一種口腔生物膜動態模型裝置及其形成口腔生物膜的方法

2023-05-22 10:07:01

專利名稱：一種口腔生物膜動態模型裝置及其形成口腔生物膜的方法
技術領域：
本發明涉及一種口腔生物膜動態模型裝置及其形成口腔生物膜的方法，屬於生物膜口腔醫療模型器械或者口腔醫學領域。
背景技術：
作為單細胞的生命形式，細菌在長期以來的研究中始終以游離於液體培養基中的單細胞狀態作為研究對象，這樣在最大程度上簡化了外界環境的影響，也獲得了大量的研究成果，為現代微生物學奠定了基礎。然而在自然狀態下，細菌很少以這種游離於純培養中的形式而存在。生物膜是細菌最常見的生存形式，是指在固態的有機或無機介質表面，大量微生物集聚於胞外多糖構成的基質內並互相交聯而形成的微生物生態環境。
在醫學領域中，生物膜病佔據了80％以上的微生物感染性疾病。生物膜通過其理化屏障的作用，給致病菌提供了抵禦外部刺激的優良生態環境，而在其中發展的基因傳導與接合，也有利於不同微生物間對耐藥基因的水平傳遞從而對傳統的抗生素療法造成很大的困難。危害人類口腔健康的主要疾病齲病，其主要致病因素也是以變形鏈球菌為主構成的致齲性生物膜(牙菌斑)。
在齲病的細菌學研究中，由於口腔生態環境的複雜性，要在體內研究某種或某些細菌與齲病的關係是非常困難的，因此，建立起能模擬口內環境的口腔生物膜模型，有利於在體外進行高可信度的口腔微生物學研究，獲得比傳統細菌學實驗更加準確和全面的結果。生物膜模型能在體外創造一種與體內近似的生態環境，調控細菌的生長代謝條件，使之既具有與天然環境的一致性，又具有標準化和可調控性的顯著優點，用生物膜模型來進行口腔生物學實驗與簡單的體外實驗相比，可信度更高，可重複性更好，是一種很有潛力的實驗手段。
生物膜模型系統主要目的在於儘可能地模擬出口腔內生態環境，以及將這一人工環境維持於穩定的狀態。目前國內劉正等報導的相關生物膜模型(中華口腔醫學雜誌.1996；31(2)110-112.)僅為簡易的恆化器細菌培養系統，雖能滿足基本的微生物連續培養要求，但其結構龐雜，核心部件為發酵罐連續靜態培養，仍不能有效模擬出口腔內部唾液等營養液持續不斷的流動環境，且對於汙染的控制欠佳；而國外的同類產品，如Sissons等於Journal of Dental Research，1991，70(11)1409-16報導多工作站人工口腔系統(MAM)與Kinniment等建立的恆厚生物膜模型(Microbiology，1996，142，631-638)，儘管對環境條件的控制精度高，但其結構複雜，對外圍設備的精度要求相應也高，故其價格昂貴，應用成本居高不下，儘管對口腔環境模擬良好但仍無法獲得推廣應用。
本發明者在前期研究中建立了由變形鏈球菌、血液鏈球菌、唾液鏈球菌、內氏放線菌等組成的多菌系生物膜模型，中國專利03135320.7題為《口腔生物膜模型裝置及其口腔生物膜形成的方法》，實驗證明該模型具有較好的可靠性與可重複性，能夠用於對口腔生物膜的各項體外研究。然而，在實驗當中我們也發現該模型也存在一些缺陷，首先，該生物膜模型僅能對模型中特定並唯一時間點的生物膜形成狀況進行觀察，所得數據有限，難以實現對實驗性生物膜形成過程的全程實時檢測。其次是該模型的核心部件恆流培養室為不規則外形，難以作到標準化，在實驗中難以控制各恆流培養室的清除率達到一致，使得各恆流培養室難以作到真正意義的平行可比。因此，本發明者對已有生物膜模型的恆流培養室進行了一定的改造，改用標準外形的器件，並根據需要在其頂部設置了多個開口，可以放置多個固定標本的加樣器，同時也可以安裝多種檢測裝置(如pH記錄儀，氧化還原電勢記錄儀)的探頭。在此基礎之上開發出了一種口腔生物膜動態模型裝置及形成口腔生物膜的方法，實現了對人工菌斑生物膜的連續實時檢測，得到了大量有意義的實驗結果，為齲病的病因和發病機制、篩選防齲藥物、評估藥物防齲效能和研究藥物作用機制提供了有力的技術平臺，經檢索未見有類似的文獻報導。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術的不足而提供一種可以對人工菌斑生物膜進行連續檢測的口腔生物膜動態模型裝置及其形成口腔生物膜的方法，其特點是將多個羥磷灰石片(HA Discs)置於含有定量實驗菌株的連續培養系統中，定時給以蔗糖溶液以提供實驗細菌無氧酵解所需的底物，使細菌在羥磷灰石表面形成實驗性生物膜即人工菌斑，然後在生物膜形成過程中的不同時期取出羥磷灰石片，檢測其表面形成生物膜的各項生物學指標，以對實驗性生物膜的形成過程進行全面的檢測，實現對各種防齲藥物幹預實驗性生物膜及齲病形成的全程實時檢測，進而確定防齲藥物的作用效果和作用機制。
本發明的目的由以下技術措施實現口腔生物膜動態模型裝置含有鹼液罐、培養基罐、發酵罐、恆流培養室和加樣瓶。其中恆流培養室為多個豎式標準圓柱形培養室串聯連接，鹼液罐通過蠕動泵與發酵罐連接，培養基罐通過蠕動泵與發酵罐連接，發酵罐通過過濾器和蠕動泵引入惰性氣體N2和CO2，發酵罐通過蠕動泵和過濾器向外排出廢液、廢氣，發酵罐通過蠕動泵和恆流培養室連接，每個恆流培養室通過蠕動泵和過濾器向外排出廢液、廢氣，培養基罐和加樣瓶分別通過蠕動泵與多個恆流培養室連接。
發酵罐為夾層，夾層內設循化水浴進口和出口，罐內置pH控制電極，發酵罐置於電磁攪拌器上。
恆流培養室為豎式標準圓柱形，恆流培養室頂部設有多個加樣器，根據實驗要求在多個加樣器上放置多個固定標本，固定標本為羥磷灰石，加樣器垂直放置於恆流培養室內部，恆流培養室內設多通道pH記錄儀電極和廢液、廢氣排出口，恆流培養室放置在恆溫培養箱內恆溫孵育，由電磁攪拌器提供30rpm左右的攪拌速度以模擬口腔環境內唾液流動的動態環境。
羥磷灰石片由四川大學華西口腔醫學院口腔生物醫學工程重點實驗室材料研究室提供。
口腔生物膜的形成方法1、動態模型裝置無菌連接完成之後，將發酵罐置於電磁攪拌器上，獲得30-100ppm的攪拌速度，溫度由循環水浴箱維持在37℃左右，鹼液罐提供鹼性溶液使發酵罐內菌懸液的液相pH值維持在7.0左右，鹼性溶液的加入由pH控制器和蠕動泵調節，待各菌生長穩定後備用。
2、培養基罐內盛有人工唾液培養基BM-5作為實驗菌的主要營養來源，由蠕動泵向發酵罐和恆流培養室內恆速加入。
3、加樣瓶內盛有防齲藥物和蔗糖溶液，由分配器和蠕動泵控制向恆流培養室內加入，以提供實驗生物膜致齲的底物蔗糖以及所研究的防齲藥物，根據研究目的可以採用不同的藥物和藥物濃度。
4、恆流培養室置於密封的恆溫培養箱內，由電磁攪拌器提供30ppm左右的攪拌速度以模擬口腔環境內唾液流動的動態環境。
5、根據實驗要求，在恆流培養室內放置多個加樣器，在實驗過程中，按照要求的時間間隔，連續取出加樣器，檢測加樣器上羥磷灰石表面形成的生物膜的各項生物學指標，直到全部加樣器取盡為止，從而實現了對實驗性生物膜形成過程的縱向連續實時監測。
本發明具有如下優點1、能有效模擬口內生態環境並穩定地形成實驗性生物膜，已通過大量研究驗證了其在齲病學與口腔材料學的應用效能。
2、採用多通道並聯培養技術，能同時比較不同生物膜處理措施的差別，也極大地簡化了工作流程，更便於使用。
3、可以在實驗過程中的多個時間點連續取出標本，檢測標本表面生物膜的形成狀況。根據實驗要求設置標本的數量，可以實現對實驗性生物膜的全程實時監測。
4、選用的主要設備均為市場上常用產品，成本控制良好，與國際同類產品比較，具有相當好的價格優勢。
5、採用密閉培養方式從而有效地控制了汙染在模型內的發生。
四

圖1為口腔生物膜動態模型裝置示意圖1、鹼液罐2、培養基罐3、發酵罐4、豎式標準圓柱形恆流培養室5、羥磷灰石片6、加樣器7、加樣瓶8、電磁攪拌器9、恆溫水浴箱10、多通道pH測量儀11、電磁攪拌器12、廢液出口13、廢氣出口P1-P7為蠕動泵F1-F3為濾器圖2為豎式標準圓柱形恆流培養室結構示意3為恆流培養室液相各處理組pH的動態變化圖4為不同時間各處理組羥磷灰石表面生物膜各菌生長曲線a、不同時間處理組HAdisc表面生物膜S.mutans生長曲線b、不同時間處理組HAdisc表面生物膜S.sanguis生長曲線c、不同時間處理組HAdisc表面生物膜A.naeslundii生長曲線d、不同時間處理組HAdisc表面生物膜L.rhamnosusi生長曲線圖5為不同時間各處理組羥磷灰石表面生物膜各菌構成圖a、不同時間25mM蔗糖組HAdisc表面生物膜細菌計數b、不同時間4000ppm五倍子組HAdisc表面生物膜細菌計數c、不同時間蒸餾水組HAdisc表面生物膜細菌計數圖6為實驗組生物膜形態的螢光顯微鏡觀FM×200A24小時，B48小時，C72小時，D96小時，E120小時圖7為陰性對照組生物膜形態的螢光顯微鏡觀FM×200A24小時，B48小時，C72小時，D96小時，E120小時圖8為空白組生物膜形態的螢光顯微鏡觀FM×200A24小時，B48小時，C72小時，D96小時，E120小時五具體實施方式
下面通過實施例對本發明進行具體的描述，有必要在此指出的是本實施例只用於對本發明進行進一步說明，但不能理解為對本發明保護範圍的限制，該領域的技術熟練人員可以根據上述本發明的內容作出一些非本質的改進和調整。
實施例口腔生物膜動態模型裝置如圖1-2所示，含有鹼液罐1、培養基罐2、發酵罐3、恆流培養室4和加樣瓶7。鹼液罐1通過蠕動泵P1與發酵罐3連接，其中，恆流培養室為多個豎式標準圓柱形恆流培養室串聯連接。培養基罐2通過蠕動泵P2與發酵罐3連接，發酵罐3通過濾器F2和蠕動泵P4引入惰性氣體N2和CO2，發酵罐3通過蠕動泵P5和濾器F1排出廢液、廢氣，發酵罐3通過蠕動泵P6與多個並聯恆流培養室4連接，每個恆流培養室4通過蠕動泵P7和過濾器F3向外排出廢液、廢氣，培養基罐2和加樣瓶7分別通過蠕動泵P2、P3與多個恆流培養室4並聯連接。發酵罐3通過循環水浴保持罐內溫度為37℃，罐內放置pH控制器，維持液相pH值在7.0左右，發酵罐3置於電磁攪拌器8上。每個恆流培養室4內垂直放置有多個加樣器6，每個加樣器6上固定有羥磷灰石片5，恆流培養室4內同時安裝有多通道pH測量記錄儀電極10和廢液排出口12、廢氣排出口13，恆流培養室4放置於恆溫培養箱9內37℃恆溫孵育，由電磁攪拌器11提供30rpm左右的攪拌速度模擬口腔環境內唾液的流動循環。恆流培養室和加樣器可用玻璃、塑料或金屬製作。羥磷灰石片由四川大學華西口腔醫學院口腔生物醫學工程重點實驗室材料研究室製作提供。
口腔生物膜的形成方法1、動態模型裝置無菌連接完成之後，將發酵罐3置於電磁攪拌器8上，獲得30-100ppm的攪拌速度，溫度由循環水浴箱維持在37℃左右，鹼液罐1提供鹼性溶液使發酵罐內菌懸液的液相pH值維持在7.0左右，鹼性溶液的加入由pH控制器和蠕動泵P1調節，待各菌生長穩定後備用。
2、培養基罐2內盛有人工唾液培養基BM-5作為實驗菌的主要營養來源，由蠕動泵P2向發酵罐3和每個恆流培養室4內恆速加入。
3、加樣瓶7內盛有防齲藥物和蔗糖溶液，由分配器和蠕動泵P3控制向每個恆流培養室4內加入，以提供實驗生物膜致齲的底物蔗糖以及所研究的防齲藥物，根據研究目的可以採用不同的藥物和藥物濃度。
4、恆流培養室4置於密封的恆溫培養箱內，由電磁攪拌器11提供30ppm左右的攪拌速度以模擬口腔環境內唾液流動的動態環境。
5、根據實驗要求，在恆流培養室內放置多個加樣器6，在實驗過程中，按照要求的時間間隔，連續取出加樣器6，檢測加樣器上羥磷灰石5表面形成的生物膜的各項生物學指標，直到全部加樣器取盡為止，從而實現了對實驗性生物膜形成過程的縱向連續實時監測。
以下為本模型裝置在齲病學研究中的應用實例1.實驗菌株變形鏈球菌 Streptococcus mutans ATCC 25175
血鏈球菌Streptococcus sanguis ATCC 10556內氏放線菌 Actinomyces naeslundii WVU 627乳酸桿菌Lactobacillus rhamnosus AC 413以上菌株均由華西口腔醫學院口腔生物醫學工程重點實驗室提供。
2.培養條件2.1發酵罐培養條件溫度37℃由循環水浴箱維持；攪拌低速，由磁力攪拌器8控制，使發酵罐中菌懸液混勻；厭氧環境95％N2，5％CO2，流速10ml/min，由蠕動泵P4控制；pH用0.1N NaOH溶液維持在0.7左右，由Ph控制儀與蠕動泵P1調節；清除濾D＝0.1/hr由蠕動泵P5控制。
2.2恆流培養室培養條件溫度37℃由循環水浴箱維持攪拌低速，由磁力攪拌器11控制，提供生物膜形成過程中需要的剪切力清除率D＝0.75/hr由蠕動泵P7控制給樣恆流培養室內各實驗菌生長達到穩定後，每12小時給樣1次，每次給樣量為生物膜連續培養系統總容積的1/10，加樣由蠕動泵P3及分配器控制。
3.實驗流程本實驗為模擬牙齒表面菌斑生物膜的形成，採用羥磷灰石片(HA Discs)置於含有實驗混合菌株的連續培養系統中，以在其表面形成多菌系生物膜。模型中的發酵罐為實驗混合菌的儲庫，而與發酵罐相連的數個平行的恆流培養室為實驗生物膜形成的場所。
實驗開始時，將在TPY固體培養基中復甦的變形鏈球菌、乳酸桿菌、血鏈球菌與內氏放線菌傳代，經過生化鑑定後接種到發酵罐的人工唾液培養基中進行連續培養，其pH值由pH控制器控制平衡，新鮮人工唾液培養基由蠕動泵連續加入。基礎連續培養達到穩定之後，將發酵罐中的混合菌懸液通過蠕動泵加入到各個平行的恆流培養室中，同時向各恆流培養室中加入新鮮的人工唾液培養基，細菌與新鮮培養基的比例為1∶9(v/v)，24小時後停止接種細菌，繼續加入新鮮人工唾液至各恆流培養室中進行連續培養。每日對恆流培養室液相環境中的細菌進行生長檢測，待各恆流培養室中的混合菌連續培養達到穩定之後(連續三日無顯著差異)，在各恆流培養室中插入多個固定有HA Discs的加樣器，使HA Discs完全浸入混合菌懸液中，同時將處理溶液加入恆流培養室中(1次/12小時，每次加入體積為恆流培養室溶液體積的1/10)，此後，按照24小時的時間間隔連續從恆流培養室中取出一個加樣器，對HA Discs表面形成的生物膜進行細菌計數、結構觀察，直至恆流培養室中的加樣器取盡為止。
4.人工唾液本實驗採用的人工唾液配方為生物膜改良培養基BM-5III型豬胃粘蛋白(Hog gastric mucin，Type III，Sigma) 2.50g/l肽腖(Proteose peptone，Fluka) 2.00g/l胰酶分解酪蛋白腖(Peptone from casein，tryptic digest，Fluka) 1.00g/l酵母提取物(Yeast extract，Oxoid) 1.00g/l氯化鉀(KCl) 2.50g/l葡萄糖(Glucose) 0.50g/l胱氨酸鹽酸鹽(Cystiene-Hydrochloride，Sigma) 0.10g/l氯化血紅素(Heamin，上海東風生化技術公司) 1.00mg/l四川大學博士學位論文14磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O) 0.114g/l磷酸二氫鉀(KH2PO4) 0.20g/l以1N NaOH溶液調整其pH值為7.5，121℃，15psi，消毒70min。
5.實驗結果示例本例為研究天然藥物五倍子對實驗生物膜的影響A實驗分組根據對恆流培養室中加樣的不同，分為以下各組陰性對照組25mM蔗糖溶液，加入恆流培養室中的終濃度為2.5mM。
空白對照組不含任何糖類的蒸餾水作為空白對照。
實驗組含4mg/ml的五倍子提取物的25mM蔗糖溶液，加入恆流培養後藥物終濃度為0.4mg/ml。
B恆流培養室液相各處理組pH的動態變化如圖3所示，在8次加藥的過程中，陽性對照組加入濃度為25mmol/L的蔗糖溶液後pH值出現了周期性波動，在3個小時左右達到最低點，最低pH下降至4.5以下，隨著時間的推移，pH逐漸上升，大約3個小時以後恢復到加糖前的水平。在實驗組，同樣反映出相似的pH變化規律。隨著五倍子的加入，pH出現緩慢下降，於3小時左右達到最低點，隨後緩慢上升，6小時後恢復到加藥前的水平，約pH7.0左右。整個連續培養過程中，蒸餾水組pH未見明顯波動，維持在pH7.5左右。
C恆流培養室中HAdic表面實驗生物膜活菌計數在生物膜培養周期內，不同藥物處理對不同時間，不同種類的生物膜細菌定植的影響不同。五倍子組表現出同蒸餾水組和蔗糖組相似的細菌定植穩定期(約72小時)，24小時生物膜細菌計數和120小時生物膜細菌計數有顯著性差異(P＜0.05)，對各實驗菌株而言，五倍子組表現出對乳酸桿菌明顯的抑制作用，整個培養周期其細菌計數均較低，對變形鏈球菌也有一定的抑制，對內氏放線菌、血液鏈球菌抑制不明顯。對120小時生物膜，五倍子組與蔗糖組相比，乳酸桿菌被明顯抑制(P＜0.05)，變形鏈球菌也在一定程度上被抑制，內氏放線菌、血液鏈球菌抑制不明顯。對生物膜細菌構成，雖然各實驗菌在生物膜黏附數量上有著一定的差異，但各組在細菌構成上未見有顯著變化(P＞0.05)。
D各處理組實驗生物膜形態的螢光顯微鏡觀察生物膜的FM觀察發現，隨著連續培養時間的增加，各組生物膜均表現出細菌及胞外多糖基質的增加，但各處理組表現為完全不同的生物膜形態外觀。同蔗糖組相比，即使在120小時生物膜，五倍子組也未見大量成團、成片的緻密細菌多糖基質團塊，生物膜呈現較為疏鬆的外觀。
