植物抗熱基因及其應用的製作方法

2023-04-25 05:00:21 1

專利名稱：植物抗熱基因及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術以及植物學領域；更具體地，本發明涉及一種植物抗熱基因及其應用。
背景技術：
溫度逆境是影響蔬菜生產和限制其地域分布的主要因子之一。由於「溫室效應」日益加劇，高溫天氣出現越來越頻繁，尤其是近年來我國長江流域夏季的持續高溫，嚴重製約糧食作物和果蔬類植物的生長和發育，農業生產面臨嚴峻挑戰。近50年中國長江流域共發生重大水稻熱害事件6次。最近一次發生在2003年，保守估計全流域受害面積達3 X IO7公頃，損失稻穀達5.18 X IO7噸[1]。20世紀80年代末，我國南方柑桔產區曾遭受3次大範圍的高溫熱潮，給果蔬生產造成了巨大的損失。逆境脅迫可以引起植物體內一系列的生理生化反應:細胞膜透性增大，胞質外滲量增加；膜脂過氧化程度加劇，MDA積累；活性氧含量增力口。植物體內啟動抗氧化酶和非酶抗氧化物質發生應答性反應，以阻止、降低或修復由高溫造成的損傷[2』3]。由此可見，逆境下的植物並不是被動承受傷害，而是主動的調節適應。正是對這種逆境的不斷適應過程，使植物在長期的進化過程中形成了完善的和複雜抗逆系統以適應不良環境。因此，對植物抗熱機理進行更深入的研究，是認識植物與環境關係和培育新的抗性品種的重要途徑之一，在理論和應用方面都有重要意義。對植物抗熱性的研究已成為目前一項重要的研究課題。受到種質資源的限制，傳統育種方法很難在短期內顯著改良非耐熱作物的抗熱性，所以通過重組耐熱物種的抗熱基因來實現提高非耐熱作物的抗熱性是現在研究的重要方向。植物體受到高溫等不良環境脅迫時，體內自身的免疫系統會及時作出應急反應，產生一系列的應急反應，其中熱激因子(Heat Shock factor, HsF)是脅迫誘導過程中的主要轉錄因子，通過轉錄激活其下遊靶基因的表達，產生各種各樣的酶類，增加了膜脂飽和度，提高了可溶性蛋白和一些保護性細胞組分的含量，保護機體蛋白質免遭損傷或修復已受損傷的蛋白質，對植物起保護作用，從而使植物獲得耐熱性，提高生物體的應激能力和在逆境中的存活率[2』3』4』5]。由於熱激因子與植物抗熱性緊密聯繫在一起，因此熱激蛋白及其下遊基因的表達調控是當今分子生物學、蛋白質生物化學和植物抗逆生理的一個重要研究內容。很遺憾的是，對於其靶基因在植物體內是如何啟動並進行抗熱生理響應的機制研究尚不清楚。近年來分子生物學研究發展迅速，尤其是基因晶片技術在作物分子育種上的應用也越來越廣泛[6』7]。其快速、敏感、高效、定量地分析基因的表達變化，滿足了對植物抗熱基因進行大通量的篩選需求。因此，本領域有必要以基因技術為平臺，篩選在植物中具有抗熱能力的基因，進行植物品種改良，提高植物耐熱性，為豐富和平衡我國農作物市場提供抗熱種質資源
發明內容
本發明的目的在於提供一類植物抗熱基因及其應用。
在本發明的第一方面，提供一種HTT多肽(Heat induced Ta-siR255 Targets)或編碼該多肽的多核苷酸的用途，用於提高植物耐熱性。在一個優選例中，所述HTT多肽選自:(a)具有 SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO:21所示胺基酸序列的多肽；或(b)將 SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQID NO:15、SEQ ID NO: 17,SEQ ID N0:19或SEQ ID NO:21所示胺基酸序列經過一個或多個(如1_50個；較佳地1-40個；較佳地1-30個；較佳地1-20個；較佳地1-10個；更佳地1_5個)胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高植物耐熱性功能的由(a)衍生的多肽；(C)與 SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQID NO:15、SEQ ID NO: 17, SEQ ID N0:19或SEQ ID NO:21所示胺基酸序列具有40% (較佳地50% ；更佳地60% ;更佳地70% ;更佳地80% ;更佳地90% ;更佳地95% ;更佳地98% )以上相同性，且具有提高植物耐熱性功能的由(a)衍生的多肽。在另一優選例中，所述的編碼HTT多肽的多核苷酸選自:具有SEQ ID NO:1，或SEQID NO:2，或 SEQ ID NO:3，或 SEQ ID NO:6，或 SEQ ID N0:7，或 SEQ ID NO:9、或 SEQ IDN0:10、或 SEQ ID N0:14，或 SEQ ID N0:16，或 SEQ ID N0:18、或 SEQ ID NO:20 所示核苷
酸序列的多核苷酸。在另一優選例中，所述的植物選自:十字花科植物；更佳地選自芸苔屬植物或鼠耳芥屬植物；更佳地選自白菜(Brassica.rapa)或擬南芥(Arabidopsis thaliana)。在本發明的另一方面，提供一種多核苷酸，選自下組:
(a)具有SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列的多核苷酸；或(b)將SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列中第11_14位核苷酸經過一個或多個(如1-8個；較佳的1-6個，更佳的1-5個，如2、3、4個)核苷酸的取代、缺失或添加而形成的，且具有拮抗ta-siR255與編碼HTT多肽的mRNA結合的功能的多核苷酸；或(c)將SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列中第236-239位核苷酸經過一個或多個(如1-8個；較佳的1-6個，更佳的1-5個，如2、3、4個)核苷酸的取代、缺失或添加而形成的，且具有拮抗ta-siR255與編碼HTT多肽的mRNA結合的功能的多核苷酸；或(d)與上述(a)、(b)、(C)中所述核苷酸互補的核苷酸序列。在本發明的另一方面，提供所述的多核苷酸的用途，用於提高植物耐熱性。在一個優選例中，所述植物選自:十字花科植物；更佳地選自芸苔屬植物或鼠耳芥屬植物；更佳地選自白菜(Brassica.rapa)或擬南芥(Arabidopsis thaliana)。在本發明的另一方面，提供一種提高植物耐熱性的方法，所述方法包括:提高植物中HTT多肽的表達或活性；或降低植物中ta_siR255的表達或活性；或提高植物中ta_siR255的靶基因的表達。在一個優選例中，所述的方法包括:將編碼HTT多肽的多核苷酸轉入植物中；或將所述的多核苷酸轉入植物中。在另一優選例中，所述的方法包括步驟:(i)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有編碼HTT多肽的多核苷酸或所述的多核苷酸；(ii)將植物細胞、組織或器官與步驟(i)中的農桿菌接觸，從而使所述編碼HTT多肽的多核苷酸或所述的多核苷酸轉入植物。在另一優選例中，所述方法還包括:(iii)選擇出轉入了所述編碼HTT多肽的多核苷酸或所述的多核苷酸的植物細胞、組織、器官；以及(iv)將步驟(C)中的植物細胞、組織、器官再生並選出轉基因植物。在另一優選例中，所述植物選自:十字花科植物；更佳地選自芸苔屬植物或鼠耳芥屬植物；更佳地選自白菜(Brassica.rapa)或擬南芥(Arabidopsis thaliana)。在本發明的另一方面，提供一種耐熱的植物，其是由前述方法製備獲得的轉基因植物。在本發明的另一方面，提供一種HTT多肽或編碼該多肽的多核苷酸的用途，用作鑑定植物的耐熱性的分子標記物。本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖認1A-C,HTTl、HTT2、HTT3、At4G29760和AtlG51670的表達分析。其中，ck 表示
野生型植株。圖1D、HTTl、HTT2、HTT3、At4G29760和AtlG51670以及其它候選基因的聚類關係分析。圖2、HTT1、HTT2和HTT3的序列特徵分析。A、HTT1、HTT2 和 HTT3 的 mRNA 上均存在 ta_siR255 的結合位點。B、MM255過表達載體的構建示意圖。C、HTT1.1、HTT2 和 HTT3 啟動子上均存在 nnGAAnnTTCnnGAAnn 和 AGGGG 基序。圖3、HTT1、HTT2和HTT3過量表達的轉基因株系熱處理實驗。A-C過量表達的轉基因株系熱處理後的植株生長情況，各自的左圖表示植物生長情況，右圖為左圖中各分區所代表的植株的示意圖。D-G、定量RT-PCR分析mRNA在對照植株以及過表達植株中的積累量。圖4A、Ta-siR255前體TASla、TASlb, TASlc在熱處理前後的響應。圖4B、Ta-siR255在熱處理前後的響應。圖5A、HTTl和HTT2過表達株系熱處理後植株存活率。圖5B、HTT3過表達株系熱處理後植株存活率。圖5C、MIM255過表達株系熱處理後三個株系存活率。圖6、擬南芥中HTT多肽與白菜中相應多肽的同源性預測和分析。
具體實施例方式本發明人致力於抗熱基因的篩選，最終確定了一類能夠明顯提高植株抗熱能力的抗熱基因。這些抗熱基因可應用於抗熱分子育種，提高植物耐熱性，獲得品種改良的植物。
本發明中，對於適用於本發明的植物沒有特別的限制，只要其適合進行基因的轉化操作，如各種農作物、花卉植物、或林業植物等。所述的植物比如可以是(不限於):雙子葉植物、單子葉植物、或裸子植物。更具體地，所述的植物包括(但不限於):小麥、大麥、黑麥、7jC稻、玉米、高梁、甜菜、蘋果、梨、李、桃、杏、樓桃、草莓、木莓、黑莓、豆、扁豆、豌豆、大豆、油菜、芥、罌粟、齊墩果、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生、葫蘆、黃瓜、西瓜、棉花、亞麻、大麻、黃麻、柑桔、梓檬、葡萄柚、菠菜、苘苣、蘆笑、洋白菜、大白菜、小白菜、胡蘿
卜、洋蔥、土豆、西紅柿、青椒、鱷梨、桂皮、樟腦、菸葉、堅果、咖啡、茄子、甘蔗、茶葉、胡椒、葡萄樹、蠔麻草、香蕉、天然橡膠樹和觀賞植物等。作為一種優選方式，所述的「植物」包括但不限於:十字花科、禾本科、薔薇科的植物。比如，所述的「植物」包括但不限於:十字花科蕓薹屬的大白菜、小白菜；十字花科鼠耳芥屬植物；禾本科的水稻、小麥、高粱、玉米；此外還包括菸草、瓜果、蔬菜、油菜等等。更佳地，所述的「植物」是十字花科蕓薹屬或鼠耳芥屬的植物。如本文所用，「分離的」是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。如本文所用，「HTT多肽」是指來源於擬南芥或其它植物的與序列SEQ IDNO:4、SEQID NO:5,SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO: 15,SEQID NO:17、SEQ ID NO:19 或 SEQID NO:21具有較高同源性(如同源性高於40% ;較佳地高於50% ;較佳地高於60% ;更佳地高於70% ;更佳地高於80% ;更佳地高於90% ;更佳地高於95% ;更佳地高於98% )的一類多肽的總稱。如本文所用，所述的「含有」，「具有」或「包括」包括了「包含」、「主要由......構
成」、「基本上由......構成」、和「由......構成」；「主要由......構成」、「基本上
由......構成」和「由......構成」屬於「含有」、「具有」或「包括」的下位概念。本發明的多肽(蛋白)可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發明還包括HTT多肽的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語「片段」、「衍生物」和「類似物」是指基本上保持本發明的多肽相同的生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性胺基酸殘基(優選保守性胺基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的胺基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個胺基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的胺基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根據本文的定義這些片段、衍生物和類似物屬於本領域熟練技術人員公知的範圍。
任何一種HTT多肽的生物活性片段都可以應用到本發明中。在這裡，所述的生物活性片段的含義是指作為一種多肽，其仍然能保持相應的全長多肽的全部或部分功能。通常情況下，所述的生物活性片段至少保持40 %的全長多肽的活性。在更優選的條件下，所述活性片段能夠保持全長多肽的50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、或100%的活性。在本發明中，所述的「HTT多肽」指具有提高植物耐熱性功能活性的SEQID NO:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11序列的多肽。該術語還包括具有與所述多肽相同功能的、上述序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於):若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個，還更佳如1-8個、1_5個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變多肽的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變多肽的功能。該術語還包括所述多肽的活性片段和活性衍生物。多肽的變異形式包括:同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴謹度條件下能與上述蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗所述蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。任何與所述的多肽同源性高的、且具有提高植物耐熱性功能的多肽也包括在本發明內。發明還提供所述蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然蛋白的差別可以是胺基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露於誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定`點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同於天然L-胺基酸的殘基(如D-胺基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的胺基酸(如β、Y-胺基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽並不限於上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級結構)形式包括:體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙醯化或羧基化。修飾還包括糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化胺基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。在本發明中，「本發明的多肽的保守性變異多肽」指與SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21的胺基酸序列相比，有至多50個，較佳地至多40個，更佳地至多30個，更佳地至多20個，更佳地至多10個，更佳地至多5個，最佳地至多3個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表I進行胺基酸替換而產生。表I
權利要求
1.一種HTT多肽或編碼該多肽的多核苷酸的用途，用於提高植物耐熱性。
2.如權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述HTT多肽選自:(a)具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO: 17, SEQ ID N0:19或SEQ ID NO:21所示胺基酸序列的多肽；或(b)將SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQID NO:15、SEQID NO:17、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO:21所示胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高植物耐熱性功能的由(a)衍生的多肽；(c)與SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQID NO:15、SEQID NO: 17、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO:21所示胺基酸序列具有40%以上相同性，且具有提高植物耐熱性功能的由(a)衍生的多肽。
3.如權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述的編碼HTT多肽的多核苷酸選自:具有SEQ ID NO:1，或 SEQ ID NO:2，或 SEQ ID NO:3，或 SEQ ID NO:6，或 SEQ ID NO:7，或 SEQID NO:9、或 SEQ ID NO: 10、或 SEQ ID NO: 14，或 SEQ ID NO: 16，或 SEQ ID NO: 18、或 SEQID NO:20所示核苷酸序列的多核苷酸。
4.如權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述的植物選自:十字花科植物；更佳地選自芸苔屬植物或鼠耳芥屬植物；更佳地選自白菜(Brassica.rapa)或擬南芥(Arabidopsisthaliana)。
5.一種多核苷酸，選自下組 : (a)具有SEQID NO:23或SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列的多核苷酸；或 (b)將SEQID NO:23所示的核苷酸序列中第11-14位核苷酸經過一個或多個核苷酸的取代、缺失或添加而形成的，且具有拮抗ta-siR255與編碼HTT多肽的mRNA結合的功能的多核苷酸；或 (c)將SEQID NO:24所示的核苷酸序列中第236-239位核苷酸經過一個或多個核苷酸的取代、缺失或添加而形成的，且具有拮抗ta-siR255與編碼HTT多肽的mRNA結合的功能的多核苷酸；或 (d)與上述(a)、(b)、(c)中所述核苷酸互補的核苷酸序列。
6.如權利要求5所述的多核苷酸的用途，其特徵在於，用於提高植物耐熱性。
7.如權利要求6所述的用途，其特徵在於，所述植物選自:十字花科植物；更佳地選自芸苔屬植物或鼠耳芥屬植物；更佳地選自白菜(Brassica.rapa)或擬南芥(Arabidopsisthaliana)。
8.一種提高植物耐熱性的方法，所述方法包括:提高植物中HTT多肽的表達或活性；或 降低植物中ta-siR255的表達或活性；或 提高植物中ta-siR255的靶基因的表達。
9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述的方法包括:將編碼HTT多肽的多核苷酸轉入植物中；或 將權利要求5所述的多核苷酸轉入植物中。
10.如權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述的方法包括步驟: (i)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有編碼HTT多肽的多核苷酸或權利要求5所述的多核苷酸；( )將植物細胞、組織或器官與步驟(i)中的農桿菌接觸，從而使所述編碼HTT多肽的多核苷酸或權利要求5所述的多核苷酸轉入植物。
11.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述植物選自:十字花科植物；更佳地選自芸苔屬植物或鼠耳芥屬植物；更佳地選自白菜(Brassica.rapa)或擬南芥(Arabidopsisthaliana)。
12.—種 HTT多肽或編碼該多肽的多核苷酸的用途，用作鑑定植物的耐熱性的分子標記物。
全文摘要
本發明涉及植物抗熱基因及其應用。本發明公開了能夠明顯提高植株抗熱能力的抗熱基因，這些抗熱基因可應用於抗熱分子育種，提高植物耐熱性，獲得品種改良的植物。
文檔編號C12N15/84GK103172716SQ20111044304
公開日2013年6月26日 申請日期2011年12月26日 優先權日2011年12月26日
發明者何玉科, 李曉榮, 孫傳寶 申請人:中國科學院上海生命科學研究院