通過使用脈衝電場進行生物細胞的膜透化的方法
2023-05-23 01:57:41
專利名稱：通過使用脈衝電場進行生物細胞的膜透化的方法
技術領域：
本發明涉及一種通過使用脈衝電場進行生物細胞的膜透化的方法。該方法最特別地發現其在巴氏滅菌領域中的應用，即用於處理食品(如牛奶、奶油、啤酒、果汁)的領域，包括破壞微生物，特別是最初在這些產品中存在的病原體。因此本發明的領域是生物細胞的膜透化，尤其是通過巴氏滅菌破壞生物細胞。
背景技術：
巴氏滅菌技術已成為現有技術中許多研究的對象，尤其是對於長保質期產品的開發，其要求微生物的存在非常低，以能夠長期使用。通常，巴氏滅菌包括在規定的時間將食品加熱到規定的溫度，以便超過在食品變質開始時病原菌的耐熱閾值，然後在溫度(3°C至4°C )下迅速冷卻所述加熱的食品，以便防止未破壞的細菌的繁殖。這種傳統原理已成為屬於該處理(所謂的「熱處理」)種類的許多替代物的主題。用於巴氏滅菌的熱處理可以包括使用以下媒介(means)作為熱載體-電磁輻射，如紅外輻射、微波輻射；-來自在管內產生的焦耳效應現象的熱量，其中待進行巴氏滅菌的產品在所述管內流動；-由流過待進行巴氏滅菌的產品的電流產生的歐姆熱量。通過熱途徑實現的巴氏滅菌溫度通常在70°C至85°C的範圍內。然而，在這些溫度範圍內處理後，某些病原形式如孢子可能生存，不適合旨在用於食品的產品。為了破壞這些病原形式，一種解決方案可以包括將食品加熱至比上述範圍更高的溫度(例如在高於90°C的溫度)。然而，更高溫度的使用不可避免地伴隨所處理產品的變性，如產品中存在的蛋白質的變性，其在不損失產品的味覺特性的情況下，通常並不發生。為了尋找對這些缺點的補救措施，建議採取所謂的「低溫」法，以便保持產品的原始味道。這些方法包括採取用於將病原菌除去而不是使用加熱，允許在不超過60°C的溫度下處理食品的媒介(手段)。這些媒介可以包括電離輻射，使用高壓、脈衝光，使用氣體如二氧化碳。考慮到已提議過關於膜透化的方法，尤其是巴氏滅菌法，作者建議開發一種用於膜透化的新方法，當用於對食品進行巴氏滅菌時，該方法可明顯提高不期望的細胞的死亡率。
發明內容
因此根據第一個目的，本發明涉及一種用於包含在產品中的生物細胞的膜透化方法，所述方法在包括發射脈衝電場的至少一個處理室的處理裝置中應用，所述方法包括以下步驟-以預定的供給速率，從包括所述產品的供給單元中向處理裝置提供包括所述生CN 102387717 A
說明書
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物細胞的產品的步驟；-以相應於向上述供給速率加上在下面的抽出步驟中所提及的抽出速率 (drawing-off rate)的引入速率，將包括所述生物細胞的產品引入到所述處理室中的步驟；-用脈衝電場來處理引入所述室中的所述產品的步驟；-以預定的抽出速率用於所述室出口處的產品的抽出步驟，以便將所述產品再次轉運至所述室的上遊以及所述供給單元的下遊。應當理解，本發明的方法是用於生物細胞的膜透化的體外方法，S卩，施加有位於動物有機體外的產品。發明人驚奇地注意到，與在上述室中包括一個或多個產品通道而未使用如上所述的抽出步驟的方法相比，本發明的方法提供了獲得細胞的膜透化的顯著增加的可能性，並且其具有至少一個處理室(根據細胞的死亡率來量化所述增加)，並且其使用相同的比能量。根據本發明，在本方法範圍內處理的細胞可以為原核細胞、真核細胞，這些細胞可以是活的或死亡的，整體的或部分的，以及動物或植物來源的細胞。特別地，這些細胞可以來自單細胞或多細胞有機體，如細菌(特別是真細菌)、真菌(特別是黴菌、酵母菌(如釀酒酵母)、黴菌、藻類(特別是微藻)、病毒和朊病毒。它們也可以是細胞內的細胞器或細胞內部的化合物，如線粒體、病毒、蛋白質、朊病毒。細胞可以處於生長期或休眠期(因為其可以是針對孢子的情況，如細菌孢子)。待處理的細胞包括在產品中，所述產品可以為液態食品，如果汁、蔬菜汁、牛奶、 水。