權利要求
1.一種口腔生物膜動態模型裝置，含有鹼液罐(1)、培養基罐(2)、發酵罐(3)、恆流培養室(4)和加樣瓶(7)，其特徵在於恆流培養室(4)為多個豎式標準圓柱形培養室串聯連接，鹼液罐(1)通過蠕動泵P1與發酵罐(3)連接，培養基罐(2)通過蠕動泵P2與發酵罐(3)連接，發酵罐(3)通過過濾器F2和蠕動泵引入惰性氣體N2和CO2，發酵罐(3)通過蠕動泵P5和過濾器F1向外排出廢液、廢氣，發酵罐(3)通過蠕動泵P6和恆流培養室(4)連接，每個恆流培養室(4)通過蠕動泵P7和過濾器F3向外排出廢液、廢氣，培養基罐(2)和加樣瓶(7)分別通過蠕動泵P2、P3與多個恆流培養室(4)並聯連接。
2.如權力要求1所述口腔生物膜動態模型裝置，其特徵在於發酵罐(3)為夾層，夾層內設循環水浴進口和出口，罐內置pH控制電極，發酵罐(3)置於電磁攪拌器(8)上。
3.如權力要求1所述口腔生物膜動態模型裝置，其特徵在於恆流培養室(4)為豎式標準圓柱形，每個恆流培養室(4)的頂部設有多個加樣器(6)，根據實驗要求可在多個加樣器上放置多個固定標本，固定標本為羥基磷灰石，加樣器(6)垂直放置於恆流培養室(4)內部，恆流培養室(4)內設多通道pH記錄儀(10)電極，廢液排出口(12)、廢氣排出口(13)，恆流培養室(4)放置在恆溫培養箱內恆溫孵育，由電磁攪拌器(11)提供30rpm左右的攪拌速度以模擬口腔環境內唾液的動態流動環境。
4.如權力要求1～3之所述口腔生物膜動態模型裝置形成口腔生物膜的方法，其特徵在於該方法含有以下步驟1)動態模型裝置連接完成之後，將發酵罐(3)置於電磁攪拌器(8)上，獲得30～100rpm的轉速，溫度由循環水浴保持在37℃左右，鹼液罐(1)提供鹼液使發酵罐內的pH＝7.0左右，由pH控制器和蠕動泵P1調節，待各菌生長穩定後備用。2)培養基罐(2)內盛有人工唾液培養基BM-5，作為實驗菌的主要營養來源，由蠕動泵P2向發酵罐(3)和每個恆流培養室(4)內恆速加入。3)加樣瓶(7)內盛有藥物和蔗糖溶液，向每個恆流培養室(4)內實驗生物膜提供致齲的底物蔗糖以及所需研究的防齲藥物，根據研究目的的差別可採用不同的藥物和濃度。4)恆流培養室(4)置於密封的橫流培養箱內，由電磁攪拌器(11)提供30rpm左右的攪拌速度以模擬口腔環境內唾液流動的動態環境。5)根據實驗要求，在每個恆流培養室(4)內放置多個加樣器(6)，在實驗過程中，按照要求的時間間隔連續取出加樣器(6)，檢查加樣器(6)上羥磷灰石表面形成的生物膜的各項生物學指標，直到全部加樣器(6)取盡為止，從而實現了對實驗性生物膜形成過程的縱向連續實時監測。
全文摘要
一種口腔生物膜動態模型裝置，含有鹼液罐(1)、培養基罐(2)、發酵罐(3)、恆流培養室(4)和加樣瓶(7)。其特徵在於恆流培養室(4)為多個豎式標準圓柱形恆流培養室串聯連接，鹼液罐(1)通過蠕動泵P1與發酵罐(3)連接，培養基罐(2)通過蠕動泵P2與發酵罐(3)連接，發酵罐(3)通過過濾器F2和蠕動泵P4引入惰性氣體N
文檔編號C12Q1/18GK1858200SQ200610020608
公開日2006年11月8日 申請日期2006年3月30日 優先權日2006年3月30日
發明者周學東, 朱昞, 李繼遙, 郝玉慶, 趙今 申請人:四川大學