一種聚唾液酸水解液的脫色方法
2023-05-23 01:59:16 2
專利名稱：一種聚唾液酸水解液的脫色方法
技術領域：
一種聚唾液酸水解液的脫色方法，屬於生物工程技術領域。
背景技術：
唾液酸又稱燕窩酸，化學名為N-乙醯神經氨酸，因是燕窩的主要成分而得名。唾液酸在自然界分布很廣，主要通過2-位異頭碳的羥基以α-糖苷鍵連接在糖蛋白、糖脂和寡糖的末端，具有重要的生物學功能，唾液酸還是母乳的重要成分之一。唾液酸能有效抑制感冒病毒和一些病原微生物入侵紅細胞。唾液酸的類似物Zanamivir(N-乙醯基-2，3-二脫氧-4-胍基唾液酸)和達菲(Tamiflu)已經被美國食品與藥品管理局(FDA)批准為治療流感的新藥，並已經上市。唾液酸的衍生物SialylLewisX可作為抗粘附藥物，能有效治療類風溼關節炎、膿毒性休克等疾病。
唾液酸的生產主要以發酵法、酶法合成、天然產物提取法為主，但以發酵法生產唾液酸最為經濟，發酵法得到的產物是聚唾液酸，需要水解後才能得到唾液酸單體。聚唾液酸在水解過程中，產生了大量深棕紅色的色素，部分唾液酸也可能在高溫強酸性條件下被破壞生成其它雜質，這既影響了唾液酸產品的色澤，又影響了唾液酸產品的純度，因此需要用適當的方法進行脫色處理。
聚唾液酸傳統的脫色方法是採用樹脂吸附和有機溶劑萃取，雖然這兩種方法都能在一定程度上去除色素，但仍存在著一些問題1、唾液酸含有羧基離子，陽離子樹脂對唾液酸的吸附性較差，可以保證對唾液酸的回收率，但色素的吸附能力相當有限，選擇性不高。
2、唾液酸不溶於乙醚、氯仿等有機溶劑，而有機溶劑能去除一些色素，但聚唾液酸水解液中還存在著許多水溶性的色素，無法用有機溶劑萃取去除，因此需要尋找一些更有效的脫色方法。
發明內容
本發明的目的是提供一種聚唾液酸水解液的脫色方法，以降低聚唾液酸水解液中的色素，使提取得到的唾液酸具有更好的質量，增加市場競爭優勢。
本發明的技術方案一種聚唾液酸水解液的脫色方法，通過好氧培養一株產聚唾液酸的菌株大腸桿菌WXJYL-11(該菌種已在《無錫輕工大學學報》，2002，9(5)456-459.公開)，在15L全自動發酵罐中，裝液量9L，通風量10L/min，發酵罐攪拌轉速500r/min，接種量4％(v/v)，保持罐壓0.01MPa，37℃發酵60小時得聚唾液酸發酵液。
所用的培養基為山梨醇40g/L，氯化銨4g/L，磷酸氫二鉀20g/L，無水硫酸鎂0.9g/L，胰蛋白腖1.5g/L，pH 7.8。
聚唾液酸發酵液經8000r/min離心10min後去除菌體，上清液中加入3倍乙醇沉澱，經離心後得到聚唾液酸，用去離子水重新溶解聚唾液酸沉澱物，配製成質量濃度為2％的聚唾液酸溶液。
加無機酸水解用5％～10％(v/v)濃度的無機酸溶液(如硫酸或鹽酸)將聚唾液酸溶液的pH調至1.0～2.0，水浴加熱至75～85℃，維持該溫度2～4h水解得到唾液酸單體。
中和流加鹼溶液(如氫氧化鋇或氫氧化鈉)至溶液的pH為7.0，7000轉/分鐘離心15分鐘除去沉澱物，得唾液酸上清液。
填料預處理將50克凹凸棒石填料用水浸潤、懸浮後裝入Φ40×250mm的層析柱中，對填料進行酸洗(0.5％～1.5％鹽酸浸泡6小時)、水洗(清水洗滌至pH中性)、得到預處理的凹凸棒石填料。
上樣取1～2升中和、離心後的聚唾液酸水解後的上清液以每分鐘0.01～0.2填充床體積的速率泵入層析柱進行脫色處理，收集流出的層析液。
淋洗樣品處理後再泵入100～300毫升去離子水，淋洗層析柱，收集流出的層析液。
冷凍乾燥合併層析液後經冷凍乾燥後得到唾液酸產品。
較優的聚唾液酸水解液的上樣速率為每分鐘0.01～0.1填充床體積。
本發明的有益效果聚唾液酸水解液經過凹凸棒石的吸附層析處理後，得到無色的澄清溶液，經冷凍乾燥後得到白色粉末的唾液酸產品，經測定，吸附層析操作過程中，色素去除率為95.3％，而唾液酸的回收率達到97.2％，這說明凹凸棒石對聚唾液酸水解液中的色素具有高度的選擇性，而基本上不吸附唾液酸。通過凹凸棒石處理，除去了色素類雜質，不但提高了唾液酸的純度，還提高了唾液酸的產品質量。由於凹凸棒石是一種較為廉價的色素吸附劑，增加吸附層析操作，增加的生產成本相對於唾液酸的價格而言是很少的，但產品質量的提高，將有助於提高唾液酸的市場競爭力。
