肺的組織改造的製作方法

2023-05-23 01:51:56 6

專利名稱：肺的組織改造的製作方法
肺的組織改造
背景技術：
每年有400，000美國人死於肺病。更擔憂的是，儘管其他主要疾病種類(心臟病、 癌症和中風)的死亡率在不斷下降，但是由於肺病引起的死亡率在不斷增加。對於幾種肺病，包括囊性纖維化、氣腫/COPD和特發性肺纖維變性，肺移植仍然是唯一的成熟治療。然而，在肺移植後的患者存活率5年僅為50%，10年僅為(Mondrinos等，2008，Tissue Eng 14:361-8)。因此，對可用於移植的工程肺組織的開發有大量需求。工程肺組織的一個優點是該組織可利用患者自身的細胞進行生長，由此避免了如目前肺移植所要求的強免疫抑制的需要。免疫抑制對於防止移植器官排斥來說是必要的，但可導致廣泛的問題，包括感染、惡性腫瘤、腎損害、心血管問題以及神經障礙(Pietra等，2000，J Clin Invest 106 1003-10 ；Christie 等，2009，J Heart Lung Transplant28 :1031-49)。組織工程學是一個正在成長的領域，該領域尋求結合細胞、分子、技術和醫學的進展，創造適於植入的替代組織。已經在各種不同的組織上進行了有希望的工作，包括血管、 膀胱、心臟瓣膜和心臟組織(Nichols 等，2008，Am Thor Soc 5 :723-30 Jatchell 等， 2004，J Am Soc Nephrol 15 :566-74 ;Atala 等，2006，Lancet 367 :1241-6 ；Orfanos φ, 2004，Intensive Care Med 30 :1702-14)。然而，在實驗室中，肺是一個很難改造的組織。肺要求一種複雜的基質，該基質能承受呼吸的機械壓力，能支持內皮、上皮、間質細胞的生長， 以及提供在兩個非常不同但緊密並列的區室之間氣體交換的裝置。除了在臨床環境中潛在的患者使用之外，工程肺組織還可用於實驗室，以研究肺生物學和生理學的各種重要的方面。存在很少的體外3維非培養模型(Vandenbroucke等， 2008,Ann N Y Acad Sci 1123 :134-45)。另外，肺的內皮和上皮細胞與很多其他細胞類型相比，更加難以在實驗室培養(Malda 等，2004，Biomaterials 25 :5773-80 ；Reichenspumer， 2005，J Heart Lung Transplant 24 :119-30)，在肺祖細胞和幹細胞生物學的領域中已經有了相對緩慢的進步(Blaisdell 等，2009，Stem Cells 27 :2263-70 ；Muratore 等，2008，J Surg Res 155(2) :225-30)。因此，在本領域中需要開發複製天然肺環境關鍵特徵的體外肺組織。本發明滿足本領域中的這種需要。

發明內容
本發明提供了能夠支持細胞生長的去細胞組織。優選地，該去細胞組織顯示出去細胞化前相應天然組織的特性。更優選地，該組織為肺。在一個實施方式中，去細胞組織顯示出與去細胞化前其他相同組織基本相似的形態。在另一個實施方式中，權利要求1的去細胞組織保持了所述相應天然組織的細胞外基質，其中所述細胞外基質包括外表面，並且其中所述外表面是基本上完整的。在另一個實施方式中，已經基本上從去細胞組織上去除了免疫原性標誌。在一個實施方式中，去細胞組織顯示出與相應天然組織基本上類似的機械性質。本發明提供了包括三維支架和細胞群的組合物。優選地，該組合物能支持和維持肺細胞的分化狀態。 在一個實施方式中，三維支架為去細胞組織。在另一個實施方式中，組合物顯示了完整的支氣管樹和脈管網。在另一個實施方式中，細胞群包括幹細胞。在另一個實施方式中，細胞群包括內皮細胞和上皮細胞。在另一個實施方式中，細胞是基因修飾的。在一個實施方式中，細胞是基因修飾的，以表達CFTR基因。在一個實施方式中，組合物能夠支持和維持肺泡上皮細胞的分化狀態。在另一個實施方式中，支架包括生物相容性材料，該材料選自纖維結合素、層粘連蛋白、膠原、糖蛋白、血小板反應蛋白、彈性蛋白、肌原纖蛋白、黏多糖、糖脂、硫酸肝素、硫酸軟骨素、硫酸角質素、糖胺聚糖、透明質酸、蛋白聚糖、玻連蛋白、聚-D-賴氨酸、多糖以及其
糹口口。在一個實施方式中，細胞顯示出與分支形態發生的誘導相關的基因表達。在另一個實施方式中，組合物包括肺組織特性。在一些情況中，該特性選自分支形態發生、末端肺上皮細胞分化、上皮生長、脈管發育以及其結合。本發明提供了一種製作能夠支持和維持肺細胞的分化狀態的工程三維組織的方法。該方法包括用細胞群接種去細胞支架，以產生接種支架。本發明提供一種根據試驗劑調節肺組織健康的能力篩選試驗劑的體外方法。該方法包括將試驗劑接觸工程三維肺組織模型，並測量試驗劑對模型的影響。對模型的任何改變都是該試驗劑能夠調節肺組織健康的指示。在一個實施方式中，試驗劑選自化學劑、藥物、肽、核酸和輻射。在另一個實施方式中，試驗劑是治療劑的遞送載體。在一個實施方式中，該方法包括確定試驗劑對細胞數、面積、體積、形狀、形態、標誌表達或染色體斷裂的影響。在另一個實施方式中，該方法包括選擇對肺組織模型具有期望作用的試劑的步
馬聚ο本發明提供了一種減輕或治療哺乳動物肺缺陷的方法。該方法包括向哺乳動物施用治療有效量的組合物，該組合物包括能夠支持和維持肺細胞分化狀態的三維構建體，由此減輕或治療哺乳動物的肺缺陷。本發明提供一種可植入的組合物，該組合物包括能夠支持細胞生長的去細胞組織。優選地，該去細胞組織顯示出去細胞化前相應天然組織的特性。在一個實施方式中，可植入的組合物包括細胞群。優選地，該可植入的組合物能夠支持和維持肺細胞的分化狀態。


為了說明本發明的目的，在附圖中描述了本發明的某些實施方式。然而，本發明不限於在附圖中描述的實施方式的精確布置和手段。包括圖IA至ID的圖1是描述天然肺和去細胞肺的H&E染色以及定量DNA分析的系列圖。圖1說明了細胞材料(cellular material)被去除但支架體系結構被保留。DNA被去除至自然水平的大約1.2%。*表示p<0.01。圖ID是去細胞肺的圖。包括圖2A和2B的圖2是描述去細胞支架中殘餘DNA的染色的系列圖。用DAPI 對DNA進行染色。曝光這些圖同樣的時間，以便能夠進行比較。圖3是MHC I類和II類抗原的蛋白質印跡，其說明去細胞支架中缺少MHC I類或 II類抗原。包括圖4A和4B的圖4是描述天然肺和去細胞肺的膠原染色的系列圖。膠原I被染成綠色，膠原IV被染成紅色，細胞核用DAPI復染成藍色。發現膠原I靠近大血管，而膠原IV分布遍及實質(parenchyma)。注意到在天然肺中，實質中的紅細胞由於自發螢光而呈現綠色。包括圖5A和5B的圖5是描述天然肺和去細胞肺掃描EM的系列圖。肺泡隔 (alveolar septae)是完整的。左畫面的比例尺為100 μ m，右畫面的比例尺為20 μ m。包括圖6A至6C的圖6是描述天然肺和去細胞肺透射EM的系列圖。當去細胞化灌注壓維持在低於30mmHg時，肺泡基底膜得到保留。C表示毛細血管，A表示肺泡，S表示肺泡隔。在所有畫面中，比例尺為2 μ m。圖7是描述顯示保存毛細血管的去細胞肺的透射EM的圖。去細胞化的灌注壓小於20mmHg。C表示毛細血管，而A表示肺泡。由於去細胞基質的擠壓，肺泡和毛細血管的尺寸看起來小於體內存在的。上部畫面的比例尺為2μπι，下部左畫面的比例尺為Ιμπι，下部右畫面的比例尺為500nm。圖8是描述去細胞支架保留5 μ m微球的圖。微球分析說明，在去細胞化期間的低灌注壓(< 30mmHg)使氣道區室中能夠保留95%的5μπι微粒。*表示與天然的相比，ρ < 0. 05。包括圖9Α和9Β的圖9是天然肺和去細胞肺脈管系統顯微CT的系列圖。總的來說，當以58 μ m的解析度成像時，去細胞支架看起來類似於天然的。包括圖IOA和IOB的圖10是描述天然肺和去細胞肺脈管系統高解析度顯微CT的系列圖。這些掃描圖的解析度為6.5 μ m。圖11是描述機械測試方案的示意圖。簡單地說，一條肺組織被附著到上板上，隨後降低下板，並且該組織附著到下板。該組織被周期性地拉長至20%的應變，並且隨後拉長直到斷裂。包括圖12A至12C的圖12是描述天然肺和去細胞肺的膠原染色以及含量的系列圖。Masson三色染色法(Masson's trichrome stain)展現了天然肺和去細胞肺中的波浪形深藍色纖維。定量分析說明了天然肺和去細胞肺中保存膠原，但用十二烷基硫酸鈉(SDS) 去細胞化後膠原缺失。*表示ρ < 0. 01。包括圖13A至13C的圖13是描述天然肺和去細胞肺的彈性蛋白組織化學(偉郝夫範吉森法(Verhoff-van Geison))的系列圖。圖13描述了天然肺和去細胞肺中的波浪形深藍色彈性蛋白纖維。定量分析說明了與天然肺相比，去細胞肺中保存一些彈性蛋白。* 表示 ρ < 0. 01。包括圖14A至14C的圖14是描述天然肺和去細胞肺的GAG組織化學(愛茜藍 (Alcian blue))的系列圖。所述為天然肺中的藍色GAG染色，但在去細胞肺中它們不存在。 定量分析說明了與天然肺相比，去細胞肺中硫酸化GAG的缺失。*表示ρ < 0. 01。
圖15是描述天然肺和去細胞肺應力應變曲線的圖。SDS表示用十二烷基硫酸鈉處理的肺。圖16是描述天然肺、去細胞肺和SDS去細胞肺的最大抗拉強度的圖表。SDS表示用十二烷基硫酸鈉處理的肺。*表示與天然肺相比，ρ < 0. 01。包括圖17A和17B的圖17是描述用於體外肺培養的生物反應器示意圖的系列圖。包括圖18A和18B的圖18是描述在體外肺培養期間肺動脈和氣管壓力的系列圖。 灌注速率為大約5ml/min。包括圖19A至19C的圖19是描述空氣供氧(ventilation)對液體供氧對肺體系結構和氣道上皮的影響的系列圖。在3天的培養後，空氣供氧引起氣道擴張和氣道上皮的破壞。包括圖20A和20B的圖20是描述在天然肺培養期間，脈管灌注和壓力對細胞凋亡和細胞數的影響的系列圖。與天然肺相比，*表示P <0.01，#表示P < 0.05。包括圖21A至21D的圖21是描述天然肺和灌注培養肺中CCSP和SPC表達比較的系列圖。CCSP和SPC被染成紅色，細胞核用DAPI復染成藍色。包括圖22A和22B的圖22是描述天然肺和灌注培養肺中PECAM表達比較的系列圖。PECAM表達仍然針對灌注肺培養記錄(30mmHg)。PECAM被染成紅色，細胞核用DAPI復染成藍色。包括圖23A和2 的圖23是描述在天然肺培養期間，供氧對細胞凋亡和細胞數的影響的系列圖。與天然肺相比，*表示P < 0. 01，#表示P < 0.05。包括圖24A至24C的圖M是描述天然肺和供氧培養肺中凋亡細胞核的系列圖。當與天然肺或用氣道「迴路」供氧相比較時，單連接的供氧導致了高得多的凋亡細胞核速率。 凋亡細胞核經由TUNEL染成棕色，正常細胞核被復染成綠色。包括圖25A至25J的圖25描述了天然肺和7天培養肺中肺泡結構的系列圖。天然肺和培養、供氧肺之間細胞形態學、肺泡結構和隔膜體系結構看起來類似。圖25C至25J 描述了在7天的體外供氧肺培養後，肺細胞分化維持。圖沈是說明供氧使肺部脈管系統能夠被動灌注的圖。僅由於體外培養期間肺的供氧運動，在血管和毛細血管中發現微球。包括圖27A和27B的圖27是描述去細胞支架上培養的無限增殖上皮細胞系 MLE-12的H&E染色的系列圖。包括圖28A至^F的圖28是描述分離的新生肺細胞的肺標誌組的流式細胞術染色的系列圖。藍或綠曲線為同種型對照染色，紅色是所示抗原。圖四是描述8天培養的工程肺H&E染色的圖。此處的條件對於上皮細胞生長來說是優化的。包括圖30A和30B的圖30是描述4天和8天培養的工程肺的PCNA染色的系列圖。 增殖細胞核用PCNA染成棕色，陰性細胞核(negative nuclei)用蘇木精進行復染。包括圖31A和31B的圖31是描述4天和8天培養的工程肺的TUNEL染色的系列圖。陽性細胞核(positive nuclei)是棕色的，而陰性細胞核用甲基綠進行復染。包括圖32A至32B的圖32是描述4天的天然肺和工程肺的克拉拉細胞分泌蛋白 (CCSP)染色的系列圖。CCSP被染成紅色，而細胞核用DAPI復染成藍色。
包括圖33A至33C的圖33是描述4天和8天的天然肺和工程肺表面活性蛋白C 染色的系列圖。SPC被染成紅色，而細胞核用DAPI復染成藍色。包括圖34A至34C的圖34是描述4天的天然肺和工程肺水通道蛋白_5染色的系列圖。AQP被染成紅色，而細胞核用DAPI復染成藍色。包括圖35A和35B的圖35是描述工程肺組織中SPC和CCSP雙重染色的系列圖。 SPC被染成綠色，CCSP被染成紅色，細胞核用DAPI復染成藍色。SPC-CCSP雙重陽性細胞顯
示黃色。包括圖36A至36C的圖36是描述天然肺和工程肺中基底細胞的細胞角蛋白_14 染色的系列圖。細胞角蛋白染成紅色，而細胞核用DAPI復染成藍色。圖37是描述工程肺中細胞角蛋白-14和CCSP雙重染色的圖。細胞角蛋白_14被染成紅色，CCSP被染成綠色，細胞核用DAPI復染成藍色。包括圖38A和38B的圖38是描述天然肺和工程肺的α肌動蛋白染色的系列圖。 α肌動蛋白被染成綠色，而細胞核用DAPI復染成藍色。包括圖39Α至39F的圖39是描述培養基組成對上皮發育的影響的系列圖。當在 BGJb培養基中培養時，在CCSP表達缺失的情況下，驅使上皮結構進行SPC粒的頂端表達。 在DMEM培養基中，細胞保持了 SPC和CCSP 二者表達，其中SPC表達是彌散於細胞質的。圖40是描述工程上皮組織中表面活性物質表達的圖。「Lad」是蛋白梯，所指示的帶為20和25kDa ；"Nat"是天然肺組織；「Vent」是用DMEM培養基供氧的工程肺組織；「Perf 」是用DMEM培養基灌注的工程肺組織；「DMEM」是在DMEM培養基中靜態培養的工程肺；「BGJb」是在BGJb培養基中靜態培養的工程肺；「ALI」是用空氣供氧的工程肺； 「Decell」是去細胞支架。包括圖41A至41C的圖41是描述在工程肺組織中，空氣供氧對上皮發育的影響的系列圖。AQP表達被記錄在實質細胞中(上部左)，這些實質細胞對於SPC來說也是陽性的 (圖41B)，以及偶爾的強表達被記錄在立方上皮細胞中(上部右)。立方上皮的CCSP表達也被記錄(圖41C)。包括圖42A和42B的圖42是描述天然肺和工程肺中纖毛上皮的系列圖。將工程肺的纖毛細胞用紅色標出。包括圖43A和43B的圖43是描述灌注和供氧對工程肺培養的影響的系列圖。包括圖44A至44D的圖44是描述在工程肺培養中，灌注和供氧對細胞增殖和凋亡的影響的系列圖。包括圖45A和45B的圖45是描述在工程肺組織中，灌注和供氧對CCSP表達的影響的系列圖。CCSP被染成紅色，而細胞核用DAPI復染成藍色。包括圖46A至46B的圖46是描述在工程肺組織中，灌注和供氧對SPC表達的影響的系列圖。SPC被染成紅色，而細胞核用DAPI復染成藍色。圖47是描述用大鼠肺微脈管內皮細胞接種的纖維蛋白包被去細胞支架的H&E染色的圖。包括圖48A和48B的圖48是描述灌注工程肺內皮對供氧工程肺內皮的H&E染色的圖。包括圖49A和49B的圖49是描述灌注工程肺內皮對供氧工程肺內皮的TUNEL染
8色的系列圖。僅用供氧培養的EC基本上比灌注肺更容易凋亡。凋亡細胞核經由TUNEL染成棕色，而陰性細胞核用甲基綠進行復染。圖50是工程肺組織中內皮細胞之間形成緊密連接的圖說明。內皮細胞用星號標記，由延伸的細胞間連接進行分開。比例尺為500nm。包括圖51A和51B的圖51是描述天然肺和工程肺中VE-鈣黏著蛋白表達的系列圖。VE-鈣黏著蛋白被染成紅色，細胞核用DAPI復染成藍色。圖52是描述僅用內皮細胞接種的工程肺對2兆道爾頓FITC標記的葡聚糖的滲透性的圖表。*表示與去細胞支架相比，P <0.05。圖53是描述工程組織最大抗拉強度的圖表。也示出了天然肺和去細胞肺強度。包括圖54A至MC的圖M是描述培養基影響工程內皮組織生長的系列圖。工程灌注內皮在所示的培養基類型中進行培養。H&E組織學在左畫面示出，右畫面以棕色顯示凋亡細胞核(用TUNEL)，正常細胞核用甲基綠進行復染。圖55是說明通過在CHAPS緩衝液中溫育4_8小時製備的去細胞氣管維持了膠原基質和展示了從組織去除大多數細胞的系列圖。圖56是說明含有在天然氣管中看到的所有三種類型COL的去細胞氣管的系列圖。圖57是說明去細胞氣管支持NHBE粘著和生長的系列圖。圖58是說明去細胞氣管支持SAEC粘著和生長的系列圖。圖59是說明用GFP慢病毒感染的NHBE在6小時後沒有顯示明顯的形態學變化的系列圖。圖60是說明通過滴注(instillation)入氣道的遞送後，相當多的微球存在於小鼠每個肺葉的系列圖。圖61是說明細胞成功注入肺和已經用粘著在肺上皮細胞上的轉基因(GFP)轉導的人上皮細胞的系列圖。圖62是描述如胰蛋白酶消化之前所見的用於注射的GFP細胞的系列圖。包括圖63A至63C的圖63是說明在滴注入氣道後數天，在小鼠肺中發現GFP陽性人氣道上皮細胞(NHBE和SAEC 二者)的系列圖。包括圖64A和64B的圖64是說明在供氧周期期間，膨脹和緊縮的植入工程肺的系列圖。發明詳述本發明提供了工程肺組織。本發明部分基於可以產生顯示出天然肺組織特性的三維肺組織的這一發現。在一個實施方式中，工程肺組織源於去細胞天然肺組織。去細胞組織基本上沒有細胞和DNA。優選地，去細胞組織也沒有免疫原分子。更優選地，去細胞組織保留了對細胞粘附和增殖重要的幾個關鍵的細胞外基質分子。本發明包括一種將組織去細胞的方法。該去細胞化方法包括從組織去除細胞和細胞核的物質，而保持肺的關鍵方面和最小化任何對肺細胞外基質的損傷。在一個實施方式中，去細胞化過程也包括從組織去除抗原分子，由此使該組織成為非免疫原性的。在一個實施方式中，本發明的去細胞化過程包括生成與細胞培養完全相容的去細胞支架，同時提供屏障功能。優選地，該去細胞支架是具有完整氣道樹和脈管網的肺支架。
本發明也包括生物反應器。優選地，該生物反應器能支持任何3維組織的體外培養。在一個實施方式中，該生物反應器能通過負壓對肺進行供氧，而且提供在生理速率和壓力下的脈管灌注和供氧。此外，該生物反應器還能夠實施將培養基灌注通過脈管系統，使培養基或空氣運動進出氣道，以及通過負(和正)壓進行肺的供氧，等等。本發明肺組織的體外三維模型可用於研究肺發育生物學。另外，該模型可用於藥物發現、毒性試驗、疾病病理學和類似方面，等等。本發明也涉及肺組織可在體外生成的發現。該體外模型回想肺泡形成單元，重演了結構的形成，該肺泡形成單元由與宿主循環系統緊密連接的導管上皮構成。因此，本發明提供了用於生成脈管化肺組織作為再生藥形式的方法和組合物。本發明也提供了一種減輕或治療哺乳動物優選人的肺缺陷的方法。該方法包括向有需要的哺乳動物施用治療有效量的包括本發明三維構建體的組合物，由此減輕或治療哺乳動物的肺缺陷。除非另有定義，在此使用的所有技術和科學術語一般都具有與本發明所屬領域普通技術人員通常理解的相同含義。一般地，在此使用的用語和細胞培養、分子遺傳學、有機化學以及核酸化學和雜交的實驗室步驟是本領域廣泛已知和通常使用的。標準技術用於核酸和肽合成。通常根據在本文各處提供的本領域的常用方法禾口各種一般文獻(例如 Sambrook 禾口 Russell，2001，Molecular Cloning, A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 以及Ausubel 等，2002,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons, New York, NY) 實施技術和步驟。在此使用的冠詞「一個」和「一種」指的是一種或多於一種(即至少一種)該冠詞語法上的對象。舉個例子，「一種元素」是指一種元素或多於一種的元素。詞語「大約」將被本領域普通技術人員所理解，並且將基於使用的上下文在一定範圍變化。術語「前體細胞」、「祖細胞」和「幹細胞」在本領域中可交換使用，並且如在此所用， 指的是多能的或譜系未定型的祖細胞，該祖細胞潛在地能夠進行非限定數量的有絲分裂， 以更新其自身或產生將分化成所需細胞類型的子代細胞。與多功能幹細胞相反，一般認為譜系定型祖細胞不能產生很多相互之間表型不同的細胞類型。相反，祖細胞產生一種或有可能兩種譜系定型的細胞類型。如在此所用，術語「去分化」指的是細胞向不太特化狀態的回歸。在去分化後，與在重編程(re-programming)之前可能的相比，這樣的細胞將具有分化成更多或不同的細胞類型的能力。反分化(即去分化)過程有可能比分化更複雜並要求「重編程」該細胞，以
變得更原始。如在此所用，「支架」指的是一種包括生物相容材料的結構，其提供了適合細胞粘著和增殖的表面。支架可進一步提供機械穩定性和支撐。支架可為特定形狀或形式，以便影響或限定由增殖細胞群呈現的三維形狀或形式。這樣的形狀或形式包括但不限於膜狀 (例如其中二維遠大於第三維的形式)、帶狀、繩索狀、片狀、平盤狀、圓柱狀、球狀、3維無定形狀等。
如在此所用，「生物相容的」指的是當植入哺乳動物不會引起哺乳動物不利反應的任何材料。當引入個體中時，生物相容性材料對該個體是無毒或無害的，也不會誘導哺乳動物體內的材料免疫排斥。如在此所用，「自體的」指的是源於相同個體的生物材料，該材料將隨後被重新引入該個體。如在此所用，「同種的」指的是源於與材料將被引入的個體相同物種的遺傳學上不同個體的生物材料。如在此所用，「移植物」指的是植入個體的細胞、組織或器官，通常是為了代替、糾正或以其他方式克服缺陷。移植物可進一步包括支架。組織或器官可由源自相同個體的細胞組成；在此通過以下可交換的術語指稱該移植物「自身移植物」、「自體移植」、「自體植入物」和「自體移植物」。在此通過以下可交換的術語指稱包括源於相同物種遺傳學上不同個體的細胞的移植物「同種異體移植物」、「同種移植」、「同種植入物」和「同種移植物」。從個體到其相同孿生體的移植物在此稱為「同系移植物」、「同源移植」、「同源植入物」或「同源移植物」。「異種移植物」、「異種移植」或「異種植入物」指的是從個體到另一個不同物種的移植物。如在此所用，術語「組織移植」和「組織重建」均指的是將移植物植入個體，以治療或減輕組織缺陷，如肺缺陷或軟組織缺陷。如在此所用，「減輕」疾病、缺陷、障礙或病情是指減輕疾病、缺陷、障礙或病情的一種或多種症狀的嚴重性。如在此所用，「治療」是指減少患者經歷疾病、缺陷、障礙或不利病情等的症狀的頻率。如在此所用，「治療有效量」是足以向被施用組合物的個體提供有益作用的本發明組合物的量。如在此所用，術語「生長培養基」指的是促進細胞生長的培養基。生長培養基將通常包含動物血清。在一些情況中，生長培養基可不包含動物血清。在此使用的「分化培養基」指的是包括添加劑或缺少添加劑的細胞生長培養基，使得當在該培養基中溫育時，沒有完全分化的幹細胞、胎兒肺細胞或其他這樣的祖細胞發育成具有某些或所有分化細胞特性的細胞。如在此所用，術語「生長因子產物」指的是蛋白質、多肽、有絲分裂原或其他對細胞的生長、增殖、分化或營養有影響的分子。生長因子包括但不限於成纖維細胞生長因子 (FGF)、鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)、酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)、表皮生長因子 (EGF)、胰島素樣生長因子-I (IGF-I)、胰島素樣生長因子-II (IGF-II)、血小板衍生生長因子(PDGF)、血管內皮細胞生長因子(VEGF)、活化素-A、骨形態發生蛋白(BMP)、胰島素、生長激素、紅細胞生成素、促血小板生成素、白細胞介素3 (IL-3)、白細胞介素6 (IL-6)、白細胞介素7 (IL-7)、巨噬細胞集落刺激因子、c-kit配體/幹細胞因子、骨保護素配體、胰島素、神經生長因子、睫狀神經營養因子、細胞因子、趨化因子、形態發生素、中和抗體、其他蛋白質以及小分子。優選地，FGF選自FGF2、FGF7、FGFlO以及其任何結合。「分離細胞」指的是已經從其他組分和/或細胞中分離出來的細胞，所述其他組分和/或細胞在組織或哺乳動物中自然伴隨該分離細胞。
如在此所用，「胎兒肺細胞」(FPC)指的是從胚胎肺組織中分離出來的細胞。FPC混合群可包括但不限於上皮、間質和內皮細胞。如在此所用，「上皮細胞」是指形成身體和線器官(lines organ)的外表面、腔和黏膜表面的細胞。如在此所用，「內皮細胞」是指襯在血管和淋巴管以及各種其他體腔內的細胞。如在此所用，「基本上純化的」細胞是基本上沒有其他細胞類型的細胞。因此，基本上純化的細胞指的是已經從其他細胞類型中純化的細胞，其通常以其自然發生狀態與其他細胞類型相聯繫。在此使用的「可擴展性」指的是細胞增殖的能力，例如，在數量上擴展，或在細胞群的情況下，經歷群翻倍。術語「肺特異性」指的是與體內其他組織相比，在肺中被優勢表達的核酸分子或多肽。在一個優選實施方式中，「肺特異性」核酸分子或多肽以高於體內其他組織5倍的水平進行表達。在一個更優選實施方式中，「肺特異性」核酸分子或多肽以高於體內其他組織10 倍的水平進行表達，更有選地，以高於體內其他組織15倍、20倍、25倍、50倍或100倍的水平進行表達。核酸分子水平可通過核酸雜交進行測量，例如RNA印跡雜交或定量PCR。多肽水平可通過任何已知的精確測量蛋白質水平的方法進行測量，例如蛋白質印跡雜交分析。在此使用的「增殖」指的是相同形式尤其是細胞的複製或增多。即增殖包括更大數量細胞的產生，並且可通過簡單計算細胞數、測量併入細胞的3H-胸苷和類似方法等等進行測量。如在此所用，「組織改造(或組織工程)，，指的是用於組織替換或重建的體外生成組織的方法。組織工程是「再生藥」的一個實例，其包括通過細胞、基因或其他生物結構單元的併入，與生物工程材料和技術一起，修復或替換組織和器官的方法。如在此所用，「內源性的」指的是來自或產自生物、細胞或系統內部的任何物質。「外源性的」指的是引入或產自生物、細胞或系統內外的任何物質。「編碼」指的是多核苷酸例如基因、cDNA或mRNA中核苷酸特異序列作為生物過程中合成其他聚合物和大分子的模板的內在性質，該模板具有確定的核苷酸序列(即rRNA、 tRNA和mRNA)或確定的胺基酸序列，以及由此產生的生物性質。因此，如果對應於基因的 mRNA的轉錄和翻譯在細胞或其他生物系統中產生蛋白質，則基因編碼蛋白質。編碼鏈和非編碼鏈都可稱為編碼蛋白質或基因或cDNA的其他產物，編碼鏈的核苷酸序列與mRNA序列相同並通常在序列表中提供，非編碼鏈用作轉錄該基因或cDNA的模板。除非另有規定，「編碼胺基酸序列的核苷酸序列」包括所有為相互的簡併形式並編碼相同胺基酸序列的核苷酸序列。編碼蛋白質和RNA的核苷酸序列可包括內含子。「分離的核酸」指的是已經從序列中分離出來的核酸區段或片段，在自然存在狀態中該序列的兩側為核酸區段或片段，即，已經從序列中去除的DNA片段，這些序列通常鄰近該片段，即為在片段自然存在的基因組中鄰近該片段的序列。該術語也用於已經基本上從其他組分純化的核酸，所述其他組分自然伴隨該核酸，即在細胞中自然伴隨該核酸的RNA 或DNA或蛋白質。因此該術語包括例如重組DNA，其通常被併入載體，併入自主複製的質粒或病毒，或併入原核生物或真核生物的基因組DNA，或作為獨立於其他序列的分離分子(即作為由PCR或限制酶消化產生的cDNA，或基因組或cDNA片段)而存在。該術語也包括為編碼附加多肽序列的雜交基因的一部分的重組DNA。在本發明的上下文中，對通常出現的核酸鹼基使用以下縮寫。「A」指的是腺苷，「C」 指的是胞嘧啶，「G」指的是鳥苷，「T」指的是胸苷，「U」指的是尿苷。如在此所用，短語「在轉錄控制下」或「可操作地連接」是指啟動子位於正確的與多核苷酸有關的位置或朝向，以控制RNA聚合酶啟動和多核苷酸的表達。如在此所用，術語「啟動子/調節序列」是指用於表達可操作連接到啟動子/調節序列上的基因產物所需的核酸序列。在一些情況中，該序列可為核心啟動子序列，在其他情況中，該序列也可包括增強子序列和其他用於表達基因產物所需的調節元件。啟動子/調節序列可例如為以組織特異性方式表達基因產物的序列。「組成型」啟動子是當可操作地與編碼或規定(specify)基因產物的多核苷酸相連接時，在大多數或所有的細胞生理條件下，引起該基因產物產生於細胞中的核苷酸序列。「可誘導的」啟動子是當可操作地與編碼或規定基因產物的多核苷酸相連接時，基本上僅當相應於啟動子的誘導子存在於細胞中時，引起該基因產物產生於細胞中的核苷酸序列。如在此所用，術語「組織」包括但不限於骨、神經組織、包括筋和韌帶的纖維結締組織、軟骨、硬腦膜、心包、肌肉、肺、心臟瓣膜、靜脈和動脈以及其他脈管系統、真皮、脂肪組織或腺組織。「組織特異性」啟動子是當可操作地與編碼或規定基因產物的多核苷酸相連接時， 基本上僅在細胞是相應於啟動子的組織類型的細胞時，引起該基因產物產生於細胞中的核苷酸序列。「載體」是一種包括分離核酸並能用於將該分離核酸傳遞到細胞內部的物質組合物。很多本領域中已知的載體包括但不限於線性多核苷酸、與離子化合物或兩性化合物相關的多核苷酸、質粒和病毒。因此，術語「載體」包括自主複製的質粒或病毒。該術語也應解釋為包括有助於將核酸轉移到細胞內的非質粒和非病毒性化合物，如例如聚賴氨酸化合物、脂質體及類似物。病毒載體的例子包括但不限於腺病毒載體、腺相關病毒載體、逆轉錄病毒載體及類似物。「表達載體」指的是包括重組多核苷酸的載體，該重組多核苷酸包括可操作地連接到要表達的核苷酸序列上的表達控制序列。表達載體包括足夠的用於表達的順式作用元件；其他用於表達的元件可由宿主細胞提供或在體外表達系統中提供。表達載體包括所有本領域已知的表達載體，例如併入重組多核苷酸的黏粒、質粒(即裸露的或包含於脂質體中的質粒)和病毒。如在此所用，術語「對象」和「患者」是可交換使用的。如在此所用，對象優選哺乳動物，例如非靈長類動物(例如牛、豬、馬、貓、狗、大鼠等)和靈長類動物(例如猴子和人)， 最優選為人。碰本發明提供了工程三維肺部組織和製作該三維肺部組織的方法。優選地，該肺部組織為肺組織。在一個實施方式中，工程肺部組織顯示了由自然肺部組織示例的分支形態發生。因此，本發明提供了模仿天然肺部組織的體外模型。該體外三維肺部組織模型可用於藥物發現、毒性試驗、疾病病理學和類似方面等等。
本發明基於可用於使用去除細胞材料但保留細胞外基質關鍵組分的技術將肺組織去細胞化的方法的發現。作為用於組織工程應用的支架，去細胞肺基質的發育是重要的。 因此，本發明包括用於基本上將組織或器官去細胞化的方法。優選地，該方法顯著降低或消除了組織或器官的免疫原性，使得在移植後該組織或器官不會被接受者的免疫系統所排斥。該方法包括從捐贈者去除組織，加工該組織以基本上去除組織或器官的所有細胞。該方法進一步包括通過接種細胞，重建去細胞支架，用於植入接受者，這些細胞包括但不限於幹細胞、胎兒細胞及類似物。優選地，用非免疫原性細胞接種去細胞支架。在一個實施方式中，用對目標接受者來說是自體的細胞接種去細胞支架。取決於要治療或置換的組織類型， 選擇本領域已知或以後會已知的不同幹細胞，以便在植入後在接種植入物的接受者內形成合適的組織。在一些情況中，工程三維肺部組織包括在該組織上培養的細胞。任何合適的細胞都可用於在本發明的去細胞組織上培養。在一些情況中，在用於肺組織再生的去細胞組織上培養幹細胞。在一些情況中，在去細胞組織上培養胎兒或新生兒的肺部細胞(NPC)。在一些情況中，使用NPC的混合群，其中所述NPC的混合群包括但不限於上皮細胞、間質細胞和內皮細胞。在接種後，支架上的細胞任選地接受擴展培養基或分化培養基，或在組織特異性生長因子的存在下培養。隨後將組合物植入有需要的對象。該對象可為哺乳動物，但優選人，用於生長和植入的細胞源為任何哺乳動物，優選人。植入的組合物支持體內附加的細胞生長，因此提供了組織重建。因此，本發明提供了工程三維肺部組織用於組織移植療法的用途。本發明也包括在體內生成肺部組織。優選地，在體內生成脈管化肺部組織。在一方面，在去細胞化組織的情況下，胎兒肺部細胞被施用給哺乳動物，以促進體內肺部組織的形成。在本發明中，說明了可用合適的細胞例如新生兒或成人肺部細胞接種去細胞組織，並且所得的組合物可用作脈管化三維肺部組織的模型，用於臨床前體外藥理學、生理學和科學試驗。另外，可用合適的細胞例如新生兒肺部細胞或自身肺部細胞接種去細胞組織， 並且所得的組合物可用於體內組織重建。本發明的組合物和方法具有各種有用的應用。該組合物可用於減輕或治療個體中組織缺陷的治療方法。該組合物也可用於體外或體內鑑定治療化合物，並因此可具有治療潛力。去細胞化本發明提供了對本領域已知的組織工程技術的改進。具體地，本發明提供了使用去細胞組織，優選源於哺乳動物的去細胞天然組織，作為起始源，製作工程組織支架的方法。去細胞化過程依靠化學方法。在一方面，用於去細胞化的化學溶液或也稱為去細胞化溶液通常至少包括高滲溶液、洗滌劑和螯合劑。優選地，該高滲溶液為高滲氯化鈉溶液。優選地，該洗滌劑為兩性離子洗滌劑例如CHAPS。優選地，該螯合劑為EDTA。在一個實施方式中，去細胞化溶液可包括緩衝液(例如PBC)，以便與細胞具有滲透相容性。在一些情況中，該去細胞化溶液也可包括酶，不加限制地例如一種或多種膠原
14酶、一種或多種分散酶、一種或多種脫氧核糖核酸酶或蛋白酶例如胰蛋白酶。在一些情況中，該去細胞化溶液也可包括或可選地可包括一種或多種酶的抑制劑(例如蛋白酶抑制劑、核酸酶抑制劑和/或膠原酶抑制劑)。在一個實施方式中，將本發明的組織去細胞化的方法包括用去細胞化溶液灌注該組織。去細胞化溶液灌注通過組織的壓力可被調節至所需壓力。優選地，去細胞化溶液在低於大約30mmHg的灌注壓下灌注通過組織。更優選地，去細胞化溶液在低於大約20mmHg 的壓力下灌注通過組織。在一個實施方式中，可將去細胞化溶液引入肺組織的氣道中以實現細胞去除。在一個實施方式中，本發明的去細胞化組織基本上由組織的所有或大多數區域的細胞外基質組分(ECM)組成，包括脈管樹的ECM組分。ECM組分可包括以下的任何或全部 纖維結合素、肌原纖蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白、膠原家族成員(例如膠原I、III和IV)、 糖胺聚糖、基質、網狀纖維和血小板反應蛋白，其可以保持有組織的，如結構例如基底層限定的。成功的去細胞化被定義為在組織學切片中不存在用標準組織學染色方法可檢測的肌絲、內皮細胞、平滑肌細胞、上皮細胞和細胞核。優選但不是必須地，殘留細胞碎片也已經從去細胞組織中去除。在一個實施方式中，自然組織的去細胞化過程保持了組織的天然3維結構。S卩，組織的形態學和體系結構，包括ECM組分在去細胞化過程期間和之後都得到維持。視覺上和/ 或組織學上可檢查ECM的形態學和體系結構。例如，在實體器官(solid organ)的外表面或在器官或組織的脈管系統內的基底層不應由於去細胞化而被去除或顯著破壞。另外，ECM 的原纖維應與未進行去細胞化的器官或組織的原纖維相似或沒有顯著變化。在一個實施方式中，一種或多種化合物可用於去細胞組織內或去細胞組織上，以例如保持去細胞組織，或製備用於再細胞化的去細胞組織和/或在再細胞化過程期間促進或刺激細胞。這樣的化合物包括但不限於一種或多種生長因子(例如VEGF、DKK-U FGF、 BMP-l、BMP-4、SDF-U IGF和HGF)、免疫調節劑(例如細胞因子、糖皮質激素、IL2R拮抗劑、 白三烯拮抗劑)和/或修飾凝血級聯(coagulation cascade)的因子(例如阿司匹林、肝素結合蛋白和肝素)。另外，去細胞器官或組織可進一步用例如照射(例如UV、y)進行治療，以降低或消除任何殘留在去細胞組織上或去細胞組織內的微生物類型。本發明去細胞化溶液生成去細胞組織的用途提供了一種受控制的、精確的方法， 以破壞組織細胞，同時保持下面的ECM包括脈管系統和原始組織的其他總形態特徵完整。 隨後，去細胞支架適於接種合適的細胞。在體內實施該過程的情況，接種的組織適於作為替代組織植入接受者體內。除了去細胞組織本身之外，本發明還包括製作由這樣的支架構建的工程肺的方法。本發明提供了適於產生用於組織工程的組織支架的方法。儘管沒有限制組織源， 但在示例性實施方式中，該組織來自相對大的動物或被認為與人具有相似解剖結構(對於所關注的組織而言)的動物，例如豬、牛、馬、猴子或猿。在一些實施方式中，組織源為人，使用該組織源可降低基於支架的工程組織被排斥的可能性。在優選的實施方式中，該方法保持了完整的組織脈管結構，例如保存了肺泡隔的肺泡體系結構。如在此所用，術語「完整」指的是元件能夠在很大程度上發揮其原始功能的存在狀態。在一個實施方式中，去細胞肺保持了正常肺基質的幾個關鍵特性。例如，去細胞肺包括至少一種或多種的膠原、彈性蛋白、纖維結合素和蛋白聚糖。去細胞組織不保留主要組織相容性複合體(MHC) I類或II類抗原，因此當向接受者施用時，該組織不會引起不利的免疫反應。去細胞組織保持了正常天然肺的機械性質。去細胞組織也保持了正常天然肺的一些屏障功能。牛物反應器本發明提供了一種用於去細胞化和/或再細胞化組織的系統(例如生物反應器)。 生物反應器能夠使細胞成活率、細胞分化狀態和肺生態學得以維持。當在生物反應器中以合適的細胞源培養時，去細胞支架能支持各種細胞類型的粘著和增殖，包括肺部內皮、上皮和間質細胞。本發明的生物反應器結合了體內環境的關鍵特徵。設計生物反應器以允許用於優化去細胞化和/或再細胞化過程的改進。在一個實施方式中，生物反應器能夠以使用者規定的速率，並在哺乳動物的生理流動和壓力水平內，將培養基灌注通過脈管系統。在另一個實施方式中，生物反應器能夠用通過氣管用空氣或培養基向組織(例如肺)供氧。優選地，使用負壓供氧，以便與正常生理條件相一致，儘管也可使用正壓供氧。在又一個實施方式中，生物反應器能允許不同的培養基類型衝洗組織的脈管和氣道區室。在另一個實施方式中，生物反應器允許氣體交換進入培養基，而且同時達到供氧的期望要求。在另一個實施方式中，生物反應器具有允許壓力測量的部件，例如肺動脈和氣管壓力的測量。優選地， 壓力在正常生理值內。在另一個實施方式中，生物反應器具有允許周期性置換培養基的裝置。本發明的生物反應器通常包括至少一個用於將套管插入組織的套管插入器件，用於通過套管(一個或多個)灌注培養基的灌注裝置，以及維持器官或組織無菌環境的裝置 (例如屏蔽系統)。套管插入器件通常包括用於引入組織的血管、導管和/或腔的大小合適的中空管。通常，在組織中一個或多個血管、導管和/或腔可被套管插入。灌注裝置可包括液體(例如細胞破裂培養基)的保存容器和經由一個或多個套管將液體移動通過器官的機構(例如泵、氣壓、重力)。在去細胞化和/或再細胞化期間的組織無菌性可使用本文別處討論的方法維持。如在此所述，生物反應器可用於將組織去細胞化和再細胞化。可監測該方法的灌注特性(例如壓力、體積、流動方式、溫度、氣體、PH)、機械力(例如心室壁運動和應力)和電刺激(例如起搏)。可在流出物和組織切片中評估灌注的有效性。可用標準方法監測灌注體積、流動方式、溫度、O2和(X)2分壓以及pH。傳感器可用於監測生物反應器和/或組織。聲納微測量法(sonomicromentry)、 微量測壓法(micromanometry)和/或電導測量可用於獲得壓力-體積曲線。例如，傳感器可用於監測運動通過插入套管的器官或組織的液體的壓力；系統中的周圍溫度和/或器官或組織的溫度；運動通過插入套管的器官或組織的液體PH和/或流速；和/或再細胞化組織的生物活性。除了具有用於監測這樣特徵的傳感器，用於去細胞化和/或再細胞化組織的系統也可包括用於維持或調節這樣特徵的裝置。用於維持或調節這樣特徵的裝置可包括部件，例如溫度計、恆溫器、電極、壓力傳感器、溢流閥、用於改變液體流速的閥、用於開關與用於改變溶液PH的溶液流體連接的閥、氣囊、外部起搏器和/或順應腔(compliance chamber) 0為了有助於確保穩定的條件(例如溫度)，腔、貯液器和管可具有水夾套。
生物反應器能夠向肺組織提供足夠的營養供應和機械刺激，以便支持細胞存活和分化。生物反應器可用於體外肺組織培養和工程肺組織培養。優選地，生物反應器用於培養使用本發明去細胞肺支架的工程肺組織。能夠進行肺組織真正3維部分體外培養的生物反應器的發展是臨床有用的工程肺組織發展的重要一步。例如，工程肺組織的生長和成熟可在將工程肺植入接受者體內之前發生在生物反應器中，由此提高體內最終植入肺組織的功能。另外，用於體外肺培養的生物反應器可用於輔助肺生物學、生理學和發育的研究。即，可用本發明的工程肺組織和生物反應器研究形成肺泡-毛細血管屏障的肺內皮和上皮細胞的相互作用。普通技術人員將能夠在與目前所用的各種動物模型相比更加可控的環境中研究肺行為。工程肺組織和生物反應器也可在進行費時和昂貴的人或動物試驗前，用於人或動物組織的試驗和研究。組合物本發明的組合物包括工程肺組織。優選地，該工程肺組織顯示了以下性質中的任何一種或多種1)脈管系統和氣道，其中具有可進行供氧的未閉合的灌注脈管系統和未閉合的氣道樹；幻氣體交換，其中該工程肺能夠在氣道和脈管區室之間交換足夠的氣體， 以支持接受者的生理需要；更優選地，肺靜脈中的氧氣分壓為至少50mmHg ；3)機械性質 (mechanics)，其中該工程組織足夠堅固，以承受所有所需活動，特別是呼吸運動和脈管灌注，以及在外科植入期間的操作；4)免疫原性，其中當植入接受者體內時，該工程肺組織沒有引起免疫反應。本發明的組合物和方法可用任何合適的細胞實施。優選地，該合適的細胞或這些合適的細胞是再生性的並且可用於再細胞化本發明的去細胞組織。再生性細胞的例子包括但不限於幹細胞、胚胎幹細胞、成人幹細胞、臍帶血細胞、組織源性幹細胞或祖細胞、骨髓源性幹細胞或祖細胞、血源性幹細胞或祖細胞、間質幹細胞(MSC)、骨骼肌肉源細胞、多能成人祖細胞(MAPC)、胎兒肺細胞、分化肺上皮細胞、肺祖細胞、脈管祖細胞、分化脈管細胞及類似物。其他可用的再生性細胞包括骨髓源幹細胞，例如骨髓單核細胞(BM-MNC)、內皮或脈管幹細胞或祖細胞以及外周血源性幹細胞例如內皮祖細胞(EPC)。優選地，合適的細胞是從哺乳動物中分離出來的，更優選的是靈長類，還更優選的是人。用在此討論的方法，例如在實施例部分的方法，或通過本領域中已知的任何方法，分離在本發明的方法中有用的細胞。分離後，在培養基中培養合適的細胞。作為非限制性例子，關於培養細胞，對新生兒肺細胞(NPC)進行了更加詳細描述。 然而，普通技術人員將認識到可修改對合適的細胞的培養條件。支持肺細胞生長的培養基製劑包括但不限於Eagle極限必需培養基(Minimum Essential Medium)、ADC-U LPM(無牛血清白蛋白)、FlO (HAM)、Fl2 (HAM)、DCCMl、DCCM2、RPMI 1640、BGJ 培養基(有或沒有 Fitton-Jackson 改良)、Eagle基礎培養基(BME-力口入 Earle鹽基(Earle' s salt base))、 Dulbecco 改良 Eagle 培養基(Dulbecco 『 s Modified Eagle Medium) (DMEM-無血清)、 Yamane> IMEM-20> GlasgowEagle(Glasgow Modification Eagle Medium) (GMEM) ,Leibovitz L-15 培養基、McCoy' s 5A 培養基、培養基 M199 (M199E-具有 Earle 鹽基)、培養基M199(M199H_具有Hank鹽基(Hank' s salt base)、Eagle極限必需培養基 (MEM-E-具有Earle鹽基)、Eagle極限必需培養基(MEM-Η-具有Hank鹽基)和Eagle極限必需培養基(MEM-NAA-具有非必要胺基酸)及類似物。
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其他在本發明方法中有用的培養基的非限制性例子可包含濃度為至少至大約 30 %，優選大約5 %至15 %，更優選大約10 %的胎兒牛血清或其他物種的血清。牛或其他物種的胚胎提取物可以以濃度大約至30%、優選大約5%至15%、更優選大約10%存在。通常，NPC培養基包括基礎培養基、血清和抗生素/抗真菌素。一種優選的基礎培養基為DMEM/F12(1 1)。優選的血清為胎牛血清(FBQ，但也可使用其他血清，包括馬血清或人血清。優選在向上述培養基中加入多達20%的FBS，以便支持NPC的生長。然而，如果在生長培養基中確認並以合適的濃度提供用於NPC生長的FBC中必要的生長因子、細胞因子和激素，可使用規定的培養基。進一步認識到其他組分也可加入培養基中。這樣的組分包括但不限於抗生素、抗真菌素、白蛋白、生長因子、胺基酸以及其他本領域已知用於細胞培養的組分。可加入培養基的抗生素包括但不限於青黴素和鏈黴素。培養基中青黴素的濃度為每ml大約10至大約200單位。培養基中鏈黴素的濃度為大約10至大約200 μ g/ ml。然而，本發明決不應該被解釋為限於用於培養NPC的任何培養基。相反，可使用任何能夠支持組織培養中肺細胞的培養基。另外，可用至少一種生長因子補充NPC培養基。優選地，該生長因子為成纖維細胞生長因子(FGF)。例如，可向NPC培養基中補充FGF10、FGF7、FGF2的任何結合。優選的 FGF7的濃度為大約0. l-100ng/ml (以及之間的任何整數)，更優選地，該濃度為大約IOng/ ml。優選的FGFlO的濃度為大約l-200ng/ml (以及之間的任何整數)，更優選地，該濃度為大約25ng/ml。優選的FGF2的濃度為大約l-200ng/ml (以及之間的任何整數)，更優選地， 該濃度為大約25ng/ml。分離後，在將細胞轉移到另一個培養裝置前，NPC可在培養基中、在培養裝置中溫育一段時間或直到細胞達到匯合。初始鋪板後，細胞可在培養物中維持大約6天時間，以產生0代(PO)群。細胞可進行不定次數的傳代，每次傳代包括培養細胞大約6-7天，在這段時間期間，細胞加倍時間可在大約3天至大約5天的範圍。培養裝置可為通常用於體外培養細胞的任何培養裝置。可在補充FGF的培養基中培養NPC —段時間或直到細胞達到某一匯合水平。優選地，匯合水平大於70%。更優選地，匯合水平可大於90%。一段時間可為任何適於體外細胞培養的時間。NPC培養基可在NPC培養期間的任何時間進行更換。優選地，培養基每3至 4天更換。隨後從培養裝置中收穫NPC，在培養裝置上直接使用它們或冷藏保存用於以後使用。通過胰蛋白酶消化、EDTA處理或任何其他用於從培養裝置中收穫細胞的方法收穫NPC。在此描述的NPC可根據例行方法進行冷藏。優選地，在液氮的氣相中包含10% DMSO的培養基中冷藏大約一百萬到一千萬細胞。冷凍細胞可在37°C水浴中通過攪動解凍， 重新懸浮在新鮮的生長培養基中，並如上所述進行擴展。本發明也提供了「接種」支架的細胞。可在支架上培養NPC。也可通過在分化培養基中培養細胞，使細胞在體外分化。可選地，當它們建立與哺乳動物體內組織的接觸，或當細胞足夠接近組織以便受到從組織中釋放的物質(例如生長因子、酶或激素)的影響時， 細胞可在體外分化。換句話說，通過從組織收到信號，基質的NPC可建立與組織例如肺的接觸。例如當在NPC表面上的或NPC後代細胞的表面上的受體結合和轉導來自哺乳動物體內組織釋放的分子例如生長因子、酶或激素的信號時，這樣的信號將會發生。這些試劑指導了分化，以便NPC開始表達一些以及有可能大多數(如果不是全部)相同的蛋白質，這些蛋白質通常由它們已經所在的組織中的分化細胞表達。可選地或另外地，可通過向細胞環境加入物質(例如生長因子、酶、激素或其他信號分子)誘導基質的NPC分化。例如，可向本發明的生物支架加入物質。儘管NPC和相關細胞基質可最終成為完全分化的，並且儘管這在一些情況(例如細胞用於重新產生組織學上成熟和完整組織的情況)中是期望的，但不是所有施用的細胞都需要完全分化，以實現成功的治療；細胞基質的NPC只需要分化至足以治療哺乳動物的點。可在向患者施用基質之前或之後達到該點。當在植入部位，基質細胞表達了基本上與成熟細胞相同的表型時，分化發生。例如，為了限定本發明，當已經被植入肺的細胞基質的NPC表達了基本上與由肺例如肺上皮細胞表達的相同的蛋白質時，其發生分化。肺標誌的抗體是商業可得的，或者容易得到的。分化細胞也可由它們的總形態學和通過它們與其他細胞形成的連接來確認。例如，分化成肺細胞的細胞可發育成類似支氣管的複雜形態。例如，本發明基於在三維支架上培養NPC可顯示出成熟肺細胞特性的新發現。引入去細胞器官內和去細胞器官上以便生成器官或組織的細胞數取決於器官 (例如哪個器官、該器官的大小和重量)或組織，以及再生性細胞的類型和發育階段。至於細胞可達到的群密度，不同的細胞類型可具有不同的趨勢。相似地，不同的器官或組織可在不同的密度下細胞化。舉個例子，去細胞器官或組織可用至少大約1，000(例如至少 10，000、100，000、1，000，000、10，000，000 或 100，000，000)個再生性細胞進行接種；或去細胞器官或組織可具有附著在其上的大約1，000個細胞/mg組織(溼重，即去細胞化前的重量)至大約10，000, 000個細胞/mg組織(溼重)。可通過注射入一個或多個位置，向去細胞器官或組織引入細胞。另外，可將多於一種類型的細胞(即細胞混合物)引入去細胞器官或組織。例如，在去細胞器官或組織中，可在多個位置注射細胞混合物，或可在去細胞器官或組織的不同部分注射不同的細胞類型。 可選地，或除了注射以外，可通過灌注插套管的去細胞器官或組織，引入再生性細胞或細胞混合物。例如，用灌注培養基，細胞可灌入去細胞器官，隨後可將灌注培養基更換成擴展和 /或分化培養基，以誘導再生性細胞的生長和/或分化。在肺組織的情況下，可將細胞經由氣管引入氣道區室或經由肺動脈或靜脈引入脈管區室的任一個或同時二者。在再細胞化期間，在至少一些再生性細胞可在去細胞器官或組織內和去細胞器官或組織上繁殖和/或分化的條件下，器官或組織得到維持。這些條件包括但不限於合適的溫度和/或壓力、電和/或機械活性、力、合適量的O2和/或CO2、合適量的溼度以及無菌或接近無菌的條件。在再細胞化期間，在合適的環境中。去細胞器官或組織和附著在其上的細胞得到維持。例如，細胞可要求營養補給(例如營養素和/或碳源例如葡萄糖)、外源性激素或生長因子和/或特定PH。細胞對於去細胞器官或組織來說可為同種(同種異型，allogeneic)的(例如用人細胞接種人去細胞器官或組織)，或再生性細胞對於去細胞器官或組織來說可為異種的 (例如用人細胞接種豬去細胞器官或組織)。在一些情況中，通過在此描述的方法生成的器官或組織可移植到患者體內。在這些情況，可從患者獲得用於再細胞化去細胞器官或組織的細胞，以便再生性細胞對於患者來說是自體的。用本領域已知的方法，來自患者的細胞可從例如在生命不同階段(例如胎
19兒期、新生兒或圍產期、青春期或作為成人)的血、骨髓、組織或器官獲得。可選地，用於再細胞化去細胞器官或組織的細胞對於患者來說可為同系的(即來自同樣的孿生兒)，細胞可為來自例如患者親屬或與患者不相關的HLA匹配個體的人淋巴細胞抗原(HLA)匹配細胞，或細胞對於患者來說可為同種的，來自例如非HLA匹配的捐贈者。不考慮細胞源(例如自體的或不是自體的)，去細胞實質器官對於患者來說可為自體、同種或異種的。在一些情況中，去細胞器官可用細胞體內再細胞化(例如在組織已被植入個體後)。可如上所述(例如注射和/或灌注)，用例如任何在此描述的細胞進行體內再細胞化。可選地或另外地，用內源性細胞體內接種去細胞器官或組織可自然發生，或可通過遞送到再細胞化組織的因子進行調節。基因修飾本發明涉及本發明去細胞組織可用於促進哺乳動物肺細胞治療的發現。在另一個實施方式中，去細胞肺組織可用於培養所需的肺細胞例如肺上皮細胞。不管是否有基因修飾，細胞都可用於治療肺疾病，包括但不限於肺氣腫、閉塞性細支氣管炎和囊性纖維症。例如，本發明的去細胞組織可用作人肺氣道上皮細胞培養的基底 (substrate)。培養的人氣道上皮細胞可隨後通過氣管滴注、吸入或注射等方式遞送給接受者。在培養中擴展的這種細胞可用於實現接受者的治療。去細胞肺組織(例如氣管)提供了培養和擴展肺上皮細胞的優異平臺，肺上皮細胞通常很難在一般細胞培養環境例如組織培養塑料中生長。在基因治療的情況中，在細胞遞送到接受者肺中前，可用感興趣基因處理去細胞組織上培養的細胞。在一些情況中，基於這樣的細胞的基因遞送可顯示出相對於其他對肺的基因遞送方法例如吸入腺病毒基因遞送載體的顯著優點。對宿主進行基於細胞的基因遞送的這種優越性來自觀察到由於粘液層和宿主免疫系統施加的屏障，吸入基因遞送載體通常導致細胞轉導的不良效率。已經被預先插入細胞的治療基因的遞送避免了與基因治療載體滲入接受者肺細胞相關的問題。與在標準組織培養塑料上的培養相比，本發明的去細胞肺組織提供了方便且有效的方法，以高度可成活和分化的狀態生長肺細胞例如上皮細胞。反過來，肺細胞例如肺上皮細胞在去細胞基質上的擴展提供了足夠大量的細胞，以有效用於細胞治療。另外，肺上皮細胞在去細胞基質上的擴展提供了在體外培養細胞用基因治療載體治療的平臺。在體外用選擇基因轉染的細胞可隨後任選地進行純化，以選擇只表達感興趣轉基因的那些細胞，並隨後將其引入需要這種細胞治療的接受者體內。這樣的方法在治療遺傳性肺疾病例如囊性纖維症中可特別具有價值。在一個實施方式中，本發明提供了治療囊性纖維症的方法。該方法包括用CFTR基因的正常形式轉染目標細胞例如上皮細胞，CFTR基因的變異形式是造成囊性纖維症的基因。通過滴入氣管、吸入或其他引入方法向患者遞送這樣的轉染細胞減輕了大量與向這些患者體內遞送基因載體相關的難題。以這種方式，可實現囊性纖維症中有效的細胞治療和基因遞送。然而，本發明不應只限於用CFTR基因轉染的細胞治療囊性纖維症。相反，本發明包括任何與肺細胞相關的疾病或障礙的治療。因此，本發明提供了基因修飾細胞例如肺細胞的用途，所述基因修飾細胞已經在本發明的去細胞組織上進行了培養。基因修飾可例如引起外源性基因(「轉基因」)的表達或導致外源性基因表達的改變。這樣的基因修飾可具有治療益處。可選地，基因修飾可提供跟蹤或確認所謂修飾的細胞的方法，例如在將本發明的組合物植入個體之後。跟蹤細胞可包括跟蹤移植的基因修飾細胞的遷移、同化和存活。基因修飾也可至少包括第二基因。 第二基因可編碼例如可選擇的抗生素抗性基因或其他可選擇的標誌。可用於跟蹤細胞的蛋白質包括但不限於綠色螢光蛋白(GFP)、任何一種其他螢光蛋白(例如增強的綠色、青色、黃色、藍色和紅色螢光蛋白；Clontech，Palo Alto, CA)或其他標籤蛋白(例如LacZ、FLAG-標籤、Myc, His6及類似物)。當細胞基因修飾的目的是為了產生生物活性物質時，該物質將通常為可用於治療指定障礙的物質。例如，可以期望基因修飾細胞，以便它們分泌某種與骨或軟組織形成相關的生長因子產物。誘導其他與組織修復有關的內源性細胞類型的生長的生長因子產物也是有用的。例如，刺激內源性毛細血管和/或微脈管內皮細胞的生長因子可用於軟組織缺陷特別是較大量缺陷的修復。本發明的細胞可通過將外源性遺傳物質引入細胞進行基因修飾，以產生分子，例如營養因子、生長因子、細胞因子和類似物，該分子對培養細胞是有益的。另外，當細胞被移植到有需要的哺乳動物中時，通過將該細胞進行基因修飾以產生這樣的分子，該細胞可向哺乳動物提供額外的治療作用。例如在哺乳動物中，基因修飾的細胞可分泌對鄰近移植部位的細胞有益的分子。可用任何普通技術人員已知的方法對肺細胞進行基因修飾。見例如Sambrook 等(2001, Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York),以及 Ausubel 等，Eds, (1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons，New York，NY)。例如，肺細胞可暴露於包括包含轉基因核酸的表達載體，以便在適於轉基因在細胞中表達的條件下，將該核酸引入細胞。 轉基因通常為表達盒，其包括可操作地連接到合適啟動子上的多核苷酸。多核苷酸可編碼蛋白質，或其可編碼生物活性RNA (例如反義RNA或核酶)。因此，例如多核苷酸可編碼對毒素賦予抗性的基因、激素(例如肽生長激素、激素釋放因子、性激素、促腎上腺皮質激素、細胞因子(例如幹擾素、白細胞介素、淋巴因子)等)、細胞表面結合的細胞內信號傳導部分 (例如細胞粘著分子、激素受體等)、提高指定分化系的因子(例如骨形態發生蛋白(BMP))寸。在表達盒內，編碼的多核苷酸可操作地連接到合適的啟動子上。合適的啟動子的例子包括原核生物啟動子和病毒啟動子(例如逆轉錄病毒ITRs、LTRs、立即早期病毒啟動子(IEp)例如孢疹病毒IEp (例如ICP4-IEp和ICPO-ΙΕΕρ)、巨細胞病毒(CMV) IEp和其它病毒啟動子例如勞斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus) (RSV)啟動子以及鼠白血病病毒(MLV) 啟動子)。其他合適的啟動子為真核生物啟動子例如增強子(例如兔球蛋白調節元件)、組成型活性啟動子(例如肌動蛋白啟動子等)、信號特異性啟動子(例如可誘導啟動子，例如對RU486敏感的啟動子等)以及組織特異性啟動子。選擇適於在預先限定的細胞環境中驅動基因表達的啟動子完全在本領域普通技術人員的知識範圍內。表達盒可包括多於一種的編碼多核苷酸，並且如果需要，其可包括其他元件(例如多腺苷酸化序列、編碼膜插入信號或分泌前導的序列、核糖體進入序列、轉錄調節元件(例如增強子、沉默基因
21等)及類似序列)。包含轉基因的表達盒應被併入適於向細胞遞送轉基因的基因載體。取決於所需的最終應用，可使用任何這樣的載體，以便基因修飾細胞(例如質粒，裸DNA，病毒例如腺病毒、腺相關病毒、孢疹病毒、慢病毒、乳頭瘤病毒、逆轉錄病毒等)。可使用在這樣的載體中構造所需表達盒的任何方法，很多方法都是本領域廣泛已知的(例如直接克隆、同源重組等)。載體的選擇將很大程度上決定用於將載體引入細胞的方法(例如通過原生質體融合、 磷酸鈣沉澱、基因槍、電穿孔、DEAE葡聚糖或脂質載體介導轉染、用病毒載體感染等)，它們是本領域通常已知的。在Sambrook 等，MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, volumes 1-3 (3rd ed. ,Cold Spring Harbor Press,NY 2001)中有足以通過體外擴增方法指導普通技術人員的技術的例子，其包括聚合酶鏈反應(PCR)、連接酶鏈反應(LCR)以及其他DNA或RNA聚合酶介導技術。一旦用於蛋白質的核酸被克隆，普通技術人員可在各種肺細胞中表達重組基因。 預期本領域普通技術人員知道很多可用於表達所需轉基因的表達系統。本發明提供了模仿天然肺組織的工程三維組織。形成模仿天然肺組織的合成物和支架的能力與現有技術方法相比能夠在更大程度上修復和再生組織以及收集組織，並顯示了比用現有技術方法可實現的更精確的組織學結構和功能。例如，工程肺組織包括顯示出芽結構(budding structure)和狹長管結構的細胞。此外，細胞表達涉及形態發生和肺上皮分化的基因。涉及形態發生和肺上皮分化的非限制性基因包括末端上皮標誌基因SpC和 SpB、間質細胞源成形素FGF10、FGFr2以及脈管內皮生長因子A(VEGF)。MM本發明考慮工程肺組織在體外和體內環境下的應用。因此，本發明提供了用於研究目的和用於治療或醫學/獸醫目的的工程組織的應用。在研究環境下，極大量的實際應用因該技術而存在。這樣應用的一個例子為工程組織在離體癌症模型中的應用，例如在實驗室中測試不同切除技術(包括例如放射治療、化學療法治療或結合)有效性的模型，因此避免了病患者的使用，以便優化治療方法。例如，可將不久前去除的肺附接到生物反應器上，並處理該肺以切除組織。另一個體內應用的例子是用於組織工程。本發明的工程組織具有體內應用。在各種應用中，提及了對象(在此與「患者」可互換使用，意欲包括人和動物二者)的體內治療的方法。總的來說，對於某些實施方式，治療對象的方法包括將根據本發明的工程組織植入對象的表面內或表面上，其中組織的植入引起對象體內可檢測的變化。可檢測的變化可為可利用天然感覺(natural sense)或使用人工設備檢測出的任何變化。儘管本發明展望了任何類型的治療(例如疾病或障礙的治療性治療、皮膚疤痕的美容治療等)，但在很多實施方式中，該治療是對象的疾病、障礙或其他痛苦的治療性治療。因此，可檢測的變化可為在至少一種影響對象的疾病或障礙的臨床症狀上變化、優選為改善的檢測。示例性體內治療的方法包括腫瘤治療後的器官再生、植入醫療器械的手術位置的準備、皮膚移植以及組織或器官的部分或全部替換，例如由於疾病或障礙損壞或破壞的組織或器官的部分或全部替換。示例性的器官或組織包括心臟、肺、肝臟、腎臟、膀胱、腦、耳、眼或皮膚。鑑於對象可為人或動物的事實，本發明同時具有醫學和獸醫的應用。
在一個實施方式中，本方法包括將組織暴露於本發明的去細胞化方法，以殺死所處理組織的細胞並形成組織支架。該方法可進一步包括用細胞接種組織支架，以及允許接種的細胞在組織支架中和組織支架上增殖。增殖產生了包含健康和有功能的細胞的再生組織
本發明也提供了通過將工程肺組織植入有需要的哺乳動物治療患者的方法。在一些情況中，工程肺組織包括合適的細胞，例如NPC。然而，本發明不應限於任何特定的細胞類型。在植入後，所移植的細胞可響應將引起工程肺組織產生內源性組織特性的環境指示。 優選地，細胞形成組織學(histiotypic)的肺泡樣結構，其由形成導管結構的分化末端上皮細胞(前SpC表達)組成。因此，植入細胞將形成使其類似周圍組織的特性。利用這些方法，生物支架可擴增該組織；本發明的生物支架可用於組織工程和任何傳統的組織工程環境中。因此，本發明包括組織再生應用。組織再生治療方法的目的在於以同時優化最初傷口機械性質和最終新生組織產物的形式，向缺陷位置遞送高密度修復-有效的細胞(或當受局部環境影響時可變得有效的細胞)。本發明的組合物在減輕或治療個體中肺組織缺陷的方法中特別有用。有利地，本發明的組合物提供了改進的肺組織再生。特別地，由於該有創造性的組合物，可更迅速地實現組織再生。有利地，本發明的組合物和方法代表了對現有技術方法的改進。優選地，用於治療肺組織缺陷的組合物包括NPC，更優選地，包括接種在支架上並進行體外培養以生成3維培養物的NPC，如本文別處所述。藥物發現的模型就肺疾病或障礙而言，本發明提供了一種適合允許評估試驗化合物治療活性的體外方法。優選地，該方法包括工程三維肺組織的使用。本發明基於用去細胞組織開發的模型。在一些情況中，可用合適的細胞接種去細胞組織。在一些情況中，包含上皮、間質和內皮細胞的混合NPC群用於生成三維工程肺組織。例如，NPC被放置於三維去細胞肺組織內。因此，該模型結合了 NPC對生長和與鄰近細胞的細胞間通訊的影響。該三維肺組織模仿了天然肺組織，例如該工程肺組織顯示了由天然肺組織例證的分支形態發生。該模型可用於測試肺組織病理學方面的藥物。另外，該模型可用於考察治療劑特定遞送載體對肺組織病理學的影響，例如比較經由不同遞送系統施用的相同藥劑的作用， 或簡單地估計藥物遞送載體本身(例如病毒載體)是否能夠影響肺病理。在一個實施方式中，本發明提供了根據試驗劑調整肺組織健康的能力篩選試驗劑的體外方法。該方法包括將試驗劑與工程三維肺組織模型接觸，並測量該試驗劑對肺組織模型的影響。在該試驗劑存在的條件下，對模型的任何改變都是該試驗劑能夠調整肺組織健康的指示。在另一個實施方式中，本發明提供了觀察試驗劑對肺組織影響的體外方法，包括步驟a)提供至少一種三維肺組織模型，其中該模型意欲模擬正常肺組織；b)使該試驗劑接觸該肺組織模型；以及c)觀察該試驗劑對該肺組織模型的影響。
該組織模型是包括支架例如膠原基質上細胞的三維陣列以及至少一種測試細胞的構造。該方法包括觀察試驗劑對肺組織病理的影響。然而，該方法可進一步包括觀察該試驗劑對肺組織的各個細胞類型的影響。該試驗劑可為任何試劑， 包括化學試劑(例如毒素)、藥物、肽、蛋白質(例如抗體、 細胞因子、酶等)以及核酸，包括基因藥和引入的基因，其可編碼治療劑例如蛋白質、反義藥劑(即核酸，其包括在靶細胞類型中表達的與靶RNA互補的序列，例如RNAi或siRNA)、核酶等。另外或可選地，該試驗劑可為物理劑例如輻射(例如電離輻射、UV光或熱)；可單獨或結合化學和其他試劑對這些進行試驗。該模型也可用於測試遞送載體。這些遞送載體可具有任何形式，從傳統的藥用製劑到基因遞送載體。例如，該模型可用於比較對通過兩個或更多個不同遞送系統(例如貯存製劑和控釋製劑)施用的相同藥劑的治療效果的影響。其也可用於研究特定載體自身是否對肺組織有影響。隨著基於基因的治療劑的使用增加，與各種可能的遞送系統相關的安全組織開始變得越來越重要。因此，本發明的模型可用於研究核酸治療劑遞送系統的性質， 例如裸DNA或RNA、病毒載體(例如逆轉錄病毒載體或腺病毒載體)、脂質體等。因此試驗劑可為具有或不具有任何相關治療劑的任何合適類型的遞送載體。可用任何合適的方法將試驗劑加入要測試的模型。例如，可將試驗劑逐滴地加到模型表面並允許擴散進入模型或以另外的方式進入模型，或其可被加到營養培養基中並允許擴散通過膠原凝膠。模型也適於測試物理試劑的作用，例如單獨或與化學試劑相結合 (例如在光動力療法中)的電離輻射、UV光或熱。可用各種方法進行觀察試驗劑對模型的影響。例如，特定的試劑可誘導細胞進入凋亡。細胞中可檢測的變化可包括細胞面積、體積、形狀、形態、標誌表達(例如細胞表面標誌表達)或其他合適的特性例如染色體斷裂的變化。也可監測細胞數，以觀察試驗劑對細胞增殖的影響；這可進行直接分析，例如通過計數存在的特定細胞類型，或間接地，例如通過測量特定細胞團的大小。這些可用例如合適的螢光細胞染色，在完整的模型上直接或間接地觀察到。這可通過用活體染料或用於活體模型系列分析的遺傳引入螢光標誌(例如綠色螢光蛋白)對細胞進行預先標記，或通過用螢光物質例如碘化丙啶或螢光標記抗體進行固定和後標記。可選地，可通過正常組織學方法例如免疫組織化學，用針對合適細胞靶的抗體處理模型，或通過原位雜交，以測試特定mRNA種類的表達。此外，這可以以自動/機器人或半自動的方式，用計算機系統和軟體進行，以顯現在不同時間點的細胞並檢測例如細胞密度、位置和/或形態的任何變化。共焦雷射掃描顯微鏡尤其可進行完整模型的三維分析。 因此有可能直接向完整的三維肺組織模型應用細胞行為的定量分析，這通常只可能用於傳統的細胞二維培養。通過這種方法，可在三維肺組織模型中獲得細胞增殖、凋亡、壞死、遷移和基質侵入等的定量、系列分析，在傳統的細胞二維培養和活動物模型之間銜接起來。實驗性實施例通過參考下列實驗性實施例進一步詳細描述本發明。提供這些實施例僅為了說明的目的，而不是意欲進行限制，除非另有說明。因此，本發明決不應該被解釋為受限於以下實施例，相反，應該被解釋為包括由於本文提供的教導而變得顯然的任何和全部的變化。實施例1 大鼠肺的去細胞化和去細胞支架的形態學特性去細胞組織提供了用作組織工程支架的幾個優點。在一方面，去細胞支架包含了組織功能所需的合適的3維結構，在肺的情況中，包括脈管系統和氣道網。另外，細胞外基質(ECM)組分在物種間廣泛地保守，因此降低了去細胞支架誘導異種植入後免疫反應的可能性(Bernard 等，1983，Biochemistry 1983;22:5213-23)。在另一方面，天然 ECM 提供了細胞附著、擴展、生長和分化的最佳基底。 本發明去細胞化方法的目標是去除細胞和細胞核材料，同時保持肺的關鍵方面和最小化任何對肺ECM的任何傷害。在此呈現的結果表明天然肺組織可進行去細胞化，以去除細胞組分和抗原分子，而保持關鍵的細胞外基質分子。在一方面，本發明去細胞化方法的目標是生成完全與細胞培養相容的去細胞肺支架，並同時提供屏障功能。另外，對於去細胞肺支架而言，具有完整的氣道樹和脈管網是期望的。去細胞化的化學方法用於目前的研究中。用於該研究的化學品包括氯化鈉、CHAPS 和EDTA。高滲氯化鈉溶液可有效溶解細胞，儘管其並不有助於從組織去除細胞組分。CHAPS 是一種兩性離子洗滌劑，其允許有效的增溶，並因此去除了細胞材料。EDTA是一種結合了關鍵的二價離子(即Ca2+)的螯合劑，其有助於幹擾細胞附著到ECM上。另外，該溶液是是高鹼度的，這有助於增溶細胞質的細胞組分以及GAG，否則GAG阻礙基質(Gilbert等，2008J Surg Res 152(1) 135-9)。現在描述在這些實驗中使用的材料和方法。材料和方法器官收穫從剛成年(3月齡)雄性Fischer 344大鼠處獲得肺。所有的動物實驗工作都是在耶魯大學機構動物管理和使用委員會(Yale University Institutional Animal Care and Use Committee)的批准下進行的。動物通過戊巴比妥鈉(Sigma，40mg/kg)的腹膜內注射麻醉。在麻醉引入後，經由正好在肋邊緣下方的橫向切口進入腹部。刺穿隔膜，切開肋骨籃(肋架，rib cage)以露出肺。經由右心室，用包含50U/ml肝素(Sigma)的PBS灌注肺。 在灌注完成後，自由解剖並整體移出心臟、肺和氣管。生物反應器部件從Cole-Parmer (Vernon Hills, IL)處獲得生物反應器部件。矽膠塞和500ml玻璃罐形成了生物反應器的基礎。穿過矽膠塞插入大小為L/S 14和L/S 16的PharMed管 (ffestlake, 0H)以實現與肺必要的連接，包括灌注環和空氣供氧。用灌注泵和與肺動脈的連接之間的TruWave壓力傳感器(Edwards Lifesciences，Irvine, CA)監測壓力。用 Masterflex L/S 變速滾柱式泵(Masterflex，Vernon Hills, IL)完成灌注。去細胞化過程用於去細胞化的流體為含有8mM CHAPSUM NaCl、25mM EDTA的PBS。所有的化學品都從Sigma獲得，PBS從Gibco獲得。用去細胞化流體充滿生物反應器，並將該生物反應器轉移到保持在37°C的恆溫器中。在肺動脈幹流入處監測灌注壓並保持灌注壓在低於30 或20mmHg。在以下時間點，用新鮮流體置換去細胞化流體30分鐘、1小時、2小時、4小時、 6小時。對於大多數情況來說，去細胞化在4或6小時後停止。DNA 分析遵照製造商的說明，用Quant-iT PicoGreen dsDNA分析試劑盒(Invitrogen， Eugene, OR)確定組織的DNA含量。簡單地說，稱量和凍幹組織樣品，在TE緩衝液中稀釋並與Quant-iT PicoGreen試劑相混合。在485nm處激發以在535nm處測量螢光，用標準曲線確定DNA含量。天然樣品和去細胞樣品都至少測量4個樣品。蛋白質印跡.在冷RIPA緩衝液(Boston Bioproducts)中，用加入的蛋白酶抑制劑(Sigma) 消化用於蛋白質印跡的組織並在15，OOOrpm下攪勻30秒。在4°C下溫育1小時後，通過在14，OOOg處離心分離25min，去除不溶解的 顆粒。通過Bradford分析確定蛋白質濃度(Bradford，1976，Anal Biochem 72 :248_54)，隨後在 65°C 下，在 Laemmli 還原緩衝液 (BostonBioproducts)中煮沸25min。將樣品保存在_80°C下直到分析。樣品在可變百分比的聚丙烯醯胺凝膠中運動，使用25-30yg蛋白質。電泳後，將蛋白質轉移到硝化纖維素膜上。在TBS中衝洗膜，隨後將膜在包含5 %脫脂奶粉(NFDM)或3 %牛血清白蛋白的含0. 05 % tween-20的TBS(TBS-T)中封閉1小時。在包含2% NFDM或3% BSA的TBS-T中應用第一抗體過夜。第二抗體來自Santa Cruz並在驢或山羊體內培育，以及在1 2000的稀釋下， 在室溫下應用1小時。用來自Supersignal WestPico的底物(substrate)檢測蛋白質，在底片顯影前應用該底物5分鐘。免疫螢光組織塊在3. 7%甲醛(Sigma)中固定4小時，隨後將其轉移到70 %乙醇中並包埋入石蠟。薄(5μπι)切片由耶魯大學組織學中心研究室(Yale University Histology core facility)製備。組織切片在二甲苯中去石蠟化，通過乙醇梯度再水合，並在緩衝液 (PBS+0. 2% triton-X)中衝洗15分鐘。在70°C下，在pH 6. O的0. OlM檸檬酸中進行20 分鐘的抗原提取。冷卻至室溫後，在緩衝液中衝洗這些切片，隨後在室溫下，在包含5%牛血清白蛋白(BSA)和0.75%甘氨酸的PBS中封閉這些切片1小時。在4°C下，在封閉緩衝液中以合適的濃度應用第一抗體。將切片在緩衝液中衝洗3次，隨後在室溫下，在封閉緩衝液中，在1 500的稀釋下，應用第二抗體1小時。第二抗體為AlexFluor 555驢抗山羊或山羊抗兔和AlexFluor 488雞抗兔，從Invitrogen獲得。用含DAPI的封固劑(Vector Labs) 封固玻片(slide)，用Zeiss Axiovert 200M倒螢光顯微鏡獲得圖像。掃描電子顯微法在室溫下，用包含2%戊二醛和2. 5%多聚甲醛的0. IM 二甲基胂酸鹽緩衝液(EMD Biosciences, Gibbstown, NJ)固定樣品2小時，最後在二甲基胂酸鹽緩衝液中將樣品衝洗、切片並通過乙醇梯度脫水。進一步將樣品在六甲基二矽氮烷(hexamethyldisilizane) 中脫水IOmin並乾燥過夜，隨後用金噴塗並用耶魯大學地質和地球物理研究室(Yale University Geology and Geophysics facility) ^ JOEL JXA—8600 itifitf。透射電子顯微法用PBS中4%的多聚甲醛固定樣品，並隨後在室溫下放置在包含2%戊二醛和 2. 5%多聚甲醛的0. IM 二甲基胂酸鈉緩衝固著劑(pH 7.4)中2小時。將樣品在0. IM 二甲基胂酸鈉緩衝液中衝洗3次並在四氧化鋨中後固定1小時，隨後在包含2%醋酸鈾醯的 PH 5. 2的馬來酸鹽緩衝液中整體染色另外1小時。隨後，將樣品衝洗、通過梯度化乙醇系列脫水，用環氧樹脂浸潤(infiltrate)並在60°C下烘焙過夜。用Leica UltraCut UCT切割硬塊，在鎳網格上收集60nm切片，並用2%醋酸鈾醯和檸檬酸鉛染色。在SOkV下，在FEI Tencai Biotwin TEM上觀察樣品。利用iTEM(Olympus)軟體，用Morada CCD數位相機拍攝圖像。微球保留
如本文別處所述，將去細胞化肺或天然肺附接到套管上，並通過氣管，用含有5μπι 微球的PBS膨脹肺。隨後，用IOml PBS的3次衝洗衝刷脈管系統。微球在dH20中洗滌兩次，以去除碎片並溶解任何將以其它方式影響天然肺讀數的細胞。用Coulter計數儀裝置測量4. 9 μ m和5. 1 μ m之間的顆粒，對每個樣品中微球濃度進行量化並將其與在微球注射前取得的基線讀數相比較。顯微CT成像在10%中性緩衝福馬林(Sigma)中固定天然肺或去細胞肺，並通過氣道或脈管系統，注射對照劑。對照劑為PBS中20%鉍和5%凝膠(Sigma)。在對照劑注射後，在冰浴中冷卻肺，以使凝膠聚合。對於整個肺，用顯微CT成像系統(GE eXplore Locus SP,GE Healthcare)將肺脈管系統成像，設置成0. 029-mm有效檢測器像素大小。顯微CT在60kV峰值X射線管電壓、 80mA管電流、每幀1600毫秒、22檢測器裝倉(binning)模式，720視圖以及每圖0. 50增長下運行。對於一個肺葉(右上肺葉)的高解析度成像，將樣品放置在計算機控制的旋轉臺並以0.4°的旋轉步長圍繞垂直軸掃描360。管在SOkV峰值和80mA下運行。每圖的曝光時間通常為3000毫秒，檢測器裝倉模式設置成1 X 1和0. 0065mm的解析度。兩種探測都產生了通過肺或一個肺葉的一組連續軸向VFF格式圖像。使用Microview 軟體(GE Healthcare)，用大小為 58 μ mX 58 μ mX 58 μ m 的三維像素校正並重建粗數據，以使肺的整個脈管樹可視化。為了脈管樹(一個肺葉(lobe))的高質量，三維像素的大小被設定為6. 5 μ mX6. 5 μ mX6. 5 μ m。該軟體也可用於從粗數據重建最大密度投影圖像。多平面重組(multiplane reformation)、空間過濾(spatial filtering)和容積再現技術(volume rendering technique)允許數據組以橫向、矢狀、冠狀、混合平面和3D 形式可見。二元化圖像用於提取對象和測量目標區域。根據角視圖，通過用修正的Feldkamp 濾波反投影算法，重建三維體積圖像。然而，利用該系統，用具有小至58 μ m的典型立方體三維像素大小的圖像，可研究整個大鼠肺(視野大約3. 0cm)。每個三維像素的不透明度都由16位灰度值表示。現在描述實驗結果。去細胞化方法在此顯示的結果說明了一種去細胞化方法，該方法從完整的齧齒動物肺的整個肺葉去除細胞材料。觀察到用IM NaCl、8mM CHAPS和25mM EDTA進行去細胞化是最佳的，以去除細胞材料，而且似乎不去除膠原或彈性蛋白纖維(基於組織學)或損害基質的結構完整性(基於機械測試)。作為比較，發現用包含SDS的溶液進行去細胞化損害了基質的機械強度。發現其他條件沒有有效地去除細胞材料或引起基質完整性的顯著下降。組織學分析組織學用於表徵很多去細胞肺支架。基於對細胞核或DNA的H&E染色和DAPI染色，去細胞肺沒有顯示單個完整的細胞。有時，觀察到解鏈DNA或細胞抗原，但沒有觀察到完整的細胞。圖1顯示了天然肺和去細胞肺的H&E染色，而圖2顯示了殘餘DNA的DAPI染色。基於肺泡隔(alveolar septae)在標準組織學切片顯示出完整性的事實也觀察到肺結構的保存，較大氣道和血管也是如此。DNA 含量細胞材料的完整去除由於幾 個原因很重要。第一，如果意欲將支架用於組織工程應用，那麼在用新細胞源接種支架前，必須確定所有的細胞都從支架上去除。除了使重新接種的支架的評估變得複雜化之外，如果工程組織用於體內應用，則任何殘留的細胞材料都將引起免疫併發症(Conconi 等，2005，Transpl Int 18 :727_34 ；Macchiarini 等，2008， Lancet 372(9655) 2023-30 ；Alexander φ, 2009, Cell Transplant 18:255-9)。因此,本發明的支架已被證實在去細胞支架中不存在MHC I類和II類抗原。第二，為了單獨評估細胞外基質對肺結構的貢獻，所有的細胞組分都應被去除。可對外圍肺結構有貢獻的兩類組分為細胞材料和細胞外基質。細胞外基質可被進一步主要分成膠原、彈性蛋白和蛋白聚 H (Cavalcante ^,2005, J Appl Physiol 98 672-9 ；Dunsmore φ, 1996, Am J Physiol 270:L3-27 ；Ito等，2005，J Appl Physiol 98 :503_11 ；Suki等，2005，J Appl Physiol 98 1892-9)。通過保證細胞組分從去細胞支架上去除，可評價支架的機械性質。為了證明細胞材料的去除，進行定量DNA分析。觀察到與天然肺相比，去細胞支架中DNA含量的急劇減少(圖1C)。去細胞支架包含在天然肺中發現的DNA的大約1.2%，這相當於每mg乾重1.83 士0. 29ng的DNA。這與天然肺的38. 7 士 5. 8ng/mg形成對照。儘管大量衝洗支架可通常用於將殘餘DNA最小化，但全部DNA的完全去除是很困難的，少量DNA 殘留下來，如圖2中顯示小簇解鏈DNA的DAPI染色所示。DNA含量的急劇減少指示DNA去除，並與組織學發現一起證實了所有活的細胞材料都從支架上失去。在去細胞支架中，已經表明幾乎99%的DNA已被去除。少量的DNA殘留在基質中， 但作為DNA的延長鏈存在，如圖2所示。基於DAPI染色，已經發現在細胞核結構中沒有這些殘餘DNA的結構。已經觀察到與天然肺相比98.8% DNA去除，剩餘DNA含量為每mg組織(乾重)1. 83ng DNA。這有利地與其他人在去細胞心臟組織所得的16. 6ng/mg殘餘DNA的水平形成對照(Ott等，2008，Nat Medl4 :213_21)，特別是考慮到，如在該研究和其他研究中該水平對於溼重而不是乾重標準化(Gilbert等，2008J Surg Res 152(1) 135-9) 然而，所觀察的殘餘DNA水平高於商業可得的和實驗室生產的用於皮膚移植的ECM支架所見的，其中大多數支架顯示了小於每mg乾重0. 2ngDNA,儘管一些支架具有多達1. 13ng/mg的殘餘 DNA (Gi Ibert 等，2008J Surg Res 152(1) 135-9)。免疫原性通過主要組織相容性複合體(MHC)I類或II類抗原的染色，表徵去細胞支架的免疫原性。MHC I類和II類蛋白質是在抗原特異性免疫反應中重要的膜糖蛋白。MHC I類抗原在所有有核細胞上表達，而MHC II類抗原在免疫系統特定細胞上被發現。MHC I類抗原允許生物識別「自身」與「非自身」，因此從去細胞支架上去除以避免將來植入工程肺組織到動物模型中後的免疫問題是重要的。圖3描述了 MHC I類和II類抗原以及肌動蛋白的蛋白質印跡結果。通過免疫印跡觀察到MHC I類和II類抗原的完全失去，這證實了如果用於組織工程應用，預期去細胞支架將不會激起顯著的免疫反應。肌動蛋白也失去，這與細胞材料的缺失一致。相信，如果植入宿主中，支架將不可能激起免疫反應。
細胞外基質表徵
膠原膠原是肺最重要的結構組分，主要負責組織的總機械強度。免疫螢光用於表徵膠原I和IV在天然肺和去細胞肺中的分布，如圖4所示。去細胞基質保存了膠原I和 IV，膠原I顯示主要位於較大氣道和脈管系統周圍，膠原IV遍及實質。對天然肺和去細胞肺都顯示了類似的染色形式。這些膠原亞型在它們解剖結構上合適位置上的保存可使在工程肺組織發育期間細胞類型的選擇性沉澱得以實現。去細胞支架的掃描EM評估掃描電子顯微法(SEM)用於評估去細胞肺支架的顯微結構。圖5顯示了樣品圖像， 這表明細胞去除總體上維持了肺泡體系結構。去細胞肺中的肺泡看起來略微縮小，其是固定的人工製品。天然肺通過用固著劑膨脹肺來固定；然而，當增壓時，去細胞肺在肺泡區室中不能包含固著劑液體，因此使肺具有縮小外觀。然而，肺泡體系結構總體上相似，都保存了肺泡隔。這些結果，與組織學研究的發現一起，說明了總體肺氣道體系結構和肺泡結構， 包括肺泡隔，在去細胞支架中都是完整的。灌灃壓力對支架超微結構的影響除了掃描EM研究之外，透射EM (TEM)用於研究毛細血管-肺泡基底膜。這是去細胞支架的關鍵特徵，因為完整毛細血管網的存在允許去細胞支架對抗大分子通過肺泡空間並同時為工程肺組織的毛細血管內皮的生長提供合適的基底。圖7A和7B描述了天然肺和不控制脈管灌注壓的去細胞肺的TEM圖像。在這些條件下，肺泡基底膜有時是不可識別的，並且沒有發現毛細血管。不希望受到任何特定理論的限制，相信對基底膜和超微結構的損害可通過將去細胞化過程期間的灌注壓最小化以及通過在開始去細胞化前將脈管系統最大化地進行血管舒張來降低。儘管將去細胞化流體以亞生理流速灌注通過脈管系統，但在去細胞化期間，由於脈管系統中大量細胞溶解以及細胞蛋白質和DNA的積聚，脈管灌注壓可能變為超生理的。因此，仔細監測肺動脈壓並改變去細胞化生物器和灌注速率，以保持該壓力嚴格低於大約20-30mmHg。利用血管舒張劑硝普鈉使初始灌注壓最小化。圖6C顯示以保持在低於大約30mmHg的壓力去細胞化的支架的TEM圖像。在這些條件下，觀察到完整的連續肺泡基底膜。膠原纖維和其他基質組分被保留在肺泡隔內。然而，我們沒有注意到任何清晰的毛細血管結構的存在，其應該大量存在於肺泡周圍。去細胞支架中毛細血管結構的保留齧齒動物的肺脈管系統中的典型壓力小於15mmHg (Lee等，1999，Cell 99 301-12)，顯著低於以上研究中使用的30mmHg。儘管降低了灌注流速並使用了血管舒張劑以降低灌注壓，但難以維持去細胞化灌注壓低於30mmHg。然而，發現去細胞化方案中的微小改變使去細胞化期間的灌注能夠處於小於大約20mmHg的壓力下。重要的是，這使毛細血管的保留得以實現。該改變包括在開始去細胞化流體灌注通過脈管系統前，用去細胞化流體灌洗氣道區室。結果為顯著降低了脈管灌注壓，特別是在去細胞化過程開始時。如圖8所示， 該技術使去細胞支架中毛細血管結構的保留得以實現。相信毛細血管的保留是形成去細胞肺支架中的重要進展。支架應該保持完整的氣道樹和脈管網。除了顯微CT成像外，用掃描和透射電子顯微法也已經表明，總體上，在去細胞化過程後，支架被明顯完好地保存下來。掃描EM以及常規組織學表明了支架總體上是完整的，沒有大的缺陷(即肺泡和肺泡隔顯示出完整性)。透射EM表明肺泡基底膜被很好地保存下來，並且至少一些毛細血管被保留。顯微CT成像表明下至100 μ m直徑的血管，脈管系統也是完整的。可滲誘件評估為了使肺在體內起作用，其必須具有連續、不閉合和非滲漏的脈管系統，以避免大量血液損失在肺泡和空隙空間中。評估了去細胞肺支架在氣道區室中保留5μπι微球，而不允許這些大分子被運送至脈管系統中的能力。使用5μπι顆粒以模擬紅細胞——血的主要組分——的大小，它們將需要被保留在脈管系統中。因此，評估了 5 μ m顆粒漏出氣道並進入 脈管系統，假設這樣顆粒的運動穿過去細胞膜沒有明顯的方向性。測定了天然肺、用未控制灌注壓去細胞化的肺(恆定灌注流速)和在血管舒張後並用控制的灌注壓(小於30mmHg)去細胞化的肺的滲透性。結果在圖8中示出，並證實了更大規模的TEM發現。觀察到與低壓去細胞化的5. 7%和天然肺的2. 相比，用高(未控制的)灌注壓進行的去細胞化導致了 39%的滲漏。顯微CT成像顯微CT成像用於評估去細胞肺支架的氣道和脈管區室的不閉合性。該技術允許獲得肺支架的3維圖像，並便於氣道和脈管區室不閉合性程度的確認。圖9顯示了脈管系統的圖像，解析度為58 μ m。在該解析度下，顯示出大血管是完整的(圖9的頂部畫面)，天然樣品和去細胞樣品是大致相似的，在下面和中間的畫面中示出。脈管系統的較高解析度圖像(6.8μπι)在圖10中示出，其中血管作為3維投影(最大密度投影)示出。在這些圖像中，輕微的血管滲漏作為去細胞支架的一些區域示出的模糊狀態而被辨認出。去細胞基質的關鍵特徵為天然3維結構的保存。為了評估去細胞支架結構的保存程度，使用掃描和透射ΕΜ、顯微CT以及微球可滲透性分析的結合。用SEM考察去細胞肺的超微結構特性，並說明肺泡體系結構和肺泡隔的維持。透射EM表明了完全完整的肺泡基底膜以及膠原和彈性蛋白纖維。這些EM發現與去細胞肺基質中的其他工作一致，其中這樣的結構被保留下來(Lwebuga-Mukasa 等，1986，Exp Cell Res 162:423-35)。通過去細胞化期間脈管灌注壓的嚴格控制，在此顯示的結果證明了毛細血管的保留。基於保守估計，顯微 CT成像表明了下至100 μ m直徑血管的脈管網的保留，大量較小血管也是完整的。實施例2 細胞外基質組分對去細胞肺組織的機械完整性的貢獻設計以下實驗，以便更加詳細地評估去細胞支架的組成，集中於支架的機械性質。 不希望受限於任何特定的理論，相信去細胞肺支架保留了天然肺的突出機械特徵，這主要由於膠原和彈性蛋白的貢獻。在此顯示的結果說明使用去細胞肺組織作為研究與細胞貢獻無關的肺結構的平臺。在此顯示的結果表明膠原被保留下來，彈性蛋白含量被保留在天然水平的大約 40 %，而糖胺聚糖從去細胞支架上大量失去。現在描述在這些實驗中所用的材料和方法。材料和方法器官收穫和去細胞化如在本文別處所述，將肺組織收穫並去細胞化。
組織學分析組織學用於表徵很多去細胞肺支架，並證實細胞材料的去除。將組織固定、包埋入石蠟並切片。用標準蘇木精和曙紅染色(H&E)、膠原的Masson三色法、彈性蛋白的偉郝夫範吉森法(V erhoff van Gieson)和蛋白聚糖的愛茜藍，以及用4』，6_ 二脒基_2_苯基吲哚 (DAPI)對DNA染色進行分析。膠原分析利用改進的Grants 方法(Grant，1964，1964，J Clin Pathol 17 :685_6)，用比色分析確定膠原的數量，以檢測羥脯氨酸(OH-Proline)。肺樣品被凍幹並稱重，隨後在60°C下， 在木瓜蛋白酶(140μ g/ml)中溫育過夜(Sigma)。將木瓜蛋白酶消化樣品在115°C下，在6N HCl中溫育18小時，中和，用氯胺-T氧化並與對二甲氨基苯甲醛反應。在550nm波長下測量吸光率，1 lOw/w羥脯氨酸與膠原的比率用於計算組織的膠原含量。對於天然樣品和去細胞樣品，測量至少4個樣品。彈件蛋白分析用Fastin彈性蛋白分析試劑盒(Biocolor，Belfast，N. Ireland)確定彈性蛋白的數量。首先將肺樣品凍幹並稱重，隨後根據Foronjy等描述的方法提取彈性蛋白(Foronjy 等，2008，Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 294 :L1149_57)。樣品在 100°C下與 0· 25M 草酸一起進行溫育，隨後在10，OOOg離心並儲存上清液。集中來自5次提取的上清液，也測量來自第6次提取的上清液，以保證不再有彈性蛋白殘留在組織中。用10，000分子量截止的濾器(Millipore)清除草酸，隨後草酸在dH20中再次懸浮，並根據製造商的用法說明，用 Fastin彈性蛋白分析試劑盒進行分析。對於天然樣品和去細胞樣品，測量至少4個樣品。硫酸化糖胺聚糖分析用Blyscan GAG分析試劑盒確定硫酸化糖胺聚糖(sGAG)的數量，包括硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸乙醯肝素和硫酸角質素。根據製造商的用法說明，分析木瓜蛋白酶消化樣品(如上面對於膠原分析所述製備)。簡單地說，用1，9_ 二甲基-亞甲藍染料標記硫酸化GAG，並在650nm下測量吸光率。機械測試用裝備有ION荷重壓力盒(load cell)的Instron 5848分析天然肺和去細胞肺樣品。循環預拉伸已知大小的組織切片10個周期至20%應變，以研究彈性性質，並隨後拉伸直到不能估計最大抗拉強度(UTS)。見圖11測試方案的示意圖。利用組織的大小，根據力和距離計算工程應力和工程應變。現在描述實驗結果。膠原和彈性蛋白含量如圖12C所示，去細胞支架中的膠原與天然肺中的難以區別。膠原的保存是重要的，因為膠原在肺的機械強度中起到了關鍵的作用。在通過Masson三色法的組織化學染色上，膠原含量也得到維持，這在圖12中示出。在圖12C中也示出，用SDS去細胞化的支架中， 膠原的含量降低，SDS去細胞化是發現不合適的去細胞化方法中的一種。相信膠原的這種喪失與SDS去細胞支架中降低的機械完整性相關。在去細胞支架中，儘管彈性蛋白含量減少，但也被保存下來，如通過定量分析和組織學染色所表明的(圖13)。彈性蛋白纖維給予了肺的彈性，其對組織的自然回彈很關鍵，自然回彈在吸氣後肺的鬆弛以及隨後的呼氣中起到關鍵的作用。通過去細胞化過程保留這些纖維是關鍵的，因為在用肺細胞群重新接種支架的工作期間，其允許對肺支架合適地進行供氧。儘管支架喪失了 60%的天然彈性蛋白含量，但剩餘的彈性蛋白足以給予肺彈性功能，如從在本文別處所討論的機械測試結果所見。總的來說，這些關鍵ECM組分的保留允許支架承受機械應力的生理水平，這作為各種依靠機械刺激的發育和細胞分化過程是重要的。另外，ECM在輔助細胞附著到基質中是關鍵的，這些天然ECM組分的保留有助於細胞附著和散布，以及因此有助於生物工程肺組織的發育蛋白聚糖含量蛋白聚糖由與一種或多種糖胺聚糖(GAG)鏈相連接的核心蛋白組成。大多數GAG 被硫酸化，使它們通過定量分析能夠檢測，其結果在圖14中示出。觀察到去細胞支架的GAG 含量顯著低於天然肺(天然肺水平大約6 % )。在細胞表面或在細胞外基質內發現蛋白聚糖 (Ferdous等，2007，Tissue Engineering 13 1893-904)，並且它們的去除部分是由於細胞結合GAG的去除。然而，在ECM內發現的GAG也可通過去細胞化溶液進行增溶。圖14為蛋白聚糖的愛茜藍組織學染色，其顯示與天然肺相比，去細胞肺支架中剩餘的GAG的量減少， 這證實了定量分析結果。機械特件外周肺組織條(lung strip)的機械測試用於評估天然肺和去細胞肺樣品的準靜態機械性質。應力-應變曲線的彈性區域指示天然肺和去細胞肺樣品都顯示了滯後行為。 滯後表明肺是一種粘彈性的材料，擴張和鬆弛曲線之間的差異代表在鬆弛期間沒有恢復的能量。另外，樣品沒有蠕變，如圖15中所示。如果肺組織蠕變，其將不會在膨脹後收縮至其起始位置；因此，肺將永遠不會完全收縮，並且氣體交換將被削弱。該恰當的彈性肺行為的保存對於肺支架是重要的，因為在一些疾病狀態下發現了肺彈性的喪失，明顯見於肺氣腫 (Gelb 等，2002，Chestl21 :715_21)。最大抗拉強度(UTS)是拉斷樣品的應力，並且是材料強度的量度。如在圖16中所表明的，去細胞樣品的UTS與天然樣品的難以區別。然而，如果樣品在包含十二烷基硫酸鈉(SDS)的緩衝液中被去細胞化，則如UTS的減小所說明的，機械完整性被損害。SDS 可降解膠原，引起組織的破碎和腫脹(Bodnar等，1986，Thorac Cardiovasc Surg. 34(2) 82-5 ；Gilbert 等，2006，Biomaterials 27 :3675_83)，並且也顯示 SDS 增加了組織的延展性(Mirsadraee等，2006，Tissue Eng 12:763-73)。SDS是高離子性的兩性洗滌劑，其疏水區域可與蛋白質相互作用，而親水部分，特別是帶負電時，結合水並引起組織腫脹(Bodnar 等，1986，Thorac Cardiovasc Surg. 34(2) :82_5)。儘管其他研究沒有總是發現用SDS處理的UTS減小(Mirsadraee等，2006，Tissue Eng 12 :763_73)，但這可能是由於組織差異。 Mirsadraee等研究了心包組織，其與肺相比，包含多得多的密集聚集的膠原纖維。在肺中， 由於組織的幾何形狀，膠原纖維是高度分布的，並且SDS引起的腫脹可容易得多地導致膠原去除，如在定量膠原分析中所見。在此顯示的結果說明去細胞支架能承受相關的體內生理力。在此顯示的結果證實了膠原和彈性蛋白在功能水平上得到保存。這些發現證實了對肺機械性質的主要促成因素來自膠原和彈性蛋白，而不是來自細胞組分或蛋白聚糖。在此顯示的結果說明產生了表現 出天然肺特性的去細胞支架，這使它們成為組織工程應用的有利基底以及研究詳細基質力學和肺生物學、發育和生理學的研究平臺。t 施徹丨 3 用幹 3 mmmimmm^.m^m.m^mfmmik生物反應器可用於體外培養3維肺組織。這樣的生物反應器的開發將不僅有益於工程肺組織生長的研究，而且有益於肺生物學的研究。目前沒有允許長期體外培養成人肺組織的可用系統。以下實驗是為設計用於整個肺組織體外培養的生物反應器而進行的。生物反應器被設計用於滿足一系列設計限制因素，以便能夠為肺組織提供足夠的營養供應和機械刺激，以支持細胞存活和分化。設計實驗以評估生物反應器是否能支持肺組織整個肺葉的體外培養，這通過細胞成活率和分化狀態的維持來證明。在評估生物反應器的過程中，評價了在生物反應器中灌注和供氧對肺存活的影響。在此顯示的結果表明生物反應器可用於體外肺組織培養並因此可應用於工程肺組織。現在描述在這些實驗中使用的材料和方法。材料和方法整個肺培養從剛成年(3個月大)雄性Fischer 344大鼠收穫肺。所有的動物實驗性工作都得到耶魯大學機構動物管理和使用委員會批准。動物通過戊巴比妥鈉(Sigma，40mg/kg)的腹膜內注射麻醉。在麻醉引入後，用乙醇噴灑胸腔和腹部，並且正好在肋邊緣下方作出橫向切口，進入腹腔。刺穿隔膜，拉回肋骨，注意不要接觸肺。切斷下腔靜脈並通過右心室用 20-30ml包含50U/ml肝素(Sigma)和1 μ g/ml硝普鈉(Sigma)的PBS灌注肺。隨後解剖氣管並儘可能切得高。自由解剖與心臟和肺的所有剩餘連接，允許心臟、肺和氣管整體從動物身上移出。套管附接在器官去除後，將套管通過心臟的右側與氣管和肺動脈幹相連接。用外科手術刀切掉心臟尖端，通過右心室將直角套管插入並進入肺動脈幹。將注射器附接到該套管上並且注射5-10ml肝素化鹽水以保證合適的套管放置和充分灌注肺而不產生滲漏。隨後用縫線將該套管固定到心臟上。將單獨的直的端倒鉤的套管插入氣管並用縫線固定。隨後將肺與生物反應器相連接，並且按照在本文別處所述的方案進行去細胞化。將套管通過右心室與肺動脈並與氣管相連接，將肺與生物反應器相連接。用PBS 中2%的兩性黴素、青黴素和鏈黴素灌洗氣道，隨後用PBS進行兩次灌洗，隨後用培養基充滿生物反應器，培養開始。如實驗條件所規定的，進行脈管的灌注和供氧。生物反應器部件和組件除非另有說明，生物反應器部件從Cole-Parmer (Vernon Hills, IL)獲得。矽膠塞和500ml玻璃罐形成了生物反應器的基礎。穿過矽膠塞插入大小為L/S 14和L/S 16 的PharMed管(Westlake，OH)以實現與肺必要的連接，包括灌注環、氣管連接、空氣供氧和培養基置換埠。用灌注泵和與肺動脈的連接之間的TruWave壓力傳感器(Edwards Lifesciences, Irvine, CA)監測壓力。用 Masterflex L/S 變速滾柱式泵(Masterflex， Vernon Hills, IL)完成灌注。用多通道可編程注射泵(Cole Parmer)進行供氧，用IOml的體積進行吸入和呼出，每個30秒。生物反應器的圖在圖17中示出。
組織學和免疫螢光 在所需的培養時間後，將肺固定、石蠟包埋並切片。對水通道蛋白-5(1型上皮)、 表面活性蛋白C(II型上皮)、CCSP (克拉拉細胞)和PECAM-I (內皮)進行常規組織學(H&E) 和免疫螢光。將切片在二甲苯中脫蠟，再水合，並用含0.2% trit0n-X(緩衝液)的PBS溫育15分鐘。用PBS中0. 02M檸檬酸，在75-85°C進行抗原提取20min，在此之後，在緩衝液中衝洗切片。在室溫下，用PBS+1%牛血清白蛋白和0.75%甘氨酸進行封閉1小時。用緩衝液衝洗掉第一抗體，在室溫下，在1 500的稀釋下，應用第二抗體1小時。第二抗體從 Invitrogen (AlexaFluor 555 或 AlexaFluor 488x)獲得。用 Zeiss Axiovert 200M 倒螢光顯微鏡得到圖像。為了增殖細胞核抗原(PCNA)，通過染色評價細胞增殖(Zymed，San Francisco, CA)，並且用末端脫氧核苷酸轉移酶dUTP缺口末端標記(TUNEL)染色(Calbiochem，San Diego, CA)檢測凋亡細胞核。對於兩種分析，依照製造商的用法說明。微球供氧分析為了確定生物反應器中肺的供氧是否足以誘導培養基的運動來灌注脈管系統，用 5μπι聚苯乙烯微球(SPI Supplies,West Chester PA)展開簡單的分析。如在本文別處所述，將肺與生物反應器相連接，並進行供氧但不進行灌注。用IOOml包含1千萬個微球的培養基(每ml培養基10萬個微球)充滿生物反應器室。使培養繼續，僅供氧3hr。隨後將肺固定、用石蠟包埋、切片並用常規組織學(H&E)進行分析。現在描述實驗結果。生物反應器設計要求生物反應器包含了嚙齒類動物體內環境的關鍵特徵，但也被設計允許使用者根據所需的條件修改一些關鍵參數。設計目標如下 系統必須能夠在使用者所規定的速率下，並在生理水平內灌注培養基通過脈管系統。 系統必須能夠通過氣管用空氣或培養基向肺供氧。負壓供氧和不斷向肺供氧的能力是優選的，以便與正常生理條件相一致。 生物反應器應該優選允許用不同的培養基類型衝洗肺的脈管和氣道區室。 生物反應器必須允許氣體交換入培養基，同時滿足以上供氧的要求。 生物反應器必須具有允許對肺動脈和氣管壓力進行壓力測量的埠。壓力應該理想地處於正常生理值內，具有小於15-30mmHg的肺動脈壓(Li等，2004，Proc Natl Acad Sci USA 101 11488-93)。 生物反應器必須具有允許周期性進行培養基置換的裝置。 生物反應器必須小並且是自身封閉的(self-contained)，以便其能夠安裝在標準組織培養溫育器的物理範圍之內。 所有的生物反應器部件必須是便宜並且容易得到的。 生物反應器和所有部件必須能夠進行滅菌，優選通過高壓滅菌器。設計和建立滿足以上標準的生物反應器。生物反應器的示意圖在圖17中示出。生物反應器灌注系統通過將培養基從主生物反應器循環到肺動脈的滾柱式泵，提供對肺的灌注。灌注速率可由使用者規定。保持大鼠的心臟附接到肺上，以有利於套管通過心臟的右心室連接至肺動脈幹。然而，肺靜脈不與灌注環直接連接。相反，肺靜脈通過心臟的左側被直接引流入主生物反應器貯液池。肺的靜脈引流直接離開進入主生物反應器。可設定通過肺的灌注速率為使用者的規格。成年大鼠體內的生理流速為40_80ml/ min，儘管對於工程組織培養，流速通常比該值小得多。在成年大鼠中，全部血液體積必須通過肺，以變為充 氧的，然而在工程組織培養期間，必須僅灌注支持肺細胞生長足夠的培養基。因此，在工程培養期間的灌注速率更接近胎兒大鼠中的灌注速率，其中由於正常的生理分流，到肺的血流僅有心臟輸出的8-10% (Hislop等，2000，Ped Resp Rev 1:321-7)。用血管擴張劑例如硝普鈉，可將壓力分布控制在有限的程度，這可用於降低肺脈管壓力。通常將灌注壓力保持在低於大約30mmHg，30mmHg是在肺動脈系統中通常所見的最大值(Li等， 2004, Proc Natl Acad Sci USA 101 11488-93) 牛物反應器供氧系統生物反應器能夠同時進行正負壓供氧。在體內，呼吸通常通過負壓供氧完成。在胸腔內，隔膜收縮和肋骨籃(rib cage)擴張以產生負壓，使空氣流入肺，以緩解該壓力失衡。 在吸入後，呼吸肌肉放鬆，肺被動收縮。負壓供氧是生物反應器中供氧的主要模式。為了實現圍繞肺的負壓，生物反應器的主室必須是完全氣密性的。這通過關閉所有的空氣和壓力監視口實現。隨後，用注射泵從主生物反應器取出一定體積空氣，產生負壓。緩解該壓力的唯一途徑是培養基(或空氣) 通過氣管流入肺，該氣管與單獨的貯液池相連接。注射泵隨後逆轉方向，以推動空氣回到主生物反應器。這逆轉了室內負壓的積聚，培養基(或空氣)流回氣管貯液池。在這段時間內，肺被動收縮。氣管套管利用單向閥如圖17中所述，與氣管的連接涉及Y型連接器和向主生物反應器敞開的單向閥。 由於流體滲漏出氣道區室，所以該連接類型是必要的。在吸入期間，一定量的培養基進入肺。然而，該培養基中的一些穿過肺泡膜滲入間隙空間或脈管系統。因此，不是所有在吸入期間進入肺的培養基都可在呼出期間返回到氣管貯液池。在圖17中示出的該設計合併了允許所有培養基在吸入期間進入肺的特徵。然而，在呼出期間，培養基可通過單向閥，從肺或從主生物反應器返回到氣管貯液池。生物反應器也可通過將注射泵直接連接到氣管套管或氣管貯液池，利用正壓供氧。氣管入口修改在生物反應器的情況下，觀察到在供氧期間，沒有向肺氣道區室提供足夠的新鮮培養基。不希望被任何具體的理論所限制，相信這在很大程度上是因為相同的培養基被通入氣管並從氣管通出，這是由於氣管和單獨的氣管貯液池之間的管中包含一定體積的培養基，進入氣管的新鮮培養基不足。氣道培養基流動環中的「死空間」在呼吸期間阻止了新鮮培養基到達肺組織。因此，修改生物反應器，以便在供氧期間，培養基沿著不同的路徑進入和離開肺，如圖17所畫出的。由於該修改，每次呼吸進入氣管的大多數培養基都直接來源於氣管貯液池(並且因此與離開氣管的培養基相比是「新鮮的」)。在生物反應器培養期間的氧氣供應
在肺培養期間，測量生物反應器中組織培養基的氧含量，以便保證有足夠的氧含量。特別地，有必要保證在負壓供氧期間有足夠的氧遞送，在此期間，主生物反應器是氣密性的，氧氣進入的唯一入口是通過氣管貯液池。發現在培養過程中，氧張力沒有顯著降低， 並保持在6. 0-7. Omg/L，這與正常組織培養基中的水平相同。這些水平超過了 SO-IOOmmHg 的正常生理水平(6-7mg/L對應於137-159mmHg的分壓)。牛物反應器壓力分布圖測量了在生物反應器中培養的工程肺組織的氣管和肺動脈的壓力分布圖，以便保證壓力處於所期望的或生理的限度內。圖18顯示了代表性的分布圖。灌注壓力通常保持在大約2和30mmHg之間。在給出的實施例中，基線灌注壓力在10-17mmHg之間變化。然而， 負壓供氧的作用迭加在該分布圖上，因此在負壓「呼吸」期間，降低灌注壓力至0-7mmHg。該作用在生理上可見，其中隨著吸氣，壓力在肺脈管系統中降低。在生物反應器中，肺靜脈直接引流入主室，這也用作「胸腔」，在此產生負壓，以便向肺供氧。這用於增加從生物反應器到所灌注的脈管系統的負壓傳送。根據灌注壓力分布圖，最大負「胸腔」壓為大約-12mmHg，與生理值大致一致。因此，在吸入期間，該負壓被施加到氣道上，驅動流體(或空氣)從氣管貯液池進入肺。該壓力沿氣道樹逐漸減小，在氣管入口處為-3mmHg。值得注意的是，在氣管入口處的壓力在生理上基本上為零，因為其與大氣壓相接。然而，在壓力達到零的情況下，在生物反應器中，在吸入期間，該壓力仍然是稍微負的，這是由於氣管和氣管貯液池之間的管長度。培養基和氧氣的要求以下結果顯示了一系列的計算，其意欲幫助確定生物反應器中培養的嚙齒類動物肺所要求的培養基和空氣的體積。組織培養比較在體外組織培養期間，每3天向5百萬個細胞提供12ml培養基是常見的。如果假設成年嚙齒類動物肺包含1億個細胞，其相應於每3天最多240ml的培養基要求。然而，這將是過高估計，因為雖然組織培養中細胞通常是活躍複製的，但是完整嚙齒類動物肺中的很多細胞都是休眠的，並因此具有更低的培養基要求。葡萄糖消耗要求已經證明經灌注的大鼠肺的葡糖糖消耗為每克乾重每小時43 μ mol (Kerr等， 1979，Am J Physiol 236 :E229_33)。成年大鼠的肺具有大約 150_250mg 的乾重(Inokawa 等，2006，Ann Thorac Surg 82:1219-25)；同時組織培養基通常包含5. 5mmol/L葡萄糖。因此，成年大鼠的肺每天將需要28-47ml的組織培養基，以便滿足其葡萄糖消耗要求。氧要求 肺動脈內皮細胞每百萬細胞每分鐘消耗6nmol的氧(Xu等，2007，Proc Natl Acad Sci USA 104 :1342-7)，同時大鼠II型上皮細胞每分鐘消耗1. 25nmol(Dobbs等，1980， Biochim Biophys Acta 618 :510_23)。假設成年大鼠肺中的1億個細胞和假設肺中所有的細胞在較高的速率下消耗氧，大鼠肺每天將需要最多26mg的氧。組織培養基每升包含了大約6mg的氧，生物反應器包含了大約300ml的培養基。因此，該培養基通過新鮮培養基的每次置換(每3天一次)，可提供1.8mg的氧。另外，生物反應器中的空氣包含氧；在主生物反應器中有大約200ml的空氣。溫育器中的空氣包含大約20% 02，其在海平面和37°C下，相應於每升空氣大約260mg的氧。因此生物反應器中的空氣包含大約52mg的氧。本發明的生物反應器可基於上述計算，提供所培養的嚙齒類動物肺的培養基和氧要求。常規地，可在生物反應器中提供總共240ml的培養基(主生物反應器中180ml，氣管貯液池中60ml)，生物反應器中的空氣可每天進行置換。相信這些條件足以向所培養的肺提供超過足夠的營養物和氧。整個肺培養為了驗證和優化肺生物反應器的設計，使用整個天然嚙齒類動物肺的體外培養。 在生物反應器中培養肺達7天。已經證明生物反應器提供了足夠的營養物供應和機械刺激，以維持細胞存活和分化以及肺形態。在生物反應器中也使用天然肺的培養，以研究生物反應器條件對細胞存活、肺形態學和維持細胞分化狀態的影響。首先比較了空氣供氧對液體(培養基)供氧對肺形態學的影響。隨後評估了供氧技術和營養物遞送對細胞存活的影響。也評估了脈管灌注壓力對細胞存活和分化的影響。也評估了生物反應器在7天的培養期間維持細胞分化的能力。空氣供氧對培養基供氧對總體肺形態學的影響評估了用培養基或室內空氣(大約20% O2)向在生物反應器中培養的肺供氧的作用。相信用培養基進行的供氧將提供提高的細胞存活，因為這將提供改善的營養物遞送，其在生物反應器中可能是更重要的，因為沒有經灌注的支氣管循環來供應大氣道。然而，用空氣進行的供氧是調節成年肺的條件，並且肺上皮經常在空氣-液體界面的存在下培養，這已經顯示使胎兒大鼠肺中適當的肺發育得以實現(Funkhouser等，1976，Biochem Biophys Res Comm 70 :630_7)。因此，由於空氣-液體界面的缺少，也設計實驗以研究用培養基進行的供氧是否導致上皮分化狀態的失去。在3天的培養後，注意到用培養基供氧與用空氣供氧的肺之間顯著的不同。如圖 19所示，培養基供氧看起來類似於天然肺；然而，空氣供氧的肺顯示大大擴大了氣道，細胞碎片在氣道中很明顯(圖19C)。此外，圖19C的中間畫面顯示，空氣供氧肺的支氣管和支氣管上皮完全缺失，這是在整個肺中一致的發現。另外，擴大的外圍空氣空間是明顯的，如圖 19C的右畫面所示。也觀察到，如果(除了用空氣進行供氧外)還通過脈管系統灌注培養基，氣道上皮也被除光，而如果通過脈管系統灌注培養基而不供氧，則氣道上皮是完整的。這表明，氣道上皮的失去不是用於缺少足夠的培養基，而是與空氣供氧相關。也觀察到，對於任何培養基，支氣管循環沒有被灌注。上皮細胞經常在氣_液界面處培養，這與它們的生理位置相一致。氣_液界面 (ALI)經常用於誘導上皮分化(Gruenert 等，1995，Am J Physiol 268 :L347_60 ；Wong 等， 2009，J Clin Invest 119 :336_48 ;Hosokawa 等，2007，Connect Tissue Res 48:9-18)，缺少氣-液界面可導致纖毛形成減少(Ostrowski等，1995，Exp Lung Res 21 957-70 ；Yeh 等，2007，Laryngoscope 117:1439-44)。另外，當進行體外培養時，氣-液界面使通過II 型上皮維持表面活性物質的分泌得以實現(Mason等，2002，Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 282 :L249-58)。因此，在缺少ALI的情況下，預期將發生細胞分化狀態中的差異。 然而，沒有觀察到在用培養基進行供氧的肺中克拉拉細胞分泌蛋白(CCSP)、表面活性蛋白 C(SPC)或水通道蛋白(AQP)表達形式的顯著變化，如圖25中進行7天的培養所示。
灌注對細胞存活的影響研究了在生物反應器中所培養的天然肺中，脈管灌注對細胞存活和細胞分化的影響，目標是確定是否僅灌注就可支持體外肺培養，以及如果是，什麼樣的灌注壓力是最優的。使這些實驗變複雜的事實是，在肺移出後，脈管可滲透性快速增強。用IOmmHg壓力進行的分離肺的灌注可在10分鐘內引起肺水腫(Wierup等，2005，J Heart Lung Transplant 24:379-85)。在移出5_10分鐘內，觀察到脈管滲漏，3_4 %的小顆粒(28nm半徑)通過肺泡_毛細血管膜滲漏。大量的肺微脈管滲漏可導致很少或甚至沒有培養基遞送至末端毛細血管和靜脈結構。因此，可能需要比大約I-IOmmHg的生理水平高的脈管灌注壓力，以便在末端遞送流量並保持末端毛細血管不閉合(Li等，2004，Proc Natl Acad Sci USA 101 11488-93)。研究了在生物反應器中3天的天然肺培養期間，脈管灌注壓力對細胞存活的影響。如圖20所說明的，與10或20mmHg的壓力相比，高達30mmHg的較高灌注壓力產生了較少的凋亡細胞和較高的細胞密度。然而，不考慮灌注壓力，對於脈管灌注，細胞分化的維持是差的。觀察到大大降低的CCSP和SPC水平(圖21)，同時水通道蛋白表達幾乎完全缺失。 在脈管系統的較大血管中觀察到PECAM表達，但在毛細血管中觀察到減少的表達，如圖22 所示。這些實驗表明，僅灌注不足以維持足夠的細胞存活或細胞分化。氣道區室中培養基流動路徑對細胞存活的影響儘管用培養基進行的供氧允許肺形態學和細胞分化的維持，但觀察到與天然肺相比，供氧培養肺中明顯較高的凋亡細胞速率(見圖23和28)。相信這是由於不足的新鮮培養基遞送，因此設計實驗以修改生物反應器，以便在供氧期間增加新鮮培養基至氣道區室的遞送。如圖17所示和在本文別處所述的，具有將主生物反應器連接到氣管貯液池的單個管線。管長度為大約40-45cm並包含3-3. 5ml的培養基。在供氧期間，將大約2. 5-3. Oml 的培養基在負壓吸入期間吸入肺，相同體積的培養基通過與氣管罐相連接的管返回。因此， 在每次「呼吸」期間進入肺的大約2. 5-3. Oml的培養基中，該培養基不是新鮮的，僅是簡單地從管返回到肺。因此，實際遞送至肺的培養基遠小於將通過新鮮培養基供氧遞送的培養基。修改生物反應器設計，以在主生物反應器中的肺和氣管貯液池之間增加第二連接。利用單向止回閥，一個連接用於在吸入期間遞送培養基，另一個連接用於在呼出期間返回培養基。該修改對於每次供氧周期將「循環的」培養基從大約2. 5-3. Oml減少至僅大約 0. 75ml,因此大大增加了新鮮培養基的遞送。該生物反應器修改的作用在圖24中示出，其中顯示了提高細胞存活的額外的呼吸管線。凋亡細胞的百分數從單管線供氧的21. 5% (圖27中「僅vent」)降低至「迴路」 供氧的3.9%。這與對天然肺的0.5%形成對照。儘管「迴路」供氧通過減少「循環的」培養基的量增加了培養基至肺的遞送，但也可通過添加脈管灌注增加培養基遞送。灌注與供氧一起降低了細胞凋亡，從僅單管線供氧的21. 5%到7. 9% (圖23)。與單管線供氧相比，該「迴路」供氧改型略微增加了總的細胞數(圖23B)，但這不是明顯的差異。對於單管線和」迴路」供氧二者，細胞數與天然肺相比有所降低，但在統計學上不明顯。在此顯示的結果表明，僅供氧就使生物反應器中天然肺組織在3天培養期間的存活得以實現，條件是用「迴路」供氧改型或補充的脈管灌注向肺遞送足夠的新鮮培養基。迴路供氧表明了最好的總體結果，在所培養肺組織中最小化細胞凋亡，同時最大化細胞數。細胞形態學、細胞分化和肺泡結構為了更全面驗證生物反應器設計，進行了 7天的天然肺培養。這些培養利用了使用在本文別處所述的「迴路」改型但不用任何脈管灌注的培養基供氧。沒有採用脈管灌注， 但以後的研究可用「迴路」供氧探究對長期供氧培養添加灌注。對於水通道蛋白-5(1型上皮)、表面活性蛋白C(II型上皮)、克拉拉細胞分泌蛋白(克拉拉細胞)和PECAM-I (內皮)，通過組織學評估肺的細胞增殖、凋亡以及通過染色評估肺的細胞分化維持。整個肺的體系結構得以保存，包括肺泡結構，如圖29A和29B中所示。 較低放大倍數的圖像與圖19中示出的對於培養基呼吸的圖像難以區別。另外，如圖29C至 29J所示，細胞標誌的表達形式與天然肺沒有明顯的差異。僅供氧使肺脈管系統的被動灌注得以實現已經證明了僅供氧能夠實現細胞存活和包括內皮的一些關鍵肺細胞類型的細胞表型維持多達7天的時間。然而，這是在缺少通過脈管系統主動灌注培養基的情況下，最初是出乎意料的。為了研究為什麼缺少灌注不影響內皮存活或分化，進行了用5μπι微球研究供氧對流體運動進入脈管系統的影響的實驗。相信，由供氧誘導的物理運動不足以引起培養基被動運動進出脈管系統，該脈管系統在生物反應器中對培養基是開放的。在該實驗中， 向生物反應器中的肺供氧3小時，該生物反應器充滿了包含5 μ m微球的培養基。如果在肺的脈管系統中觀察到微球，則這指示由供氧誘導的被動灌注。如圖26所說明的，同時在大血管和一些毛細血管中發現微球。這些結果顯示僅供氧足以誘導脈管系統中的培養基運動，因此儘管缺少灌注，仍使內皮得以維持。脈管系統中培養基的這種運動是由於供氧而產生的肺物理運動的結果。僅擴散將不足以將這樣大的顆粒移入脈管系統。利用菲克第二定律，所預期的因擴散引起的微球進入脈管系統的運動可以近似估計。支持細胞存活和分化在此顯示的結果表明，僅脈管灌注不足以支持細胞存活和細胞分化，包括由II型上皮產生表面活性物質。然而，用培養基進行的負壓供氧足以支持大量的細胞存活(至天然水平的95. 1%)以及維持上皮和內皮的分化。該實施例實驗的總體目的是為了說明能夠在體外長期培養整個嚙齒類動物肺的生物反應器的有效設計，目的是利用該生物反應器進行以後的工程肺組織培養。結果證明了這是一個成功的適合用於工程肺培養的設計。實施例4 工程肺組織中的上皮發育在此顯示的結果證明去細胞支架是無細胞毒性的，並且支持多種肺細胞類型的粘著和增殖，包括上皮、內皮和間質細胞。在一些情況中，幹細胞可用於工程化肺組織。為了工程肺組織是有用的，其必須能夠連接到脈管系統和氣道上。氣道必須與肺泡相連，同時脈管連接必須導致肺泡周圍的密集毛細血管網。在此顯示的結果證明，工程肺組織的發育受到關鍵生物反應器條件的影響，包括培養基類型、灌注、供氧和氣-液界面的存在。在一些情況中，用培養基進行的供氧(即「液體供氧」)幫助氣道結構和上皮細胞的分化。另外，在氣-液界面處小片工程組織的靜態培養顯示了對組織生長的顯著影響，並且在生物反應器中，用空氣進行的供氧影響了細胞分化和上皮結構的發育。現在描述在這些實驗中使用的材料和方法。材料和方法支架製備如在本文別處所述的，收穫成年Fischer 344大鼠的肺並去細胞化。在去細胞化步驟後，在更換10次的無菌水中衝洗支架，隨後在含10%青黴素/鏈黴素的PBS中衝洗支架至少12小時。在隨後的培養中，同樣在10% FBS中衝洗肺，以協助DNA殘餘的去除。隨後將肺轉移到新的、無菌生物反應器中，該生物反應器連接有完整的灌注和呼吸系統。隨後將肺在PBS中衝洗兩次，在培養基中衝洗一次，以便用於培養。新牛兒細胞分離如在本文別處所討論的，從新生兒(大約7日齡)大鼠分離肺。隨後將肺在70% 乙醇中衝洗lOsec，並在Dulbecco改良Eagle培養基(DMEM，Gibco)中衝洗兩次，隨後轉移至無菌乾燥的培養皿中。用外科手術刀將肺切碎5分鐘，最後轉移到圓錐管中，用於彈性蛋白酶消化。從Worthington Biochemical (Lakewood,NJ)獲得脫氧核糖核酸酶、膠原酶和彈性蛋白酶。利用DMEM中4U/ml彈性蛋白酶和100U/ml脫氧核糖核酸酶，在室溫下通過搖動進行20分鐘的彈性蛋白酶消化。隨後通過70 μ m尼龍濾紙將組織塊過濾並用DMEM衝洗。 將未消化的塊轉移到乾淨管中並在室溫下通過搖動，在含有Ca2+和Mg2+的lmg/ml膠原酶的 1 IDMEM PBS溶液中，用膠原酶消化1小時。膠原酶消化的組織再一次通過70 μ m濾紙進行過濾，未消化的碎塊用注射器柱塞進行物理壓碎。剩餘組織用DMEM進行衝洗並通過 70 μ m濾紙進行過濾。結合來自膠原酶和彈性蛋白酶消化的細胞，隨後將其在DMEM中洗三次，在培養基中洗一次，以便用於培養。用臺盼藍染料排除法評價細胞成活率，隨後如在本文別處所述的，將細胞接種到去細胞支架內。新生兒細胞接種在肺細胞分離和去細胞支架的製備後，將所分離的細胞在培養基中懸浮，以用於培養。對於氣道區室的接種，將每個生物反應器15ml的細胞懸浮液注入氣管貯液池，通過負壓供氧接種細胞，以將細胞轉移到肺的氣道區室內。對於脈管系統的接種，將每個生物反應器3ml的細胞懸浮液注入肺動脈。允許細胞粘附過夜，而不進行灌注或供氧，在此之後， 根據實驗條件開始灌注和/或供氧。工程組織培養接種後，將肺靜態培養過夜，在此之後，開始灌注或供氧。根據實驗條件，改變灌注和供氧。培養基每周更換兩次。對於供氧條件，除了每天短暫的暫停，都向肺連續供氧，以便允許手動置換生物反應器中的空氣。對於工程組織塊的培養，在過夜接種後，將支架從生物反應器中去除，並用無菌剪刀剪成小(l-3mm)塊。將這些塊轉移到培養皿中培養，並且如果有所指示，隨後轉移到插入0. 4μ m濾紙的培養皿中，用於氣_液界面培養。流式細胞術在細胞分離後，在緩衝液(含有2mM EDTA和0. 5%牛血清白蛋白的PBS)中衝洗細胞。對於細胞內抗原的染色，用甲醛在室溫下固定細胞15分鐘，隨後用PBS中0. 2% triton-X進行滲透。以1 100的稀釋，在室溫下，在緩衝液中應用第一抗體30分鐘。在緩衝液衝洗3次後，以1 100的稀釋，在室溫下，應用第二抗體20分鐘。在耶魯醫學院細胞分選研究室(Yale School of Medicine Cell Sorting Facility)的Becton-Dickinson FACSCalibur機器上分析細胞。現在描述實驗的結果。支架是沒有細胞毒件的首先，腫瘤衍生的肺上皮細胞系MLE-12用於去細胞肺支架上的初步培養實驗。進行這些實驗以證明支架是沒有細胞毒性的，以及證明生物反應器系統對於利用去細胞支架的培養是一級有效的。觀察到MLE-12細胞系顯示了在多達10天的培養期間，在生物反應器中去細胞支架上健全的細胞生長，其中通過脈管系統灌注培養基。在圖27中說明了組織學。在3天中，細胞看起來形成了非常原始的肺泡結構，但隨後廣泛增殖，並且在7天中顯示了不受控制的細胞生長，這是預期的結果，因為這是腫瘤衍生細胞系。這些實驗是生物反應器和去細胞肺支架驗證中的初步步驟，並且佐證了採用新近分離的新生兒肺細胞的隨後實驗。新牛兒肺細胞的收穫由於多種原因選擇新生兒肺細胞，包括分離代表多種肺細胞類型混合物的大量細胞的能力，因為嚙齒類動物肺上皮難以在體外培養，並且因為新生兒大鼠的肺細胞年輕並且相對可塑的(Massaro 等，1985，J Clin Invest 76 1297-305 ;Meyrick 等，1982，Am Rev Respir Disl25 :468_73)。基於細胞數、成活率和基於流式細胞術的細胞類型分布，將細胞分離的條件進行優化。所用的主要標誌為表面活性蛋白C(SPC ；II型肺細胞)、水通道蛋白_5 (AQP ；I型肺細胞)、克拉拉細胞分泌蛋白(CCSP;克拉拉細胞)和血小板內皮細胞粘著分子-1(PECAM-1 ； 內皮細胞)。選擇細胞分離的條件，作為優化總細胞數和成活率的迭代實驗的結果。基於細胞產量和成活率優化酶和溫育條件的選擇，如通過總細胞數、臺盼藍染料排除和流式細胞術分析所評價的。在圖28中示出在「優化」分離方案下獲得的樣品肺分離的流式細胞術數據。在典型的分離中，5-10%的細胞是CCSP陽性，40-60%的細胞是SPC陽性，2_8%的細胞是AQP陽性，1-2%的細胞是細胞角蛋白-14陽性，10-30%的細胞是PECAM-I陽性以及5_10%的細胞是α-肌動蛋白陽性。利用細胞離心塗片製劑(cytospin pr印aration)，證實了 CCSP和 SPC的染色。儘管這些百分比中的大多數都在所預期的範圍內，但僅基於其在天然肺中的普遍性，將預期更高產量的I型肺細胞(AQP陽性)。然而，I型肺細胞非常脆弱，它們很多都不可能在細胞收穫過程後還存在。來自一窩幼崽(7-12隻幼崽)的總細胞產量接近1億個細胞，成活率75-85%。X寸於工禾別市培養的勿反應器^牛的初步石角i人設計實驗以通過組織學，主要基於細胞密度、成活率和形態學，研究各種變量和合適的條件，以及對蛋白質表達進行一些評估。在以下簡要地論述所評估的條件。培養基選擇評估了同時改變基礎培養基和血清濃度的數種培養基組合物。利用一些培養基條件，包括BGJb (無血清)、具有10% FBS的DMEM、具有15% FBS的EGM-2以及 EGM-2+15% FBS和BGJb的3份合1的混合物，觀察上皮重建(!^population)，主要是II型上皮。基於組織學和免疫螢光染色，培養基類型BGJb和DMEM+10% FBS為總體上皮生長提供了較優的條件。因此，這些培養基用於隨後的實驗。然而，本發明不應被限於任何具體的培養基。這是因為可使用任何促進所需增殖和分化的培養基。灌注和供氧灌注和供氧都在初步實驗期間使用。例如，以2-5ml/min灌注培養物，以提供營養物供應。也評估了以單次呼吸每天一次供氧的作用。然而，沒有檢測到所得工程肺培養中的顯著差異。儘管沒有從每天一次的供氧中觀察到明顯的益處，但確定了該最小供氧水平將提供更加生理性的培養環境。因此，對於大多數隨後的實驗，向培養物進行灌注，以及以單次呼吸每天一次供氧。去細胞支架支持上皮、內皮和間質細胞的牛長設計以下的實驗，以證明對於工程肺組織的發育，去細胞支架、肺生物反應器以及分離的新生兒肺細胞群的有效性。用於這些工程組織培養的精確條件顯示在表1中。在表中也描述了具體探索的條件，以評估那些條件對工程組織生長的影響。然而，本發明不限於這些條件。相反，本發明包括任何合適的條件，只要這些條件在生物反應器的環境下促進工程肺的生成。表1 用於工程肺培養的生物反應器條件
條件培養基供氧灌注培養時長驗證BGJb5 DMEM+10%FBS連續； 一天一次2 ml/min4-8天灌注DMEM+10%FBS無2 ml/min8天供氧DMEM+10%FBS連續用培養基2 ml/min8天氣-液界面DMEM+10%FBS連續用培養基4天， 隨後用空氣4天無8天培養基篩選DMEM+10%FBS 向BGJb過渡連續無8天上皮細胞重津的證明在此顯示的結果證明在去細胞肺支架上的上皮細胞的粘著和增殖。對於這些實驗，使用了 DMEM+10% FBS培養基、以2ml/min進行的脈管系統灌注、每天一次的供氧，未包被的去細胞支架以及未分類的新生兒肺細胞群(在本文別處所述的「優化」條件)。圖29顯示了工程肺組織的H&E染色。在4天中，觀察到顯著數量的有組織的、襯有立方上皮的正發育上皮結構，而在8天中，很少觀察到這樣的結構，並且很多細胞採取了更成熟的表型。在4天中，很多細胞都正在增殖，而在8天中，觀察到較少的增殖細胞(圖 30)。在4天和8天中都沒觀察到顯著數量的凋亡細胞(圖31)。用免疫螢光記錄關鍵上皮細胞標誌的表達，用水通道蛋白_5記錄I型肺細胞，表面活性蛋白C記錄II型肺細胞以及用克拉拉細胞分泌蛋白記錄克拉拉細胞。II型上皮細胞通常在培養中佔優勢，特別是在靠後的時間點上，如圖33所示。在4天中，觀察到高密度克拉拉細胞，在8天中具有較少的克拉拉細胞(圖32)。在4天中，也觀察到水通道蛋白的染色，儘管在靠後的時間點上，觀察到顯著較少的水通道蛋白染色(圖34)。觀察到I型上皮的水通道蛋白染色將在4天的培養中形狀是立方形的細胞——這與它們通常扁平的形態相反——描繪為在功能肺中襯(line)在肺泡裡的細胞。另外，對 SPC或CCSP，這些立方細胞也經常染色為陽性，如圖36和37所見。因此，在4天中表達水通道蛋白的細胞為成熟I型上皮是不可能的，正如將通過變平的形態和沒有其他標誌的水通道蛋白表達所提示的。I型肺細胞在體內源於II型上皮細胞，該上皮細胞是肺泡上皮的局部存在的前體細胞。在發育期間的天然肺中，I型肺細胞在沒有胎兒呼吸運動的情況下，不會完成最終的分化狀態(Inanlou等，2005，Dev Dyn233 :772_82)並且在組織學和TEM上保留立方形的形狀(Inanlou 等，2005，Histol Histopathol 20:1261-6)。在這些沒有定期供氧的培養中，I型肺細胞分化的缺少並不出乎意料的。確實表達水通道蛋白的細胞最可能來自沒有完全分化成I型上皮的局部前體細胞。因此，去細胞支架可支持肺上皮的附著和增殖。觀察到II型上皮的健全生長，以及克拉拉細胞和可能是完全分化的I型上皮細胞前體的細胞。我們在通過脈管系統灌注培養基的條件下，用僅偶爾的呼吸運動，觀察這些發現。上皮祖細胞重建觀察到去細胞支架上兩種類型肺上皮祖細胞的生長。據報導，對CCSP和SPC呈雙重陽性的細胞是局部祖細胞，稱為支氣管肺泡幹細胞，其能同時分化成克拉拉細胞和II 型肺細胞並在支氣管肺泡導管連接處被發現(Lane等，2007，Regenerative Medicine 2 407-15 ;Kim等，2005，Cell 121:823-35)。圖35顯示了這樣的雙重陽性細胞，發現其在結構上與末端細支氣管的外觀一致，這是所期望的這些細胞的生理位置。基底細胞為肺氣道的局部幹細胞；它們位於柱形上皮下面並且作為鄰近氣道上皮的再生性細胞源。圖36說明了對細胞角蛋白-14呈陽性的細胞，其是基底細胞標誌。作為對照，天然肺在圖36A中示出。另外，對細胞角蛋白-14和CCSP的雙重染色在圖37中示出， 其也說明了克拉拉細胞襯在氣道裡並且基底細胞在它們下方，與它們正常的解剖位置相一致。有時發現這些細胞在更大的氣道結構下方，與它們在天然肺中的位置相一致(圖36B)， 但也成簇地發現它們，似乎並不與大氣道相關聯(圖36C)。除了上皮和內皮細胞生長之外，間質細胞可重建去細胞肺支架。圖38顯示了 α_肌動蛋白的免疫螢光染色，其對平滑肌和肌成纖維細胞進行染色。在顯示有利於上皮生長的相同條件下培養這些工程組織。也觀察到，發現間質細胞位於發育的上皮結構下方以及之間，與它們在天然肺中的位置相一致。因此，在此顯示的結果證明了去細胞支架也是間質細胞生長的合適基底，並且成活的間質細胞被包含在新生兒肺細胞群內。培養基組合物對上皮分化的影響培養基類型可對細胞生長和分化產生顯著影響，並因此對工程肺組織的發育產生顯著影響。為了更詳細地研究這些差異中一些，用不含血清的培養基(BGJb)對含血清的培養基(DMEM+10%FBS)，比較了基於上皮分化的工程肺培養物的生長。在這些實驗中，首先將細胞接種到DMEM+10% FBS中的支架上，並允許在該培養基中培養2天，在此之後，發生逐步4天的向BGJb (不含血清)培養基的過渡，在純BGJb培養基中最後進行2天的培養。向不含血清的培養基的過渡引起了對表面活性物質表達的重大影響。觀察到，與DMEM+10% FBS比較，不含血清的培養基導致了表面活性物質(SPC)更頂端的表達(圖39C和39D)。 這符合用不含血清的培養基(BGJb)，在蛋白質印跡上產生的顯著增加的表面活性物質表達(圖40 ；比較標記有「DMEM」和「BGJb」的泳道)。另外，表面活性物質的形式與天然肺更一致得多(大多數表面活性物質記載為BGJb培養基中21kDa的前SPC形式)。
另外，向不含血清的培養基的過渡導致CCSP表達的減少，通過在圖43F和43E中的免疫螢光示出。在兩種培養基類型中，在發育的上皮結構的腔中觀察到擴散的CCSP表達。相信該表型是由於缺少灌注或供氧，因為這些培養在小組織片中進行。為了產生氣_液界面，首先在用培養基進行的供氧下，培養工程肺4天，以允許細胞附著和增殖。對於最後4天的培養，將供氧從培養基轉換到經過濾的室內空氣。利用空氣進行的供氧對氣道上皮產生了嚴重的損害，並對一些肺泡壁產生了破壞性改變(圖19)。因此，用於空氣供氧的一次量(tidal volume)從先前對液體或空氣呼吸的大約2. 0-2. 5ml的值，減少了大約50%，以盡力降低空氣供氧對天然肺產生的損害。沒有觀察到由於生物反應器中空氣供氧的存在而產生的細胞附著或形態學的改變。然而，觀察到在生物反應器中培養的工程肺通過空氣進行的供氧導致水通道蛋白的誘導表達，這是I型上皮的分化標誌。這在實質的細胞中一通常僅對表面活性蛋白C(II型上皮的指示)染色，以及發育的上皮結構中立方細胞的偶爾染色中也注意到。所觀察到的染色形式表明，很有可能大多數水通道蛋白-表達細胞也表達SPC。如可從圖42B所見的， 實質中的基本上所有細胞都表達SPC，而實質細胞的子集表達AQP (圖41A)。這些發現高度表明氣_液界面正在誘導II型上皮向I型上皮分化。II型上皮是 I型上皮的已知局部祖細胞，因此該分化並不出乎意料(Adamson等，1974，Lab Invest 30: 35-42 ；Fehrenbach, 2001, Respir Res2 :33_46)。此外，觀察到在空氣供氧工程肺中減少的表面活性蛋白C的表達，如圖40所示(將泳道「ALI」與用培養基(「Vent」)進行供氧並灌注(「Perf」)的肺相比較)。這也與II型向I型上皮的分化相一致。另外，觀察到許多有纖毛的上皮細胞的生長，如圖42所示。這可能是引入空氣界面的結果。當在體外培養氣道上皮時，細胞從液體過渡到空氣界面誘導了纖毛表達(You等，2002，Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 283 :L1315_21 ;Davidson 等，2004，J Cyst Fibros 3Suppl2 :59_62)。此夕卜， 缺少氣-液界面可導致減少的纖毛形成(Ostrowski等，1995，Exp Lung Res 21:957-70; Yeh等，2007，Laryngoscopel 17 1439-44)。因此，在一些情況中，空氣界面對體外肺組織的再生具有重要影響。在工禾別市組會只中，灌灃禾共氧J(寸上皮結構發育的景如向灌注和供氧可對生物反應器中的肺組織培養產生顯著影響。供氧也對肺上皮發育產生顯著影響，包括I型和II型肺細胞的分化(Inanlou等，2005，Histol Histopathol 20 1261-6 ；Inanlou 等，2005，Dev Dyn233 :772_82 ；Inanlou 等，2005，Dev Dyn 232 :43_54)。 因此，比較了在生物反應器中8天的培養期間，灌注和供氧對工程肺發育的影響。對於這些實驗，條件與在別處所討論的驗證實驗期間使用的條件相同，用DMEM+10% FBS的培養基、 未包被的支架和未分類的新生兒肺細胞群。然而，培養物通過脈管系統以2ml/min進行灌注或用培養基以1次呼吸/min進行連續供氧。形成對CCSP陽性染色的上皮結構的很多細胞如圖50所示。觀察到在供氧的培養物中對CCSP的染色，但細胞獲得呈更平坦的形態。這可表明供氧正在誘導CCSP表達細胞向肺泡上皮(I型或II型肺細胞)分化。
