中國冬蟲夏草真菌及其人工培養方法
2023-04-24 18:45:26
專利名稱:中國冬蟲夏草真菌及其人工培養方法
本發明的目的在於解決中國冬蟲夏草的人工培養問題。
中國冬蟲夏草(Cordyceps Sinensis〔Berk〕Sacc)是一種名貴的野生藥用和食用菌類植物。它的純培養真菌從未被真正的分離到。本發明得到的這一微生物新種的分生孢子世代分類上屬半知菌綱(Fungi Impergecti)從梗孢目(Moniliales)、從梗孢科(Moniliaceae)、頭孢子菌屬(Cephalosporium)定名為冬蟲夏草頭孢菌」學名Cephalospores Dongchongxiacae SP.nev冬蟲夏草屬(Cordyceps)在全世界已發現並鑑定的種有三百多個，但對生長在青藏高原的中國冬蟲夏草雖在一百多年前就被命名為C.Sinensis(Berk)Sacc，但其真菌因未被真正分離倒，使其分生子世代(無性世代)的分類地位一直沒有得到解決。國內外的許多研究都把分離到的雜菌或冬蟲夏草屬的其它種，誤認為是中國冬蟲夏草真菌。本發明澄清了這一錯誤。
本發明在獲得真正的中國冬蟲夏草的同時，研究出了它的人工培養方法。
其菌種的分離有兩種方法一是組織分離法採集未成熟的新鮮冬蟲夏草(最好是子座還未長出地面的)，洗淨，用無菌水多次衝洗，放入0.1%升汞溶液中消毒5分鐘，用滅菌蒸溜水洗去升汞，在無菌條件下，切去外皮，避開腸道，切取白淨組織，剪碎，接於分離培養基表面，置於5～20℃溫度條件下培養，此法簡單易行，如材料不理想，培養溫度不適宜或消毒不徹底，容易長出其它共生菌或互生菌。
一種是子囊孢子培養法將尚未成熟的野生天然蟲草移栽到有保護條件圃中，用消毒紙袋套在它的子座上，使彈出的子囊孢子附著在紙袋上，收取紙袋陰乾，放在冰箱中備用。淨化時將附有子囊孢子的紙袋浸於土壤浸出液中，浸透後用小刀將子囊孢子刮下，收集於離心管中，離心分離，棄去上部清液，用土壤浸出液反覆洗滌，再用蔗糖溶液洗滌，反覆離心分離，收集浮於液面的子囊孢子，再用土壤浸出液洗滌，放入冰箱中備用。萌發時取淨化的子囊孢子少許，放入含慶大黴素的土壤浸出液中，室溫培養三到六天，子囊孢子即可萌發，用滅菌吸管吸取已萌發的子囊孢子稀懸液，滴在瓊脂平板上，在顯微鏡下挑取單個萌發孢子，接種在分離培養基上室溫培養，此法麻煩，初生長緩慢，但可靠性高。
上述兩種方法使用的分離培養基最好的配方是葡萄糖50克、水解乳蛋白10克、酵母膏1克，硫酸鎂0.5克、磷酸二氫鉀1克，維生素液20毫升、瓊脂20克、蒸溜水1000毫升，最好再加20%蟲草蝙蝠蛾幼蟲浸出液。
新鮮組織塊培養接種一周後，周圍長出細小菌絲，兩個月後形成菌落三到四個月菌落直徑可達1～2釐米，淨化子囊孢子培養接種10天後，孢子芽管伸長、分枝，形成菌絲，兩個月菌落直徑2～6毫米，三個月可見很短的灰白色氣中菌絲，四個月菌落直徑達1～2釐米，並有棕黑色色素擴散於培養基中。
將上述方法獲得的蟲草真菌，接種於特殊培養基上(編號為S31)培養基配方為肉水500毫升、水解乳蛋白5克、酵母1克、葡萄糖30克、磷酸氫二鉀1克、硫酸鎂0.2克、瓊脂18克、核酸0.5克牛奶200毫升、蒸溜水400毫升，5～20℃溫箱中培養一段時間長好後，移入5℃左右冰箱中，四個月後可看到小子座長出，移出室溫培養一、二個月後小子座可長到2～3釐米，顏色、形態與天然蟲草子座基本一樣。將上述培養出的子座，用黑光燈照射，彈射出的子囊孢子的形態，大小與天然蟲草的子囊孢子完全一樣。
還可採用液體發酵方法加快菌絲的培養，其液體培養基有蠶蛹培養基(蠶蛹粉、葡萄糖、蛋白腖、硫酸鎂、磷酸氫二鉀和水);肝湯培養基(肝湯、洋芋湯、葡萄糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、複合維生素B和水)等。獲得的人工蟲草菌絲經藥理藥化對比試驗和天然蟲草基本一樣。
