一種製備人工子宮內膜的方法
2023-04-24 18:23:11 1
專利名稱：一種製備人工子宮內膜的方法
技術領域：
本發明屬組織工程學領域，具體涉及一種製備人工子宮內膜的方法。
近年來組織工程技術的發展為解決上述難題，建立理想的「模型」提供了可能。組織工程(tissue engineering)是生物醫學工程領域中的新方向，應用生命科學與工程學的原理和技術，研究、開發用於修復、維護、促進人體，各種組織或器官損傷後的功能和形態的生物替代物的一門新興學科。其技術核心是在可降解三維支架上通過細胞種植實現組織重建。支架材料和種子細胞是組織工程研究的重要內容。其中生物可降解的三維高分子聚合物多孔支架在組織構建中越來越受到重視。目前應用較廣泛的可降解材料主要為聚酯類(polyesteralpha)如聚羥基乙酸(polyglycolic acid PGA)、聚乳酸(polylactic acid PLA)、以及兩種單體的共聚物多聚乳酸-羥基乙酸複合體(poly DL-lactic-co-glycolic acid PLGA等。
膠原及聚乳酸羥基乙酸共聚物的交聯聚合網(Collegen-PLGApolymer mesh)是由日本東京大學工程學院發明的多孔生物可降解聚合物支架，已被用於人造皮膚的構建。
本發明應用新型生物可降解材料—膠原及聚乳酸羥基乙酸共聚物的交聯聚合網做立體支架，用分離的子宮內膜上皮細胞及基質細胞做種子細胞，通過特殊的培養方法，在體外構建人造子宮內膜。
本發明所採用的新型生物可降解材料PGLA具有良好的表面特性和適宜的孔隙率，表面包被膠原後可提高細胞的粘附及種植密度，使其具有更好的細胞相容性，使種子細胞可以進入多孔聚合物支架內部並在其上貼附和生長，同時細胞自身還可分泌細胞外基質(extracellular matrics ECM)代替生物可降解支架成為自然組織。
本發明的技術方案通過下述方法和步驟實現。
一、應用酶消化法分離及純化BALB/c小鼠子宮內膜細胞取妊娠小鼠處死，剪取雙側子宮角，放入盛有PBS的培養皿內，加入2.5％Pacreatin和0.5％Trypsin，4℃ 1.5h後，置20℃ 0.5h，旋轉，靜置，吸取下2/3細胞懸液於含有胎牛血清的離心管內，PBS衝洗子宮，吸取上清液，離心，棄上清，加入PBS漂洗，離心後得子宮內膜上皮細胞。再將子宮置於含0.05％Trypsin-0.02％EDTA離心管中，旋轉，吸取細胞懸液於含FCS離心管中，PBS衝洗子宮，吸取上清，離心，再用PBS漂洗細胞，離心後得子宮內膜基質細胞。
二、構建子宮內膜三維模型取上述對數生長期的子宮內膜上皮細胞及基質細胞，胰酶消化，製備細胞懸液。將膠原及聚乳酸羥基乙酸共聚物的交聯聚合網固定，置於培養板孔內，加入含10％胎牛血清的DMEM∶F12(1∶1)培養液，接種子宮內膜基質細胞，靜止，補加上述培養液，放入培養箱培養，然後，以同樣密度接種上皮細胞於聚合網的另一面，加培養液孵箱內培養。數日後取出支架，PBS清洗，2.5％戊二醛固定，酒精梯度脫水，乙酸異戊酯置換，臨界點乾燥，噴金，掃描電鏡觀察人工子宮內膜的超微形態。
本發明將子宮內膜細胞種植於上述生物材料後，間質細胞首先附著在聚合網上，並進入聚合網孔間生長，佔據網孔，並向網的另一面生長，上皮細胞接種後，24h細胞能在聚合網上粘附生長並與間質細胞混合；培養第5天細胞大量鋪展生長，並進入聚合網網孔間，形成多層結構，有些區域，可見融合生長；培養第14天後，細胞融合，原聚合網上包被的膠原大部分被子宮內膜細胞分泌的細胞外基質代替，形成三維結構。
結果表明，子宮內膜細胞能形成三維結構，並具備與在體子宮內膜形似的結構和形態，能分泌細胞外基質成分，模擬在體子宮內膜的形態與功能。為最終克服現有的體外模型的缺陷，構建人組織工程子宮提供新方法。
本發明人工子宮內膜克服了現有體外模型的缺陷，為最終通過組織工程學方法構建子宮提供新方法，為進一步研究胚胎著床的機理提供理想的平臺，為人流，結核等所造成的子宮內膜損傷導致不孕提供可能的治療途徑。
圖二為細胞培養第14後掃描電鏡圖，其中圖(a)放大倍數為50倍，圖(b)的放大倍數為200，可見細胞融合生長，原生物材料上包被的膠原大部分已被子宮內膜細胞分泌的細胞外基質代替，呈多層生長，形成三維結構。
具體實施例方式
實施例1、分離及純化子宮內膜細胞採用清潔級實驗動物BALB/c小鼠，周齡8-12周，體重18g-20g，雌∶雄＝1∶1合籠交配，次晨檢查陰栓，發現陰栓為孕d1天分離子宮內膜細胞應用酶消化法。取10隻妊娠d4小鼠脫頸處死，剪取雙側子宮角，縱向切開放入盛有PBS的培養皿內，加入2.5％Pacreatin和0.5％Trypsin，4℃ 1.5h後，置20℃ 0.5h，渦流旋轉器旋轉10sec，靜置5min，棄上1/3懸液，吸取下2/3細胞懸液於含有胎牛血清的離心管內，5ml PBS衝洗子宮2次，吸取上清液，1000rpm離心5min，棄上清，加入10ml PBS漂洗細胞兩次，每次離心1000rpm×5min。，離心後得子宮內膜上皮細胞。再將子宮置於含0.05％Trypsin-0.02％EDTA離心管中，37℃ 20min，渦流旋轉器旋轉10sec，吸取細胞懸液於含FCS離心管中，將5ml PBS衝洗子宮2次，吸取上清液，離心，再用10ml PBS漂洗細胞2次，離心後得子宮內膜基質細胞。所分離的子宮內膜上皮細胞及間質細胞經抗cytokeratin-18及抗desmin抗體免疫組織化學分析，分離的子宮內膜細胞純度佔90％以上。
2、構建子宮內膜三維模型將分離的子宮內膜上皮細胞及基質細胞種植於培養瓶，取對數生長期的細胞，0.5％胰酶消化37℃ 5min，製備細胞懸液用於接種。將膠原及聚乳酸羥基乙酸共聚物的交聯聚合網用自製支架固定，固定後的聚合網置於24孔培養板的培養孔內，加入含10％胎牛血清的DMEM∶F12(1∶1)培養液100ul，首先按2×105/cm2的密度接種子宮內膜基質細胞，在細胞培養箱靜止3h後，補加含10％胎牛血清的DMEM∶F12(1∶1)培養液1ml，放入培養箱培養，間質細胞在聚合網上粘附、生長。間質細胞培養72h後，再將上皮細胞以同樣密度接種於聚合網的另一面，加入培養液1ml，置5％CO2，37℃孵箱內培養，每2天更換一次培養液。
接種上皮細胞後第5天及第14天，取出支架，PBS清洗，2.5％戊二醛固定，酒精梯度脫水，乙酸異戊酯置換，臨界點乾燥，噴金，掃描電鏡觀察人工子宮內膜的超微形態。
權利要求
1.一種製備人工子宮內膜的方法，其特徵是應用生物可降解材料做支架，用動物子宮內膜細胞做種子細胞種植於生物可降解材料，體外構建人工子宮內膜。
2.按權利要求1所述的製備人工子宮內膜的方法，其特徵是所述的生物可降解材料是膠原及聚乳酸羥基乙酸共聚物的交聯聚合網。
3.按權利要求1所述的製備人工子宮內膜的方法，其特徵是所述的種子細胞為動物子宮內膜上皮和間質細胞。
4.按權利要求1和3所述的製備人工子宮內膜的方法，其特徵是所述的種子細胞細胞培養過程為將間質細胞和上皮細胞依次接種，多層培養。
5.按權利要求4所述的製備人工子宮內膜的方法，其特徵是所述的種子細胞接種密度為2×105/cm2。
6.按權利要求1所述的製備人工子宮內膜的方法，其特徵是按下述方法和步驟進行，1)用酶消化法分離及純化動物小鼠子宮內膜細胞，得子宮內膜上皮和間質細胞，2)將上述子宮內膜細胞依次種植於生物可降解材料支架不同層面，體外構建人工子宮內膜。
全文摘要
本發明屬組織工程學領域，具體涉及一種製備人工子宮內膜的方法。本發明應用新型生物可降解材料做立體支架，用實驗動物子宮內膜細胞做種子細胞，通過特殊的培養方法，在體外構建人工子宮內膜，能形成三維結構，並具備與在體子宮內膜形似的結構和形態，能分泌細胞外基質成分，模擬在體子宮內膜的形態與功能。克服了現有的體外模型的缺陷，為進一步研究胚胎著床的機理提供理想的平臺，為人流，結核等所造成的子宮內膜損傷導致不孕提供治療途徑。
文檔編號C12N5/08GK1416909SQ02150740
公開日2003年5月14日 申請日期2002年11月27日 優先權日2002年11月27日
發明者周劍萍, 劉銀坤, 張煒, 王麗 申請人:復旦大學附屬婦產科醫院