在缺少供氧的情況下，發育的上皮結構的腔被嗜酸性並因此可能為蛋白質性質的材料充滿，在圖43中的H&E染色上可見。該材料也對CCSP陽性染色，如圖45所示。CCSP 的積聚表明襯在這些上皮結構內的克拉拉細胞正在產生CCSP。另外，供氧材料的去除表明氣道樹仍然是完整的並能引導流體，此外表明這些發育的上皮結構是氣道樹的一部分並且沒有在基質內隨意地增殖。灌注較之供氧沒有對SPC的表達產生顯著影響，如圖46所示。大多數細胞在同時處於供氧和灌注條件下對SPC呈陽性。實施例5 工稈肺組織中的內皮發育設計以下的實驗以確定去細胞支架是否能夠支持工程肺內皮的生長，並評估了幾個具體因素對工程內皮發育的影響，關注這些因素影響脈管和氣道區室之間功能性內皮屏障形成的能力。現在描述在這些實驗中所使用的材料和方法。材料和方法支架製備如在本文別處所述的，製備去細胞支架。新牛兒細胞分離和接種如在本文別處所述的，分離新生兒大鼠肺細胞。如在本文別處所述的，將細胞接種到支架內。內皮細胞培養大鼠肺微脈管內皮細胞從VEC Technologies (Renssalaer,NY)獲得並在纖維結合素包被的(大約1 μ g/cm2,Gibco)組織培養器皿上、在包括10% FBS和補充生長因子(VEC Technologies)的MCDB-131完全培養基中生長。工程內皮培養的優化條件在37°C下，用在60ml PBS中通過脈管系統灌注的Img纖維結合素(Gibco)包被支架，隨後用PBS和培養基衝洗支架。將每個支架在培養的0天和2天或3天時，在每個時間點用8百萬-1千萬大鼠肺微脈管EC接種兩次(對於兩次接種中的每一次，每個肺使用兩個T150培養瓶)。用0.25%胰蛋白酶(Gibco)將來自組織培養平板的細胞進行胰蛋白酶消化，通過40 μ m濾紙過濾以去除細胞凝塊，並作為大約3ml培養基中的快速灌注注射液注入肺動脈。在使細胞粘著1小時後，以大約1.5ml/min通過脈管系統開始灌注。在1_2小時後，對於7-10天培養期間的剩餘時間，將灌注速率增加到3ml/min。培養基每3_4天更換。免疫螢光如在本文別處所述的，製備組織樣品並染色。透射電子顯微鏡(TEM)如在本文別處所述的，製備樣品並分析。微顆粒保留開展分析以評估整個大鼠肺對較小顆粒的可滲透性，所述較小顆粒具有大的大分子量級的大小。在該分析中，確定穿過氣道-脈管屏障的FITC標記的葡聚糖溶液的滲漏量。 從Sigma (St Louis, M0)獲得具有2，000，OOODa分子量的FITC標記的葡聚糖。通過測量天然肺和用0. 025%胰蛋白酶處理2min的天然肺的可滲透性進行分析驗證。用肝素化PBS灌注肺並將其與普通的生物反應器套管相連接。獲得基線灌洗樣品，隨後用IOml含0. 025% 胰蛋白酶的PBS灌注胰蛋白酶處理的肺並使其在室溫下留置2min，隨後用IOml的PBS進行衝洗。將FITC標記的葡聚糖溶液(lmg/ml)注入肺動脈，隨後用20ml的PBS進行衝洗。隨後立即將兩種灌洗樣品從氣管中連續取出。用螢光平板讀出器測量螢光，並且數據符合標準曲線。當在去細胞肺或工程肺上進行時，該分析通過氣道進行，如用微球分析(見3. 2. 9 節)。因此，將FITC葡聚糖注入氣道，並用PBS衝洗脈管系統。現在描述實驗結果。細胞源使用商業購得的大鼠肺微脈管EC源。當將這些細胞接種到用纖維結合素包被並在EC特異性培養基的存在下進行培養的支架上，觀察到內皮細胞的大量生長，如圖 47所示。內皮篩選實驗概括在本文別處所討論的篩選實驗允許確認一組與工程內皮培養相容的條件。主要通過組織學評價細胞成活率的結果和基於免疫螢光評價PECAM表達的結果。這些小試驗研究的結果為使支架內的內皮細胞生長得以實現的一組條件，以便能系統地評估分離條件對工程肺內皮的影響。確認為適合工程內皮培養的條件是純化的、在體外擴張的大鼠肺微脈管EC群的使用；纖維結合素包被的支架；以及EC特異性培養基(具有10% FBS和補充生長因子的 MCDB-131)的使用。FITC葡聚糖可滲誘件分析的驗證開展了評估整個大鼠肺對小顆粒的可滲透性的分析，所述小顆粒具有大的大分子量級的大小。在該分析中，確定穿過氣道-脈管屏障的FITC標記的葡聚糖溶液的滲漏量。 該分析可在培養過程中重複使用，包括細胞培養友好的材料，並提供整個肺可滲透性的測量。另外，如果在固定前立即進行該分析，則能用抗FITC抗體在組織切片上確認FITC葡聚糖。FITC標記的葡聚糖具有2，000，OOODa的分子量。對於單分散葡聚糖， Stokes-Einstein 半徑(nm)與 rs = 0. 0488 (MW) 0. 437 的分子量有關(Venturoli 等， 2005,Am J Physiol Renal Physiol 288 :F605_13 ；Oliver等，1992，J Am Soc Nephrol 3 214-28)。對於2MDa葡聚糖，這產生27.7nm的半徑。該分析通過評估天然肺和通過用稀釋的胰蛋白酶進行脈管系統短暫灌注的「滲漏」天然肺的可滲透性進行驗證。將FITC標記的葡聚糖溶液注入肺動脈，隨後用鹽水進行衝刷。隨後立即將兩種灌洗樣品從氣管中連續取出。如圖48所示，如預期的，由於附著在基底膜上的內皮的破裂，通過胰蛋白酶處理的肺的可滲透性增加。然而，儘管通過該分析向天然肺提供了可測量的滲漏，但脈管可滲透性的下降是動物處死和葡聚糖注射之間延遲以及肺組織操作的結果。當在去細胞肺或工程肺上進行時，該分析通過氣道進行，如用微球分析一樣。因此，將FITC葡聚糖注入氣道，並用鹽水衝刷脈管系統。將改變位置進入脈管區室的葡聚糖作為滲漏進行測量。以這種方式進行分析，因為在去細胞肺或工程肺中，組織對流體是高度可滲透的，並且在氣道灌洗後，不能獲得返回的樣品。因此，將葡聚糖以快速灌注灌洗的形式注入氣道，並且衝刷脈管系統以測量穿過氣道_脈管屏障的FITC-葡聚糖的滲漏。灌注相較於供氧對工程肺內皮的影響
設計以下的實驗以評估特定條件對工程內皮組織發育的影響，關注於功能性內皮屏障的形成。比較了用灌注相較於供氧培養工程肺內皮的作用。關於內皮細胞存活和增殖以及用透射EM的細胞間連接形成，評估了供氧和灌注二者。觀察到灌注大大提高了工程肺內皮的生長，如圖48中的組織學所示。另外，對於供氧，觀察到更多的凋亡細胞，如圖49所示，並且與它們在H&E組織學上不良的外觀相一致。另外，用透射EM和VE-鈣黏著蛋白染色，分析灌注和供氧的培養物的細胞連接的存在。內皮細胞之間的緊密連接是屏障功能的重要方式，因為它們將相鄰的細胞緊密地連接在一起並因此阻止了在這些細胞間的空隙之間流體的運動(Majno等，1961，J Biophys Biochem Cytol. 11 :571_605)。如果這些細胞連接虛弱或不存在，則可能在脈管系統外發生流體滲漏並引起肺水腫(Orfanos 等，2004，Intensive CareMed 30 1702-14 ;Maniatis 等， 2008, Vascular Pharmacology 49:119—33)。利用TEM，觀察到灌注工程組織中的細胞間連接，如圖50所示。不是所有的細胞都顯示了緊密連接的形成。針對VE-鈣黏著蛋白，用免疫螢光評價細胞連接形成。在灌注工程肺內皮中發現 VE-鈣黏著蛋白的穩固染色，如圖51所示。由於供氧組織在組織學和TEM上不良的外觀，沒有針對VE-鈣黏著蛋白進行供氧組織的染色。工稈肺內皮屏障功能的評價設計以下實驗，以評估工程肺內皮在脈管床和空隙之間形成功能性屏障的能力。 這對減少流體滲入肺泡是重要的，並因此使氣體交換得以實現，其是針對工程肺組織的目標的關鍵組成部分。為了評估由肺內皮提供的屏障功能，用可滲透性分析測量從空隙進入脈管系統的小(55nm)FITC葡聚糖顆粒的位置改變。如在本文別處所述的，開展該分析並進行驗證。對於該分析，將FITC葡聚糖注入氣道區室，並且通過用鹽水衝刷脈管系統測量穿過肺泡_脈管屏障的滲漏量。對於去細胞支架，基本上對這樣小的顆粒沒有屏障功能，基本上所有的(98.4%)葡聚糖都改變了在肺泡的位置，進入脈管系統，並且通過脈管衝洗進行回收。這與天然肺形成對照，當進行類似處理時天然肺顯示了 12. 9%的滲漏(圖52)。在灌注的工程肺內皮組織中，顯示了在7-10天的培養期後，氣道區室中多達30% 的葡聚糖保留。供氧的內皮組織顯示了 87%的可滲透性。這些對灌注工程肺內皮的發現，特別當結合通過免疫螢光的穩固VE-鈣黏著蛋白表達(圖51)以及通過TEM的細胞間連接形成的發現時，表明已經發生了工程內皮組織中功能性內皮屏障的形成。圖63是說明工程組織最大抗拉強度的圖表。也示出了天然肺和去細胞肺的強度。 該圖顯示工程組織的最大抗張應力可與天然肺和去細胞基質二者的相當。因此，在再細胞化過程後維持了組織工程肺的機械性質。實施例6 肺細胞治療在此顯示的結果說明了去細胞肺組織在哺乳動物中進行肺細胞治療的用途。通常，步驟包括氣管的去細胞化，在去細胞氣管組織內檢測細胞外基質組分，在去細胞氣管基質上培養人支氣管(大氣道)和小氣道肺上皮細胞，用期望的基因對人肺上皮細胞進行基因治療，以及通過滴注將人肺上皮細胞滴注入肺，並證實在接受者肺中的細胞附著和存活。氣管的去細胞僕,收穫豬氣管並在PBS進行衝洗以去除血。剪下一塊並用10%中性緩衝的福馬林進行固定，包埋入石蠟並剪成5-mm切片。將剩下的剪成5個環並在CHAPS緩衝液(pH13. 5) 中攪拌溫育2-24小時，在2h、4h和8h時間點更換CHAPS緩衝液。在所指出的時間，將組織從CHAPS緩衝液中移出並用PBS進行衝洗。剪下一塊並用10%福馬林進行固定，進行處理以進行組織學分析，以證實去細胞化。觀察到通過在CHAPS緩衝液中溫育4-8小時製備的去細胞氣管維持了膠原基質並且大部分細胞從組織中去除(除了軟骨層之外)。見圖55。以下的實驗基於為製備去細胞氣管的6h CHAPS攪拌溫育。設計這些實驗，以在去細胞化之前和之後檢測氣管中的細胞外基質。簡單地說，從天然氣管和去細胞氣管上剪下一塊組織並用10%福馬林進行固定。用H&E和Masson三色法對5 μ m石蠟包埋切片進行染色。也針對細胞外基質蛋白，對石蠟包埋切片進行免疫染色，所述細胞外基質蛋白包括膠原(COL)、纖維結合素(FN)和層粘連蛋白(LN)。將切片進行脫蠟、再水合、抗原提取(利用蛋白酶K)和封閉。將室內培養的兔抗人FN、COL I、COL III、C0L IVXOL V或LN抗體應用於切片，隨後為Alexa Fluor 546結合山羊抗兔IgG。用 DAPI對切片進行復染。觀察到天然氣管對COL IXOL III、C0L V呈陽性染色，但對於其他 ECM蛋白不是這樣。去細胞氣管包含在天然氣管所見的所有三種類型的C0L。見圖56。這些結果表明去細胞氣管組織支持氣道上皮細胞在體外的粘附、生長和分化。在去細胞氣管組織上生長氣道上皮細胞設計下一組實驗以在去細胞組織上生長細胞。簡單地說，在支氣管上皮生長培養基(BEGM)中培養人支氣管/氣管上皮細胞(NHBE)。用無菌PBS全面(至少24h)衝洗去細胞氣管(6h CHAPS緩衝液溫育)。將軟骨層(以及外膜層)剝離，留下氣管黏膜層和黏膜下層，用於隨後的細胞接種。將組織剪成大約5X5cm2的大小並放在6孔平板的Transwell 小室(insert) (0. 4 μ m孔大小)上，上皮表面面朝上。如下在去細胞氣管組織上接種細胞。將50 μ 1細胞(3. 5 X IO6個細胞/ml)加到去細胞氣管組織的上皮表面，並在37°C溫育30min。隨後將新鮮培養基加到Transwell小室的上側和下側，並將細胞溫育額外的時間。在規定的時間，將組織從Transwell上移出並用10%福馬林固定。用H&E將石蠟包埋的5μπι切片進行染色。觀察到去細胞氣管支持 NHBE粘附和生長。見圖57。設計下一組實驗以在去細胞組織上生長轉基因轉染的人小氣道上皮細胞(SAEC)。 簡單地說，用GFP逆轉錄病毒對人SAEC轉染6h。如下在6孔平板中、在去細胞氣管組織上生長細胞。將50 μ 1細胞(5Χ IO6個細胞/ml)加到去細胞氣管組織的上皮表面(大約 0.5X1. Ocm2)上並在37°C下溫育30min。隨後加入新鮮培養基並將細胞溫育額外的時間。 觀察到去細胞氣管也支持SAEC的粘附和生長。見圖58。另外，去細胞氣管支持已經用GFP 轉染的SAEC的粘附和生長，作為培養已經用目的基因轉染的人肺上皮細胞的原理證明。氣道上皮細胞的基因治療設計下一組實驗以確定用去細胞組織進行肺細胞基因治療的可行性。如下進行基因修飾。用Phoenix包裝細胞系製備EGFP (增強的GFP)逆轉錄病毒上清液。將EGFP DNA插入LZRSpBMN載體。NHBE和SAEC —直生長直到超過80%的匯合。在感染日，將細胞衝洗幾次並在37°C下用病毒上清液(包含8yg/mll，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物(polybrene))溫育6h。將細胞衝洗幾次並在新鮮培養基中溫育過夜。隨後用流式細胞術，針對GFP分析細胞。觀察到被感染的細胞對GFP呈陽性染色。例如，與未感染細胞相比，NHBE細胞對GFP顯示了 18. 5%的陽性染色。與未感染細胞相比，SAEC細胞對GFP顯示了 16%的陽性染色。在此顯示的結果說明在該培養系統中，用逆轉錄病毒感染帶有目的基因的人肺上皮細胞的能力。然而，本發明也包括其他遞送轉基因的方法。例如，設計下一組實驗以測試使用慢病毒系統的可形性。如下用GFP慢病毒進行感染。在無血清培養基的293T細胞中製備EGFP慢病毒上清液。用CMV啟動子將GFP DNA插入pSicoR載體。將NHBE接種到1 X IO5個細胞/孔的6 孔平板上並在37°C下溫育1天(80-90%匯合)。在感染日，將細胞衝洗幾次並隨後在37°C 下用病毒上清液(用新鮮BEGM進行1 3稀釋)(包含8yg/ml 1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物)溫育6h。將細胞衝洗幾次並隨後用新鮮培養基溫育額外的2天。 用4%仲甲醛固定細胞30min並在顯微鏡下檢查。見圖59。結果總結在表2中表 權利要求
1.一種能夠支持細胞生長的去細胞組織，其中所述去細胞組織顯示出去細胞化前相應天然組織的特性。
2.根據權利要求1所述的去細胞組織，其中所述組織為肺。
3.根據權利要求1所述的去細胞組織，其中所述去細胞組織顯示出與去細胞化前其他相同組織的形態基本相似的形態。
4.根據權利要求1所述的去細胞組織，其保留了所述相應天然組織的細胞外基質，其中所述細胞外基質包括外表面，並且其中所述外表面是基本上完整的。
5.根據權利要求1所述的去細胞組織，其中免疫原性標誌已經基本上被去除。
6.根據權利要求1所述的去細胞組織，其顯示出與所述相應天然組織的機械性質基本上相似的機械性質。
7.一種包括三維支架和細胞群的組合物，其中所述組合物能夠支持和維持肺細胞的分化狀態。
8.根據權利要求7所述的組合物，其中所述三維支架是去細胞組織。
9.根據權利要求7所述的組合物，其中所述組合物顯示出完整的氣道樹和脈管網。
10.根據權利要求7所述的組合物，其中所述群包括幹細胞。
11.根據權利要求7所述的組合物，其中所述群包括上皮細胞和內皮細胞。
12.根據權利要求7所述的組合物，其中所述細胞是基因修飾的。
13.根據權利要求7所述的組合物，其中所述組合物能夠支持和維持肺泡上皮細胞的分化狀態。
14.根據權利要求7所述的組合物，其中所述支架包括生物相容材料，其選自纖維結合素、層粘連蛋白、膠原、糖蛋白、血小板反應蛋白、彈性蛋白、肌原纖蛋白、黏多糖、糖脂、硫酸肝素、硫酸軟骨素、硫酸角質素、糖胺聚糖、透明質酸、蛋白聚糖、玻連蛋白、聚-D-賴氨酸、 多糖及其結合。
15.根據權利要求7所述的組合物，其包括顯示出與分支形態發生的誘導相關的基因表達的細胞。
16.根據權利要求7所述的組合物，其中所述基因是CFTR。
17.根據權利要求7所述的組合物，其包括肺組織的特性，其中所述特性選自分支形態發生、末端肺上皮細胞分化、上皮生長、脈管發育及其結合。
18.一種製作能夠支持和維持肺細胞分化狀態的工程三維組織的方法，所述方法包括用細胞群接種去細胞支架，以產生接種支架。
19.根據權利要求18所述的方法，其中所述去細胞支架顯示出完整的氣道樹和脈管網。
20.根據權利要求18所述的方法，其中所述群包括幹細胞。
21.根據權利要求18所述的方法，其中所述群包括上皮細胞和內皮細胞。
22.根據權利要求18所述的方法，其中所述細胞是基因修飾的。
23.根據權利要求18所述的方法，其中所述去細胞支架能夠支持和維持肺泡上皮細胞的分化狀態。
24.根據權利要求18所述的方法，其中所述支架包括生物相容材料，其選自纖維結合素、層粘連蛋白、膠原、糖蛋白、血小板反應蛋白、彈性蛋白、肌原纖蛋白、黏多糖、糖脂、硫酸肝素、硫酸軟骨素、硫酸角質素、糖胺聚糖、透明質酸、蛋白聚糖、玻連蛋白、聚-D-賴氨酸、 多糖及其結合。
25.根據權利要求18所述的方法，其包括顯示出與分支形態發生的誘導相關的基因表達的細胞。
26.根據權利要求18所述的方法，其中所述基因為CFTR。
27.根據權利要求18所述的方法，其中所述工程三維組織顯示出肺組織的特性，其中所述特性選自分支形態發生、末端肺上皮細胞分化、上皮生長、脈管發育及其結合。
28.一種根據試驗劑調整肺組織健康的能力篩選所述試驗劑的體外方法，所述方法包括將所述試驗劑接觸工程三維肺組織模型，並測量所述試驗劑對所述模型的影響，其中對所述模型的任何改變都是所述試驗劑能夠調整肺組織健康的指示。
29.根據權利要求觀所述的方法，其中所述工程三維組織來源於去細胞支架。
30.根據權利要求觀所述的方法，其中所述試驗劑選自化學劑、藥物、肽、核酸和輻射。
31.根據權利要求觀所述的方法，其中所述試驗劑是治療劑的遞送載體。
32.根據權利要求觀所述的方法，其包括確定所述試驗劑對細胞數、面積、體積、形狀、 形態、標誌表達或染色體斷裂的影響。
33.根據權利要求觀所述的方法，進一步包括選擇對所述肺組織模型具有期望作用的試劑的步驟。
34.一種減輕或治療哺乳動物的肺缺陷的方法，所述方法包括向所述哺乳動物施用治療有效量的組合物，所述組合物包括能夠支持和維持肺細胞分化狀態的三維構建體，由此減輕或治療所述哺乳動物的所述肺缺陷
35.一種可植入的組合物，其包括能夠支持細胞生長的去細胞組織，其中所述去細胞組織顯示出去細胞化前相應天然組織的特性。
36.根據權利要求35所述的組合物，其包括細胞群，其中所述組合物能夠支持和維持肺細胞的分化狀態。
37.根據權利要求36所述的組合物，其中所述群包括幹細胞。
38.根據權利要求36所述的組合物，其中所述群包括上皮細胞和內皮細胞。
39.根據權利要求36所述的組合物，其中所述細胞是基因修飾的。
全文摘要
本發明涉及包括去細胞組織的組合物。本發明也提供顯示出天然肺組織特性的工程三維肺組織。該工程組織可用於肺發育生物學和病理學的研究以及藥物發現。
文檔編號C12N5/00GK102388127SQ201080015120
公開日2012年3月21日 申請日期2010年2月4日 優先權日2009年2月4日
發明者E·凱利, L·E·尼克拉森, L·歸, T·派特森 申請人:耶魯大學