中國冬蟲夏草真菌菌種的鑑別，可從菌落形態、培養基和基中菌絲顏色，分生孢子的形態、顏色、大小等方面觀察，在不同培養基中菌絲形態不同，一種短小，分枝較小;一種為絨毛狀，有較長的白色菌絲，呈不規則的樹枝狀，它們形成的菌落凸起，最初表面平滑堅硬，後變皺摺不平，顏色從灰白轉向棕色，氣中菌絲極短，基中菌絲棕黑色，並有棕黑色素在培養基中擴散，而其它雜菌底色多數為黃色、紅色或無色，菌絲在兩個月以上長出分生孢子，單生無色，或雙生、數個直至十多個呈頭狀生長，分生孢子是橢園形，其梗往往呈直角或銳角生長在菌絲上，呈細長瓶狀，一般不分枝，也有少數2～5個分枝。
上述方法的一個實例是從化隆縣挖來的新鮮蟲草一株，洗淨，用無菌水反覆衝洗，放入0.1%的升汞液中消毒5分鐘，用無菌水洗去升汞，在無菌條件下，切取內部白色組織。剪碎。接種在分離培養基表面，放在5～20℃溫箱中一周後長出了菌絲，兩個月後形成凸起硬殼的菌落。經擴大繁殖培養後將其移入前述編號為S31生長子座的培養基上繼續培養，先在5～20℃溫箱中培養一個月，然後移入5℃左右冰箱中，四個月後開始有尖細的子座長出。再移到有散射陽光的實驗臺上繼續培養，一兩個月後，子座可達2～3釐米長，顏色、形態與天然蟲草的子座基本一樣，將成熟的子座用20瓦黑光燈間歇照射，個別子座彈射出了子囊孢子，經鑑別，其形態、大小與天然生長的完全一樣。
權利要求
1.中國冬蟲夏草(簡稱蟲草)是一種藥用和食用的珍貴的菌類植物，目前世界上發現並鑑定的蟲草真菌有三百多個種。中國冬蟲夏草真菌是上述三百多個種其中的一個種，為頭孢菌屬，其特徵在於它是以天然蟲草組織或孢子為接種材料，在培養基中培養出來的蟲草真菌。
2.如權利要求
1所述的蟲草真菌，其特徵在於真菌菌絲在不同培養基中的形態不同，一種短小、分枝較少;一種為絨毛狀，有較長白色菌絲，有隔呈不規則的樹枝狀。形成的菌落凸起，最初表面平滑堅硬，後變皺摺不平，顏色從灰白轉向棕色，並有棕黑色素的擴散。
3.如權利要求
1或2所述的蟲草真菌，其特徵在於真菌菌絲兩個月以上長出分生孢子，單生無色或雙生、數個直至十多個呈頭狀生長，為長園形，其柄不規則的生長在菌絲上，呈細長瓶狀，一般不分枝，也有少數2～5個分枝。
4.蟲草屬的其他種，目前已有將其菌接種於糖類、蛋白質、維生素、核酸等並添加穀物為基質的培養基中進行培養，然後將固體培養基上生長出來的菌絲移入糖類，蛋白質、維生素、核酸等並添加胺基酸以水為基質的液體培養基中，繼續培養，形成菌座的人工培養方法。中國冬蟲夏草真菌的人工培養方法，其特徵在於以天然蟲草組織或孢子為材料，接種於葡萄糖、蛋白腖為主的分離培養基上，溫度在5～～20℃範圍內，培養一～二個月，將純分離物轉接入特殊培養基中，仍在5～20℃條件下繼續培養一段時間，然後移入5℃左右的冰箱中，四個月後有子座原基形成待長到1～2釐米後，再移到有散射陽光的室溫下繼續培養一～兩個月，長成與天然蟲草形態，顏色一樣的子座。
5.如權利要求
4所述蟲草真菌的人工培養方法，其特徵在於分離培養基的最佳配方是葡萄糖50克、水解乳蛋白10克、酵母膏1克、硫酸鎂0.5克、磷酸二氫鉀1克、維生素20毫升、瓊脂20克、蒸溜水1000毫升、蟲草蝙蝠蛾幼蟲浸出液若干。
6.如權利要求
4所述蟲草真菌的人工培養方法，其特徵在於特殊培養基的配方是肉水500毫升、水解乳蛋白5克、酵母膏1克、葡萄糖30克、磷酸二氫鉀1克、硫酸鎂0.2克、瓊脂18克、核酸0.5克、牛奶200毫升、蒸溜水400毫升。
專利摘要
中國冬蟲夏草是一種珍貴的野生藥用和食用菌類植物。本發明從野生天然蟲草上採用組織培養和子囊孢子培養的不同方法，獲得與天然蟲草性質形狀一樣的蟲草真菌。在無菌器皿中人工培養，能長出與天然蟲草一樣的子座及與天然蟲草完全一樣的子囊孢子。從而證實分離到的是真正的中國冬蟲夏草C.Sinensis真菌。人工蟲草菌絲經藥理藥化對比試驗與天然蟲草基本一樣，為人工培育和廣泛應用提供了有效的方法。
文檔編號C12N3/00GK85101971SQ85101971
公開日1987年3月4日 申請日期1985年4月1日
發明者沈南英, 張生民, 曾璐, 張顯恥, 魏世錄 申請人:青海省畜牧獸醫科學院導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan