一種五味子體細胞胚及其培養方法、培養基及應用與流程
2023-05-23 05:03:56 1
本發明涉及五味子組織培養技術領域，具體而言，涉及一種五味子體細胞胚及其培養方法、培養基及應用。
背景技術：
五味子主產於吉林、遼寧、黑龍江、河北、山西、陝西、寧夏等北方各省的山區、半山區。五味子為常用中藥之一，始載於《神農本草經》，列為上品。五味子的有效成分是木質素成分,已從五味子科植物中分離出23個聯苯環辛二烯木質素類化合物,其中起主要作用的是五味子甲素、乙素、丙素、醇甲、醇乙、醋甲、醋乙、五味子酚，中醫認為它具有收斂固澀、益氣生津、被腎寧心的功能。近年醫藥學研究表明，五味子有抗疲勞、抗氧化、抗衰老、抗低溫等作用，對治療肝炎、急性腸道炎、神經衰弱、潛在克山病有一定療效。五味子(Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.)的次生代謝產物木質素是工業生產中的主要原料之一，其具有廣泛的應用價值。但現有的通過直接利用五味子果實直接提取木質素的技術容易受季節以及生長周期的限制，不利於木質素工業化生產，另外現有的通過組織培養方法培養得到的用作提取木質素原料的五味子愈傷組織中的木質素含量較低，不能起到促進利用五味子愈傷組織培養物為原料提取木質素的工業化生產規模的作用。
技術實現要素：
本發明的第一目的在於提供一種五味子體細胞胚的培養方法，此培養方法採用組織培養技術對五味子外植體培養得到含有木質素的體細胞胚，並且通過該培養方法得到體細胞胚含有的木質素量較高。
本發明的第二目的在於提供一種用於培養五味子體細胞胚的培養基，該培養基能夠誘導五味子胚性愈傷組織分化形成含有木質素的體細胞胚，且經該培養基培養得到體細胞胚中的木質素含量較高。
本發明的第三目的在於提供一種五味子體細胞胚，其由上述培養方法培養得到，其木質素含量較高，可用作提取木質素工業化生產中的原料。
本發明的第四目的在於提供五味子體細胞胚在製備木質素中的應用，以具有較高木質素含量的五味子體細胞胚用作提取木質素的原料，有利於實現木質素的大規模生產。
本發明解決其技術問題是採用以下技術方案來實現的。
一種五味子體細胞胚的培養方法，其包括：
取五味子外植體進行誘導培養，得到五味子胚性愈傷組織；
將所述五味子胚性愈傷組織接種至體細胞胚誘導培養基中，進行體細胞胚誘導培養，得到含木質素的體細胞胚；
其中，體細胞胚誘導培養基由每升1/2MS培養基中添加0.45-0.52mg BA、28-32g碳源以及0.4-0.6g氮源製成，體細胞胚誘導培養基pH為5.6-6.0，碳源是選自葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖以及山梨醇中的任意一種，氮源是選自椰汁、酵母提取物、水解酪蛋白以及水解乳蛋白中的任意一種。
一種用於培養五味子體細胞胚的培養基，其是由每升MS培養基中添加0.45-0.52mg BA、28-32g碳源以及0.4-0.6g氮源製成的體細胞胚誘導培養基，體細胞胚誘導培養基pH為5.6-6.0，碳源是選自葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖以及山梨醇中的任意一種，氮源是選自椰汁、酵母提取物、水解酪蛋白以及水解乳蛋白中的任意一種。
一種五味子體細胞胚，其上述五味子體細胞胚的培養方法培養所得到。
上述五味子體細胞胚在製備木質素中的應用。
本發明提供的一種五味子體細胞胚及其培養方法、培養基及應用有益效果是：本發明的五味子體細胞胚的培養方法通過對體細胞胚誘導培養基的體系優化，調整體細胞胚誘導培養基中的BA濃度為0.45-0.52mg/L、碳源的濃度為28-32g/L、氮源的濃度為0.4-0.6g/L等影響因素以使五味子胚性愈傷組織在分化成體細胞胚的過程中產生最大量的木質素，並選用葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖以及山梨醇中的任意一種作為碳源和選用椰汁、酵母提取物、水解酪蛋白以及水解乳蛋白中的任意一種作為氮源，進一步為體細胞胚的生長以及木質素合成的提供最佳碳源和氮源，以使得到的體細胞胚中的木質素含量最大化，進而為五味子細胞培養生產次生代謝產物木質素的工廠化生產和產業化開發提供材料和依據。
具體實施方式
為使本發明實施例的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述。實施例中未註明具體條件者，按照常規條件或製造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。
下面對本發明實施例的一種五味子體細胞胚及其培養方法、培養基及應用進行具體說明。
一種五味子體細胞胚的培養方法，其包括以下步驟。
S1獲取五味子胚性愈傷組織
取五味子外植體進行前誘導培養，以得到五味子胚性愈傷組織。
具體包括：
(1)將五味子外植體於預培養基上進行預培養，得到五味子愈傷組織。
其中，預培養基由每升MS培養基中添加2.8-3.2mg 2,4-D、0.18-0.22mg TDZ、28-32g蔗糖、6.8-7.2g瓊脂製成，預培養基的pH值為5.6-6.0。
優選地，預培養的條件是在溫度為23-27℃條件下，黑暗培養28-30d。
優選地，五味子外植體為0.4-0.5cm長的五味子莖段。需要說明的是，五味子外植體還可以是五味子的根、葉等器官組織，並不限於五味子的莖。
(2)將五味子愈傷組織於胚性誘導培養基上進行胚性誘導培養，得到五味子胚性愈傷組織。
其中，胚性誘導培養基由每升MS培養基中添加0.8-1.2mg TDZ、0.018-0.22mg ZT、28-32g蔗糖、6.8-7.2g瓊脂製成，胚性誘導培養基的pH為5.6-6.0。
優選地，胚性誘導培養的條件是：溫度為23-27℃、光周期為15-17h、培養時間為28-30d。
S2獲取體細胞胚
(1)將五味子胚性愈傷組織接種至體細胞胚誘導培養基中，進行體細胞胚誘導培養，得到含木質素的體細胞胚。
其中，體細胞胚誘導培養基由每升1/2MS培養基中添加0.45-0.52mg BA、28-32g碳源以及0.4-0.6g氮源製成，體細胞胚誘導培養基的pH為5.6-6.0。其中，碳源是選自葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖以及山梨醇中的任意一種，氮源是選自椰汁、酵母提取物、水解酪蛋白以及水解乳蛋白以及中的任意一種。
優選地，進行體細胞胚誘導培養的條件是：溫度為23-27℃、通氣量為0.15-0.25vvm的條件下暗培養28-30d。
優選地，按質量體積比為10-15：1的比例(指每升體細胞胚誘導培養基中接種10-15g五味子胚性愈傷組織)將五味子胚性愈傷組織接種至體細胞胚誘導培養基中。
一種五味子體細胞胚，其由上述的五味子體細胞胚的培養方法培養所得到，該五味子體細胞胚具有較高含量的木質素。
上述五味子體細胞胚在在製備木質素中的應用，五味子體細胞胚具有較高含量的木質素，可用作提取木質素的原料。
由此，本發明所提供的五味子體細胞胚的培養方法，以五味子莖段為外植體，誘導出愈傷組織，以及進一步誘導產生胚性愈傷組織和體細胞胚，通過對不同接種量，以及體細胞胚誘導培養基的碳源、通氣量和氮源的選擇和控制，以使體細胞胚生長以及木質素合成的達到最佳狀態，其對提高五味子組織培養物中的有效成分產率，篩選高產的細胞組織，實現木質素的大規模生產具有重要意義，同時為五味子細胞培養生產次生代謝產物木質素的工廠化生產和產業化開發提供材料和依據。
需要說明的是，本發明中的2,4-D是2，4－二氯苯氧乙酸；BA是6-苄氨基腺嘌呤；TDZ是噻苯隆；ZT是玉米素。
以下結合實施例對本發明的特徵和性能作進一步的詳細描述。
實施例1
本實施例以五味子嫣紅品種的嫩莖段作為五味子外植體，五味子嫩莖段取自中國農業科學院特產研究所的國家果樹種質資源圃。
本實施例的五味子體細胞胚的培養方法包括如下步驟：
(1)將取好的五味子嫩莖段用自來水衝洗4h，然後在超淨工作檯上用70％的酒精消毒30s，倒出酒精，用0.1％升汞消毒5min，再用無菌水衝洗3-4次。
(2)將五味子嫩莖段放入培養皿中，用鑷子及刀片在無菌條件下切成約0.5cm長的五味子莖段。
(3)將切好的五味子莖段接種至含有預培養基的三角瓶(容量為100ml，含30ml預培養基)中進行預培養，每個三角瓶中接種3個外植體，在溫度為25℃的預培養條件下，暗培養28天，以誘導形成愈傷組織。
其中，預培養基按如下方法製得：以MS培養基為基礎培養基，按每升MS培養基中添加3.0mg 2,4-D、0.2mg TDZ、30g蔗糖、7g瓊脂，pH調節為5.8，經高壓滅菌(指在溫度為121℃，壓力為1.2kg/cm的條件下滅菌20min，以下述及高壓滅菌的，其滅菌條件同此)，冷凝後製得。
(4)預培養結束後，將形成的愈傷組織切成約為0.3cm×0.3cm的小塊，然後轉移至胚性誘導培養基中進行胚性誘導培養，在溫度為25℃，光周期16h(光照強度為30μmol·m–2·s–1)的胚性誘導培養條件下，培養28天，以誘導愈傷組織進一步形成胚性愈傷組織。
其中，胚性誘導培養基是以每升MS培養基中添加1mg TDZ、0.2mg ZT、30g蔗糖、7g瓊脂，pH調節為5.8，經高壓滅菌，冷凝後製得。
(5)胚性誘導培養結束後，按每升體細胞胚誘導培養基接種20g胚性愈傷組織的比例，將胚性愈傷組織接種至含有體細胞胚誘導培養基的生物反應器(哈爾濱道外化玻站，氣升式生物反應器，含2L體細胞胚誘導培養基)中，於溫度為25℃，通氣量為0.2vvm的體細胞胚誘導培養條件下，暗培養30天，以誘導形成含木質素的體細胞胚。
其中，體細胞胚誘導培養基由每升1/2MS培養基中添加0.5mgBA、30g蔗糖以及0.5g水解酪蛋白，pH調節為5.8後，經高壓滅菌，冷凝後製得。
實施例2
本實施例的五味子體細胞胚的培養方法包括如下步驟：
(1)將取好的五味子嫩莖段用自來水衝洗4h，然後在超淨工作檯上用70％的酒精消毒30s，倒出酒精，用0.1％升汞消毒5min，再用無菌水衝洗3-4次。
(2)將五味子嫩莖段放入培養皿中，用鑷子及刀片在無菌條件下切成約0.4cm長的五味子莖段即外植體。
(3)將切好的五味子莖段接種至含有預培養基的三角瓶中進行預培養，每個三角瓶中接種3個外植體，在溫度為27℃下的預培養條件下，暗培養28天，以誘導形成愈傷組織。
其中，所用預培養基按如下方法製得：以MS培養基為基礎培養基，按每升MS培養基中添加3.2mg 2,4-D、0.18mg TDZ、32g蔗糖、6.8g瓊脂，pH調節為5.8，然後在溫度為121℃，壓力為1.2kg/cm的條件下高壓滅菌20min，冷凝後製得。
(4)預培養結束後，將形成的愈傷組織切成約為0.3cm×0.3cm的小塊，然後轉移至胚性誘導培養基中進行胚性誘導培養，在溫度為25℃，光周期15h(光照強度為30μmol·m–2·s–1)的胚性誘導培養條件下，培養28天，以誘導愈傷組織進一步形成胚性愈傷組織。
其中，胚性誘導培養基是以每升MS培養基中添加1.2mg TDZ、0.22mg ZT、28g蔗糖、7.2g瓊脂，pH調節為5.8，經高壓滅菌，冷凝後製得。
(5)胚性誘導培養結束後，按每升體細胞胚誘導培養基接種20g胚性愈傷組織的比例，將胚性愈傷組織接種至含有體細胞胚誘導培養基的生物反應器中，於溫度為23℃，通氣量為0.25vvm的體細胞胚誘導培養條件下，暗培養30天，以誘導形成含木質素的體細胞胚。
其中，體細胞胚誘導培養基由每升1/2MS培養基中添加0.52mgBA、30g山梨醇以及0.6g水解乳蛋白，pH調節為5.8後，經高壓滅菌，冷凝後製得。
實施例3
本實施例的五味子體細胞胚的培養方法包括如下步驟：
(1)將取好的五味子嫩莖段用自來水衝洗4h，然後在超淨工作檯上用70％的酒精消毒30s，倒出酒精，用0.1％升汞消毒5min，再用無菌水衝洗3-4次。
(2)將五味子嫩莖段放入培養皿中，用鑷子及刀片在無菌條件下切成約0.5cm長的五味子莖段即外植體。
(3)將切好的五味子莖段接種至含有預培養基的三角瓶中進行預培養，每個三角瓶中接種3個外植體，在溫度為27℃下的預培養條件下，暗培養28天，以誘導形成愈傷組織。
其中，所用預培養基按如下方法製得：以MS培養基為基礎培養基，按每升MS培養基中添加2.8mg 2,4-D、0.22mg TDZ、28g蔗糖、7.2g瓊脂，pH調節為5.8，然後在溫度為121℃，壓力為1.2kg/cm的條件下高壓滅菌20min，冷凝後製得。
(4)預培養結束後，將形成的愈傷組織切成約為0.3cm×0.3cm的小塊，然後轉移至胚性誘導培養基中進行胚性誘導培養，在溫度為25℃，光周期16h(光照強度為30μmol·m–2·s–1)的胚性誘導培養條件下，培養28天，以誘導愈傷組織進一步形成胚性愈傷組織。
其中，胚性誘導培養基是以每升MS培養基中添加0.5mg BA、0.1mg NAA、30g蔗糖以及7g瓊脂，pH調節為5.8，經高壓滅菌，冷凝後製得。
(5)胚性誘導培養結束後，按每升體細胞胚誘導培養基接種30g胚性愈傷組織的比例，將胚性愈傷組織接種至含有體細胞胚誘導培養基的生物反應器中，於溫度為27℃，通氣量為0.15vvm的體細胞胚誘導培養條件下，暗培養28天，以誘導形成含木質素的體細胞胚。
其中，體細胞胚誘導培養基由每升MS培養基中添加0.45mg BA、30g蔗糖以及0.4g椰汁，pH調節為5.8後，經高壓滅菌，冷凝後製得。
實施例4
本實施例的五味子體細胞胚的培養方法包括如下步驟：
(1)將取好的五味子嫩莖段用自來水衝洗4h，然後在超淨工作檯上用70％的酒精消毒30s，倒出酒精，用0.1％升汞消毒5min，再用無菌水衝洗3-4次。
(2)將五味子嫩莖段放入培養皿中，用鑷子及刀片在無菌條件下切成約0.5cm長的五味子莖段即外植體。
(3)將切好的五味子莖段接種至含有預培養基的三角瓶中進行預培養，每個三角瓶中接種3個外植體，在溫度為27℃下的預培養條件下，暗培養28天，以誘導形成愈傷組織。
其中，所用預培養基按如下方法製得：以MS培養基為基礎培養基，按每升MS培養基中添加3.0mg 2,4-D、0.2mg TDZ、30g蔗糖、7g瓊脂，pH調節為5.8，然後在溫度為121℃，壓力為1.2kg/cm的條件下高壓滅菌20min，冷凝後製得。
(4)預培養結束後，將形成的愈傷組織切成約為0.3cm×0.3cm的小塊，然後轉移至胚性誘導培養基中進行胚性誘導培養，在溫度為25℃，光周期17h(光照強度為30μmol·m–2·s–1)的胚性誘導培養條件下，培養28天，以誘導愈傷組織進一步形成胚性愈傷組織。
其中，胚性誘導培養基是以每升MS培養基中添加1mg TDZ、0.2mg ZT、30g蔗糖、7g瓊脂，pH調節為5.6，經高壓滅菌，冷凝後製得。
(5)胚性誘導培養結束後，按每升體細胞胚誘導培養基接種15g胚性愈傷組織的比例，將胚性愈傷組織接種至含有體細胞胚誘導培養基的生物反應器中，於溫度為25℃，通氣量為0.2vvm的體細胞胚誘導培養條件下，暗培養30天，以誘導形成含木質素的體細胞胚。
其中，體細胞胚誘導培養基由每升MS培養基中添加0.45mg BA、32g乳糖以及0.6g酵母提取物，pH調節為5.8後，經高壓滅菌，冷凝後製得。
實施例5
本實施例的五味子體細胞胚的培養方法包括如下步驟：
(1)將取好的五味子嫩莖段用自來水衝洗4h，然後在超淨工作檯上用70％的酒精消毒30s，倒出酒精，用0.1％升汞消毒5min，再用無菌水衝洗3-4次。
(2)將五味子嫩莖段放入培養皿中，用鑷子及刀片在無菌條件下切成約0.4cm長的五味子莖段即外植體。
(3)將切好的五味子莖段接種至含有預培養基的三角瓶中進行預培養，每個三角瓶中接種3個外植體，在溫度為27℃下的預培養條件下，暗培養28天，以誘導形成愈傷組織。
其中，所用預培養基按如下方法製得：以MS培養基為基礎培養基，按每升MS培養基中添加3.0mg 2,4-D、0.2mg TDZ、30g蔗糖、7g瓊脂，pH調節為5.8，然後在溫度為121℃，壓力為1.2kg/cm的條件下高壓滅菌20min，冷凝後製得。
(4)預培養結束後，將形成的愈傷組織切成約為0.3cm×0.3cm的小塊，然後轉移至胚性誘導培養基中進行胚性誘導培養，在溫度為25℃，光周期16h(光照強度為30μmol·m–2·s–1)的胚性誘導培養條件下，培養28天，以誘導愈傷組織進一步形成胚性愈傷組織。
其中，胚性誘導培養基是以每升MS培養基中添加1mg TDZ、0.2mg ZT、30g蔗糖、7g瓊脂、30g蔗糖以及7g瓊脂，pH調節為5.8，經高壓滅菌，冷凝後製得。
(5)胚性誘導培養結束後，按每升體細胞胚誘導培養基接種30g胚性愈傷組織的比例，將胚性愈傷組織接種至含有體細胞胚誘導培養基的生物反應器中，於溫度為25℃，通氣量為0.2vvm的體細胞胚誘導培養條件下，暗培養30天，以誘導形成含木質素的體細胞胚。
其中，體細胞胚誘導培養基由每升MS培養基中添加0.5mg BA、30g蔗糖以及0.5g椰汁，pH調節為6.0後，經高壓滅菌，冷凝後製得。
對比例1
本對比例的五味子體細胞胚的培養方法包括如下步驟：
(1)將取好的五味子嫩莖段用自來水衝洗4h，然後在超淨工作檯上用70％的酒精消毒30s，倒出酒精，用0.1％升汞消毒5min，再用無菌水衝洗3-4次。
(2)將五味子嫩莖段放入培養皿中，用鑷子及刀片在無菌條件下切成約0.5cm長的五味子莖段即外植體。
(3)將切好的五味子莖段接種至含有預培養基的三角瓶(容量為100ml，含30ml預培養基)中進行預培養，誘導形成愈傷組織，每個三角瓶中接種3個外植體，在溫度為25℃下的預培養條件下，暗培養28天。
其中，所用預培養基按如下方法製得：以MS培養基為基礎培養基，按每升MS培養基中添加3.0mg 2,4-D、0.2mg TDZ、30g蔗糖、7g瓊脂，pH調節為5.8，然後在溫度為121℃，壓力為1.2kg/cm的條件下高壓滅菌20min，冷凝後製得。
(4)預培養結束後，將形成的愈傷組織切成約為0.3cm×0.3cm的小塊，然後轉移至胚性誘導培養基中進行胚性誘導培養，以誘導愈傷組織被進一步誘導形成胚性愈傷組織，在溫度為25℃，光周期16h(光照強度為30μmol·m–2·s–1)的胚性誘導培養條件下，培養28天。
其中，胚性誘導培養基是以每升MS培養基中添加1mg TDZ、0.2mg ZT、30g蔗糖、7g瓊脂，pH調節為5.8，經高壓滅菌，冷凝後製得。
(5)胚性誘導培養結束後，按每升體細胞胚誘導培養基接種35g胚性愈傷組織的比例，將胚性愈傷組織接種至含有體細胞胚誘導培養基的生物反應器中，於溫度為25℃，通氣量為0.2vvm的體細胞胚誘導培養條件下，暗培養30天，以誘導形成含木質素的體細胞胚。
其中，體細胞胚誘導培養基由每升MS培養基中添加0.5mg BA、pH調節為5.8後，經高壓滅菌，冷凝後製得，該體細胞胚誘導培養基未加入本發明所要求保護的碳源和氮源。
對比例2
本對比例的五味子體細胞胚的培養方法的步驟與對比例1相同，不同之處在於：在本對比例的步驟(5)中，按每升體細胞胚誘導培養基接種35g胚性愈傷組織的比例，將胚性愈傷組織接種至含有體細胞胚誘導培養基的生物反應器中；所用的體細胞胚誘導培養基由每升MS培養基中添加0.5mg BA、35g蔗糖以及0.3g椰汁，pH調節為5.8後，經高壓滅菌，冷凝後製得。
實驗例
製作標準曲線:
(1)稱取標準品五味子醇甲1mg，置於5ml容量瓶中，用甲醇溶解定溶，混勻製成200μg/ml標準儲備液備用。分別吸取標準儲備1.0ml稀釋成100μg/ml、50μg/ml、20μg/ml、10μg/ml五味子醇甲標準對照液。按上述方法，分別製備五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素標準對照液。
(2)進樣(美國Aglient1200系列高效液相色譜儀)，進樣量為20μl，梯度洗脫：A相(超純水)、B相(甲醇)；梯度洗脫條件為：0-15min內B相從30％線形降至57％，15-38min線形增至80％，35-40min降到57％，40-45min降到30％，與檢測器檢測波長為254nm下檢測五味子醇甲標準對照液的吸光值，以五味子醇甲標準對照液的濃度為橫坐標、吸光值為縱坐標繪製出五味子醇甲的標準曲線：y＝1421.1x-40.917，R2＝0.9997。
按上述方法，製得五味子醇乙的標準曲線：y＝1327.7x-26.492，R2＝0.9997；製得五味子酯甲的標準曲線：y＝952.77x-30.041，R2＝0.9999，製得五味子甲素的標準曲線：y＝1602.5x-32.046，R2＝0.9999，製得五味子乙素的標準曲線：y＝1440.3x-65.537，R2＝0.9994，製得五味子丙素的標準曲線：y＝1216.1x-27.549，R2＝0.9999。