具體實施例方式
實施例1.聚唾液酸發酵液的製備菌株大腸桿菌(Escherichia coli)WXJYL-11江南大學生物工程學院生化工程實驗室保藏和提供，該菌株已在《無錫輕工大學學報》，2002，9(5)456-459.公開。
所用的培養基為山梨醇40g/L，氯化銨4g/L，磷酸氫二鉀20g/L，無水硫酸鎂0.9g/L，胰蛋白腖1.5g/L，pH 7.8。
利用9L發酵培養基，在15L Biostat C10-3機械攪拌罐上進行發酵，接種量4％，發酵罐攪拌轉速500r/min，通風量為10L/min，保持罐壓0.01MPa，發酵溫度37℃。發酵60小時得聚唾液酸發酵液，測定聚唾液酸含量2.7g/L。
實施例2.聚唾液酸水解液的製備將實施例1得到的9L聚唾液酸發酵液在8000r/min離心10min後去除菌體，上清液中加入3倍乙醇沉澱，經離心後得到聚唾液酸，再加入去離子水重新溶解，配製成質量濃度為2％的聚唾液酸溶液。用5％～10％(v/v)濃度的無機酸溶液(如硫酸或鹽酸)將聚唾液酸溶液的pH調至1.0～2.0，水浴加熱至75～85℃，維持該溫度2～4小時水解得到唾液酸單體。流加鹼溶液(如氫氧化鋇或氫氧化鈉)至溶液的pH為7.0，7000r/min離心15分鐘除去沉澱物，得唾液酸上清液。
實施例3.唾液酸水解液的脫色和產品製備將50克凹凸棒石填料用水浸潤、懸浮後裝入Φ40×250mm的層析柱中，對填料進行酸洗(0.5～1.5％鹽酸浸泡6小時)、水洗(清水洗滌至pH中性)得到預處理後的凹凸棒石填料。取1～2升中和、離心處理後的唾液酸上清液，以每分鐘0.01～0.2層析柱體積的速率泵入層析柱進行脫色處理，收集流出液。樣品處理後再泵入100～300毫升去離子水，淋洗層析柱，收集流出的層析液。合併層析液後經冷凍乾燥後得到唾液酸產品。較優的聚唾液酸水解液的上樣速率為每分鐘0.01～0.1填充床體積。經測定，樣品的色素去除率為95.3％，而唾液酸的回收率達到97.2％。
權利要求
1.一種聚唾液酸水解液的脫色方法，包括以聚唾液酸的發酵液為原料，經去除菌體，用乙醇沉澱，用去離子水重新溶解配製成質量濃度為2％的聚唾液酸溶液，再經酸水解、鹼中和、離心，其特徵是離心後的聚唾液酸水解液通過以凹凸棒石為填料的層析柱進行吸附層析，淋洗，收集層析液，冷凍乾燥後得唾液酸產品，工藝為填料預處理將50克凹凸棒石填料用水浸潤、懸浮後裝入Φ40×250mm的層析柱中，對填料用0.5％～1.5％體積濃度的鹽酸浸泡6小時進行酸洗，再用清水洗滌至pH中性，得到預處理的凹凸棒石填料；上樣取1～2升中和、離心後的聚唾液酸水解液以每分鐘0.01～0.2填充床體積的速率泵入層析柱進行脫色處理，收集流出的層析液；淋洗樣品處理後再泵入100～300毫升去離子水，淋洗層析柱，收集流出的層析液；冷凍乾燥合併層析液後經冷凍乾燥後得到唾液酸產品。
2.根據權利要求1所述的脫色方法，其特徵在於所述聚唾液酸水解液的上樣速率為每分鐘0.01～0.1填充床體積。
全文摘要
一種聚唾液酸水解液的脫色方法，屬於生物工程技術領域。本發明以一株大腸桿菌經好氧發酵得到聚唾液酸發酵液，經去除菌體，用乙醇沉澱，用去離子水重新溶解配製成質量濃度為2％的聚唾液酸溶液，再經酸水解、鹼中和、離心，離心後的聚唾液酸水解液通過以凹凸棒石為填料的層析柱進行吸附層析，淋洗，收集層析液，冷凍乾燥後得唾液酸產品。水解後的唾液酸溶液中含有較多深棕紅色的雜質，該溶液經過凹凸棒石吸附層析技術處理後冷凍乾燥，得到精製的白色粉末唾液酸產品。
文檔編號C07H5/06GK1916010SQ20061004140
公開日2007年2月21日 申請日期2006年9月1日 優先權日2006年9月1日
發明者詹曉北, 鄭志永, 吳劍榮, 朱莉 申請人:江南大學