此外，包括所述細胞的產品可以包含組織，大分子，如生物高分子、有機或無機分子。對包括細胞的產品實施的脈衝電場具有透化所述細胞的效果。不希望受理論的約束，將細胞暴露於外部電場能誘導細胞的構成性膜的任一側上的電位差。當該電場非常強烈時(特別是當其高於10，000V/cm時)，可以誘導比細胞的自然電位更高值的跨膜電位。當跨膜電位達到臨界值時，膜的任一側上的帶電分子之間的靜電現象導致細胞膜中孔的形成，從而增加其通透性。當細胞膜中孔的形成不可逆時，可以導致細胞內容物向外遷移，從而導致細胞死亡。根據本發明，取決於期望的透化水平，脈衝電場將具有用於獲得該透化所需的關於電壓值、脈衝數量、信號形狀、由所述電場遞送的特定能量的特徵。脈衝電場通常以電脈衝的形式實現，所述電脈衝通常導致一時間段內放電，所述時間段可以在50納秒至1毫秒，例如1 μ S的範圍內，並遞送可產生在5kV/cm至200kV/cm 範圍內的脈衝電場的峰值的電壓。電壓可以在100V至100，000V的範圍內。通過使用電脈衝，可以使得由焦耳效應加熱產品的現象最小，因此使得後者的溫度(通常低於50°C)最低。這樣可以避免產品中存在的成分變性，所述變性通常在應用涉及高溫的方法期間遇到。電脈衝在可能具有外殼形式的處理室內遞送，所述外殼包括允許電流作為電脈衝通過的電極。這些電極可以是平面的、圓形的、共軸的、共線的、旋轉式的或具有任何其它合適的幾何形狀。如先前所公開的，該方法包括以預定的供給流速，從包括所述產品的供給單元中向處理裝置供應待處理的包括所述細胞的產品的步驟。該步驟通常包括在運輸中使待處理的產品從包含其的供給單元如槽中穿過，朝向連接至處理室的供給管道。從實際觀點來看，以預定的供給速率，諸如在0. 01L/h至10，000L/h範圍內的速率，例如20L/h的流速，通過可選地設置有供給泵的供給管道從供給單元向處理裝置供應待處理的產品。接著，本發明的方法包括以對應於向上述供給速率加上在下面的抽出步驟中提及的抽出速率的引入速率，將包括所述生物細胞的產品引入所述處理室的步驟。一旦將產品引入處理室中，便使其經受由電脈衝實現的脈衝電場，其將引起包含在液體中的細胞透化。電脈衝為有利的脈衝，其可以在100至100，000V的範圍內，例如10,000至 50，000V,並遞送足夠的能量以便獲得根據所尋求的生物效應的期望的透化。由每個脈衝所遞送的能量通常包括在0. 005J到500J之間。因此，當期望獲得導致細胞死亡的細胞透化時，(特別是為了產品的巴氏滅菌或滅菌)，對處理參數，特別是遞送至每個體積單元(對應於處理室的體積)的脈衝總數進行選擇以便向產品遞送大於30MJ/m3的特定能量，優選大於100MJ/m3。為了獲得細胞的死亡，根據每個脈衝遞送的能量以及根據處理室的體積，對遞送至每個體積單元(對應於處理室的體積)的脈衝總數進行調整，以便達到預期的特定能量 (比能量)值。該脈衝總數可以包括在10到1，000之間。當期望獲得細胞的透化以便加速細胞與周圍介質之間的交換時，可對由處理室發射的電脈衝進行選擇以便在過程的整個持續中向產品遞送小於20MJ/m3的特定能量，例如1 至20MJ/m3。脈衝總數可以包括在2至100之間。事實上，本領域技術人員可根據期望透化率選擇合適的關於脈衝數量、電壓、遞送的特定能量的電脈衝特徵。施加於每個體積單元的脈衝數量可以以許多序列進行分配。作為一個實例，當認為用於處理產品的每個體積單元需要120個脈衝時，待施加的脈衝總數可以分配在例如3個系列，6個序列或10個序列中，每個序列分別允許施加40 個、20個或12個脈衝。在處理室內部，產品，特別是當其作為液體出現時，可以經受湍流液壓條件。該液壓模式是尤其有利的。事實上，放電過程中細胞的透化優先在位於面向電極的細胞膜的表面上進行。當細胞相對於電極無序運動(其是當產品經受湍流條件時的情況)並經受一系列脈衝時，其將受到彌散性影響，這將有助於提高關於透化的處理效率。相反，相對於電極靜止的細胞將受到濃度影響，這將降低處理效率。根據本發明的方法，一旦完成了處理步驟，就在處理室的下遊以預定的抽出速率向處理室中的已處理產品提供抽出步驟，以便將該抽出產品再次轉運至處理室的上遊以及所述供給單元的下遊，由此將抽出的產品再次引入處理室中，並再次使其經受脈衝電場。
根據本發明的具體實施方式
，藉助於至少一個將處理室的下遊部分連接至處理室的上遊部分的循環迴路來實現抽出步驟。在處理室的出口處，通過位於室下遊的循環迴路的入口將已處理的產品抽出，並通過循環迴路的出口注入室的上遊，該循環迴路可以作為循環管道出現。抽出速率可以大於或等於上述供給速率。有利地，抽出速率大於供給速率，例如高2至100倍，優選高2至20倍。這使得每個產物部分至少通過處理室兩次。 根據本發明的抽出步驟的應用具有以下優點。這樣，可以減少液壓短路現象，S卩，整個所處理的細胞群體中採用的一個細胞比該群體其餘的細胞更快地通過處理室的可能性。對於給定的特定能量，通過應用根據本發明的抽出步驟，與以下方法相比可獲得更好的關於細胞透化的結果，該方法具有通過使液體進入處理室的第一次處理，接著是在第一次處理和第二次處理之間儲存在槽中之後在相同處理室中的第二次處理。有利地，該方法在抽出步驟前，不包括對於已處理的產品的停滯儲存的任何步驟， 即，在通過抽出步驟將已處理的產品再引入處理室之前。另一優勢來自預料不到的效果，其涉及由於存在循環迴路，遞送至每個體積單元的脈衝數量被遞送多次的效果。令人驚奇地觀察到，對於處理室中給定的液壓條件和給定的脈衝總數，與不使用任何循環迴路而使待處理的產品單次經受脈衝總數相比，將該數量數次分配是更有利的。根據本發明的另一個實施方式，可通過多個循環迴路來實施抽出步驟，該循環迴路的入口位於處理室的下遊，而其出口位於處理室的上遊。建立許多循環迴路的事實可降低細胞進入如上所限定的液壓短路狀態的可能性。本發明的方法還有利地包括以有利地與上述供給速率相對應的提取速率，從處理裝置中提取已處理的產品的步驟。提取步驟是指存在於用於處理產品的室下遊的裝置出口處的提取的步驟，以便避免產品在裝置中的積累。提取和處理的產品可在收集槽中回收。如上所述，處理裝置包括至少一個處理室，指的是其可包括幾個處理室。在這種情況下，處理室可並排設置，如上所述的循環步驟，即引入步驟、處理步驟和抽出步驟分別在每個所述處理室中發生。本發明的方法可通過處理裝置實施，該處理裝置分別包括-用於供給待處理產品的單元，顯示為例如槽，其中容納有待處理的產品；-至少一個發射脈衝電場的處理室，其通過供給管道連接至供給單元；-位於處理室下遊的出口管道；-至少一個循環迴路，該循環迴路的入口位於處理室的下遊，並連接於出口管道， 並且該出口位於處理室的上遊並連接至供給單元。可以在供給管道和循環迴路上設置泵。當抽出步驟通過單一循環迴路進行時，本發明的方法可通過如圖1所示的處理裝置1進行，所述處理裝置1分別包括-包括待處理產品的供給單元2；
-將供給單元連接至處理室5的供給管道3，在其路徑上可以插入泵，如主泵7和副泵9 ；-處理室5，脈衝電場遞送至其內部；-出口管道10，其將處理室5連接至用於接收已處理液體的槽11；-具體化為管道的循環迴路13，其入口15位於處理室下遊的出口管道10上，而出口 17位於處理室5上遊的供給管道3上，該迴路允許運送至少一部分處理室下遊的已處理的產品，以便使該部分再次經受脈衝電場。當抽出步驟通過許多循環迴路進行時，本發明的方法可通過如圖2所示的處理裝置1進行，所述處理裝置1分別包括-包括待處理產品的供給單元2；-將供給單元3連接至處理室5的供給管道3，在其路徑上可以插入泵，如主泵7 和副泵9 ；-處理室5，脈衝電場傳送到其內部；-出口管道10，其將處理室5連接至用於接收已處理液體的槽11；-分別具體化為管道的循環迴路15、17和19，其入口21、23和25位於處理室5下遊的出口管道10上，而出口 27、四和31位於處理室5上遊的供給管道3上，這些迴路允許可選地通過整個循環迴路共用的或每個迴路獨立的泵，運送至少一部分處理室下遊的已處理的產品，以便使該部分再次經受脈衝電場。