取上述實施例1-5、對比例1-2得到的體細胞胚，檢測其中的木質素含量，檢測方法如下：分別取1g體細胞胚鮮樣加甲醇研磨，定容至5ml，進樣(美國Aglient1200系列高效液相色譜儀)，梯度洗脫：A相(超純水)、B相(甲醇)；梯度洗脫條件為：0-15min內B相從30％線形降至57％，15-38min線形增至80％，35-40min降到57％，40-45min降到30％，檢測器檢測波長為254nm，進樣量為20μl。根據測得的吸光值代入相應的標準曲線，可分別測得樣品中的五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素的濃度c，代入計算公式Y＝(c×5)/1×100％，可得到每g體細胞胚中的五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素含量，另外，木質素總含量＝五味子醇甲+五味子醇乙+五味子酯甲+五味子甲素+五味子乙素+五味子丙素。重複3次，結果以平均值表示，檢測結果見表1。
表1.由實施例1-5以及對比例1-2得到的體細胞胚中的木質素含量
註：表中小寫字母表示差異顯著，p<0.05，單位為％。
由表1可以得知，本發明實施例1-5的五味子體細胞胚的培養方法所得到體細胞胚中的木質素含量明顯地高於對比例1-2，由於對比例1中的體細胞胚誘導培養基沒有加入本發明所要求保護的碳源(葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖以及山梨醇中的任意一種)和氮源(椰汁、酵母提取物、水解酪蛋白以及水解乳蛋白中的任意一種)，所以導致對比例1得到的體細胞胚中的木質素含量低於實施例1-5，另外，雖然對比例2所用的體細胞胚誘導培養基加入有本發明所要求保護的碳源(35g蔗糖)和氮源(0.3g椰汁)，但其所用碳源和氮源的加入量並不在本發明所要求的碳源(28-32g)和氮源(0.4-06g)保護範圍內，導致對比例2得到的體細胞胚中的木質素含量仍然低於實施例1-5。由此表明，採用本發明提供的五味子體細胞胚的培養方法，特別是含碳源(葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖以及山梨醇中的任意一種)和氮源(椰汁、酵母提取物、水解酪蛋白、水解乳蛋白以及脯氨酸中的任意一種)的體細胞胚誘導培養基的使用能夠明顯地促進木質素在體細胞胚中的合成，提高其含量。
另外，再按上述檢測方法檢測實施例1中各階段的組織培養物即得到愈傷組織和胚性愈傷組織中的木質素總含量，結果見表2。
表2.實施例1中各階段的組織培養物的木質素總含量
註：表中小寫字母表示差異顯著，p<0.05，單位為％，「-」代表未檢出。
由表2可知，經過體細胞胚誘導培養後的得到體細胞胚中的木質素總含量明顯高於愈傷組織和胚性愈傷組織中，進一步表明採用本發明提供的五味子體細胞胚的培養方法，特別是體細胞胚誘導培養基的使用能夠明顯地促進木質素在體細胞胚中的合成，提高其含量。
綜上，本發明所提供的五味子體細胞胚的培養方法，以五味子莖段為外植體，誘導出愈傷組織，以及進一步誘導產生胚性愈傷組織和體細胞胚，通過對不同接種量，以及體細胞誘導培養基的碳源、通氣量和氮源的選擇和控制，以使體細胞胚生長以及木質素合成的達到最佳狀態，其對提高五味子組織培養物中的有效成分產率，篩選高產的細胞組織，實現木質素的大規模生產具有重要意義，同時為五味子細胞培養生產次生代謝產物木質素的工廠化生產和產業化開發提供材料和依據。
以上所述僅為本發明的優選實施例而已，並不用於限制本發明，對於本領域的技術人員來說，本發明可以有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。