的重組載體、轉基因細胞系或重組菌。
5.一個DNA片段，其核苷酸序列是如下a)或b)a)序列表中序列3的第22位至240位所示的序列；b)序列表中序列3所示的序列。
6.含有權利要求5所述DNA片段的重組載體、轉基因細胞系或重組菌；所述重組載體是將序列表中序列3所示的片段插入pSUlPH-TN載體的多克隆位點構成的重組載體；所述 pSUlPH-TN載體是序列表中序列4所示的片段插入pSULPH-GFP質粒構成的載體。
7.一種培育致病性降低的真菌的方法，包括如下步驟降低所述真菌中的權利要求2 或3所述基因的表達，得到所述致病性降低的真菌。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於降低所述真菌中的權利要求2或3所述基因的表達是通過將序列表中序列3所示的片段導入所述真菌中實現的。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於所述序列表中序列3所示的片段通過權利要求6所述的重組載體導入所述真菌中的。
10.根據權利要求7或8或9所述的方法，其特徵在於所述真菌為含有權利要求2或 3所述基因的菌，優選是大麗輪枝菌；所述致病性為致黃萎病性。
全文摘要
本發明公開了一種來自大麗輪枝菌的致病相關蛋白VdGRP1及其編碼基因。所述致病相關蛋白是如下1)或2)的蛋白質1)由序列表中序列2所示的胺基酸序列組成的蛋白質；2)將序列表中序列2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與真菌致病相關的由1)衍生的蛋白質。本發明的發明人通過篩選農桿菌介導的T-DNA插入技術建立的大麗輪枝菌突變體庫，獲得了致病性減弱的突變菌株vdgrp1。Southern雜交證實該突變菌株為T-DNA單插入突變體。本發明的發明人通過TAIL-PCR技術，獲得了引起突變表型的基因。通過基因互補試驗，證實是該基因VdGRP1的突變導致了菌株vdgrp1致病性的減弱，說明該基因VdGRP1為真菌致病相關基因。
文檔編號C12R1/91GK102212121SQ20111009042
公開日2011年10月12日 申請日期2011年4月11日 優先權日2010年4月21日
發明者周邦軍, 郭惠珊 申請人:中國科學院微生物研究所