可在循環迴路中插入一個或多個裝置，如熱交換器、物質交換器(例如，相位分離器)、動量交換器(即，允許流體循環的改良和改善的裝置，如泵、動態攪拌器、靜態攪拌器)O根據本發明的方法待處理的產品可以視為包括待透化的生物細胞的液體，以泥漿或多細胞有機體形式，如水果。當其為液體時，其特別可以為水，液體流出物，來自汙水處理廠的液體泥漿，果汁， 牛奶，液態蛋，調味料，湯，燉過的水果和濃湯。其特別可以為液體，所述液體包括來自生物細胞的細胞器或分子，如線粒體、DNA 或 RNA。當其為泥漿時，其特別可以為來自汙水處理廠的泥漿。本發明的方法可用於不同用途，如-液體如水，液體流出物，果汁，牛奶，液態蛋，調味料，湯，濃湯，燉過的水果和濃湯的巴氏滅菌或滅菌；-處理來自汙水處理廠的泥漿，以便在散布這些泥漿之前或在乾燥脫水之前，除去某些多細胞有機物及微生物；-在基因工程領域處理生物細胞，使其對外源性分子(如DNA、RNA、蛋白、病毒)是可透過的；-破裂多細胞有機體，如水果，藻類的細胞，以便有助於它們隨後的榨取，從而獲得果汁或脂類提取物。本發明的方法尤其最適於液體的巴氏滅菌或滅菌。因此，本發明還涉及一種對產品進行巴氏滅菌或滅菌的方法，其包括應用如下所述的方法，設置脈衝電場的參數以便獲得在液體中存在的生物細胞的膜透化，並導致後者死亡。這特別可以對包括作為生物細胞的酵母菌如釀酒酵母的果汁進行巴氏滅菌或滅菌。現在參照作為說明且不作為限制給出的以下實施例對本發明進行描述。
圖1示出了處理裝置的一個實例，所述處理裝置包括允許應用本發明方法的循環迴路。圖2示出了處理裝置的一個實例，所述處理裝置包括允許應用本發明方法的三個循環迴路。圖3是示出了針對比較例(曲線a)和本發明的實施例(曲線b)的L0g(N/NQ)對傳輸的特定能量(以MJ/m3為單位)的曲線。
具體實施例方式以下實例說明了一方面未落入本發明範圍的方法(所謂的比較例)以及根據本發明的方法(所謂的本發明的實施例)的應用。為此，使用被釀酒酵母菌汙染的橙汁。這些酵母菌特徵為富含糖和酸的水溶液，並且傾向於增殖，通過糖的氧化代謝導致(X)2的釋放，該現象使得產品不適合於消費。在第一階段，對巴氏滅菌的橙汁(即，最初無酵母菌)進行接種，同時將濃縮的接種物加入到該橙汁中，以便對於以下實施例，具有富含釀酒酵母菌的橙汁，其量為每毫升 IO7個微生物(通過在瓊脂糖型的特定介質上生長的標準方法計算)。比較例以25L/h的流速使用處理裝置對相同體積的橙汁(20L)進行第一次處理，該處理裝置包括體積為5. 5cm3的含有平面並聯不鏽鋼電極的處理室。在電極之間傳遞的電信號是具有指數遞減特徵的電容器向由室內存在的液體容器形成的電阻放電的信號。電場的峰值最初調節至接近47kV/cm的值，每個脈衝產生的能量接近5. 5J/脈衝。由τ =RC定義的脈衝時間常數τ接近700ns，其中R為電極之間的電阻，而C為放電電容的電容值。將第一次處理後的果汁( = 1次處理)回收在大玻璃瓶中，並以中間產物方式儲存，隨後在與第一次處理過程中相同的操作條件下( = 2次處理)，通過使其再次通過處理系統進行第二次處理。不考慮中間產物停滯儲存所需的延遲，總處理時間為1小時36分。每個液體單元元件(每個元件相當於處理室的體積)經受的脈衝的總數(η,6)(每個相當於電容的單次放電)在第一次處理期間等於120，而在第二次處理期間也是120，使得最終的脈衝數為對0。將脈衝的特徵轉移到下表中，即峰場值為46. 6kV/cm時，並且傳遞到每個液體單元元件的比能量基於1立方米(Im3)為120MJ/m3，即對於兩次處理為MOMJ/
3
m ο每次處理的特徵顯示在下表1。
權利要求
1.一種用於包含在產品中的生物細胞的膜透化的方法，所述方法被應用在包括發射脈衝電場的至少一個處理室的處理裝置中，所述方法包括以下步驟-以預定的供給流速，從包括所述產品的供給單元中向所述處理裝置供給包括所述生物細胞的產品的步驟；-以對應於向上述供給流速加上在下面的抽出步驟中所提及的抽出流速的引入流速， 將包括所述生物細胞的所述產品引入到所述處理室中的步驟；-用脈衝電場來處理弓丨入到所述室中的所述產品的步驟；-以預定的抽出流速針對所述室出口處的產品的抽出步驟，以便將所述產品運回所述室的上遊以及所述供給單元的下遊。
2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述生物細胞選自原核細胞、真核細胞，這些細胞可以是活的或死亡的、整體的或部分的或者動物或植物起源的細胞。
3.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述生物細胞來自選自細菌、真菌、 酵母菌、黴菌、藻類的單細胞或多細胞有機體。
4.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述脈衝電場被具體化為電脈衝，所述電脈衝由持續範圍可以為50納秒至1毫秒的放電引起並且遞送產生範圍為5kV/cm至 200kV/cm的脈衝電場峰值的電壓。
5.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述產品，尤其當其作為液體出現時，經受湍流液壓條件。
6.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，藉助於至少一個將所述處理室的下遊部分連接至所述處理室的上遊部分的循環迴路進行所述抽出步驟。
7.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述抽出流速大於所述供給流速。
8.根據權利要求7所述的方法，其中，所述抽出流速比所述供給流速大2至100倍。
9.根據權利要求7或8所述的方法，其中，所述抽出流速比所述供給流速大2至20倍。
10.根據前述權利要求中任一項所述的方法，在所述抽出步驟之前，對於已處理的產品不包括任何停滯儲存步驟。
11.根據前述權利要求中任一項所述的方法，還有利地包括以優選與上述供給流速相對應的提取流速，從所述處理裝置中提取已處理的產品的步驟。
12.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述待處理的產品為包括生物細胞的液體，含有生物細胞的泥漿或多細胞有機體如水果。
13.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述待處理的產品為液體，所述液體包括來自生物細胞的細胞器或分子，如線粒體、DNA、RNA。
14.根據權利要求12或13所述的方法，其中，所述液體選自水、液體流出物、來自汙水處理廠的液體泥漿、果汁、牛奶、液態蛋、調味料、湯、燉過的水果和濃湯。
15.一種用於對包括待除去的生物細胞的產品進行巴氏滅菌或滅菌的方法，所述方法包括應用根據權利要求1至14中任一項所定義的方法的步驟。
16.根據權利要求15所述的方法，其中，所述產品是包括作為生物細胞的酵母菌如釀酒酵母的果汁。
全文摘要
本發明涉及一種用於包含在產品中的生物細胞的膜透化的方法，所述方法被應用在包括發射脈衝電場的至少一個處理室的處理裝置中，所述方法包括以下步驟以預定的供給流速向處理裝置供應包括所述生物細胞的產品的步驟；以對應於向上述供給流速加上在下面的抽出步驟中所提及的抽出流速的引入流速，將包括所述生物細胞的產品引入到所述處理室中的步驟；用脈衝電場處理引入所述室中的所述產品的步驟；以預定的抽出流速，在所述室的出口處的抽出步驟，以便將所述產品運回所述室上遊的步驟。
文檔編號A23L2/50GK102387717SQ201080015391
公開日2012年3月21日 申請日期2010年4月6日 優先權日2009年4月7日
發明者盧克·施裡夫, 居伊·盧米亞, 弗洛裡安·普約爾 申請人:法國原子能及替代能源委員會