一種適冷木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶、其製備方法及應用的製作方法

2023-05-23 03:09:11

專利名稱：一種適冷木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶、其製備方法及應用的製作方法
技術領域：
本發明屬生物工程領域，涉及一種適冷木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶雙功能纖維素降 解酶及其製備方法和應用。本發明還涉及該木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶的重組表達質粒和重 組基因工程菌株。
背景技術：
木質纖維素是自然界中豐富的可再生能源，由四種主要成份纖維素( 33-51% )，半纖維素( 19-34% )，果膠( 2-20%)以及木質素( 20-30%)。木質 纖維素降解產生可發酵的己糖(hexose)(葡萄糖，36 50%;甘露糖，0. 3 12%;半乳糖， 0.1 2. 4%)和戊糖(pentose)(木糖，3. 4 23%;阿拉伯糖，1.1 4.5%)。半纖維素 的骨架結構是由β _1，4木聚糖，而木聚糖的降解酶主要由內切β-1，4-木聚糖酶(endo-1， 4-β -D-xylanase,EC3. 2. 1. 8)和 β _1，4_ 木糖苷酶(β -1，4-xylosidase，EC3. 2. 1. 37)完 成，。人們對木聚糖酶進行了系統的研究，但木糖苷酶卻未得到足夠重視。木糖苷 酶是一種外切酶，以外切方式從非還原性末端水解木二糖及木二糖以上的低聚木糖，水解 產物為木糖。木糖苷酶在自然界中分布非常廣泛，現已從細菌、放線菌和真菌(包括酵 母)等微生物和高等植物中分離得到。木糖苷酶是木聚糖降解的關鍵酶之一，有著重 要的工業應用價值。在能源工業中，工農業廢棄物中的木聚糖可被木聚糖酶系轉化為木糖， 而木糖又可被細菌及真菌轉化成酒精等有價值的燃料；在醫藥行業中，木聚糖酶系水解特 定底物可產生在醫藥行業具有重要應用價值的中間轉化產物。例如，1998年Patel等人利 用Moraxella. sp β -木糖苷酶水解10-去乙醯巴卡亭III木糖苷和10-去乙醯紫杉醇木 糖苷7位木糖殘基，得到重要的中間產物10-去乙醯巴卡亭III和10-去乙醯紫杉醇，為紫 杉醇的合成開闢了一條嶄新的途徑(Annu Rev Microbiol 52:95-361,1998)。L-阿拉伯糖屬於五碳醛糖，以阿拉伯聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、阿拉伯糖基半乳糖 體及類似於高等植物半纖維的形式存在。L-阿拉伯糖是一種沒有熱量的甜料，能抑制水解 雙糖的酶，抑制因攝入蔗糖而導致的血糖升高，因此可以抑制肥胖、預防並治療與高血糖相 關的疾病，已被美國食品藥品監督局和日本厚生省批准列入健康食品添加劑。L-阿拉伯糖 還可以用作醫藥中間體、用於生化領域中細菌培養基的製備以及香料合成等(化學與生物 工程23 :50-52，2006)。此外，L-阿拉伯糖可用於合成核苷類似物等抗病毒藥物，治療白血 病、癌症的化療藥物等，據了解目前全球共有5種進入三期臨床試驗的抗B肝新藥，其中兩 種採用 L-阿拉伯糖為原料(Antivir Ther. 3 113-121，1998 ；Tetrahedron 65 1937-1949， 2009)。L-阿拉伯糖的工業提取方法一般是採用鹼提取植物中的半纖維素，然後酸水解工藝 成本高，環境汙染嚴重。因此，高效、節能、環保的生物轉化方法生產L-阿拉伯糖成對我國 的生物能源產業和功能糖產業都有非常重大的意義。隨著國外對木糖苷酶的研究已日 趨深入，發現一些β-木糖苷酶活還具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性，即雙重活性。而國內相關 研究仍然報導甚少，僅薛業敏等從嗜熱厭氧菌jThermoanaercAacter ethanolicus中克隆到 具有這一性質的酶Xar (食品與發酵工業四:22-26, 2003)。

發明內容
本發明的目的是提供一種新型的具有木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶雙功能的糖苷水解酶。本發明的另一目的是提供該木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶雙功能酶的製備方法。本發明的再一目的是提供該木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶雙功能酶的應用。本發明提供了一種木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶雙功能酶，其胺基酸序列如SEQID NO. 2所示。它的核苷酸編碼序列如SEQ ID NO. 1所示。本發明還提供了含有所述的木糖 苷酶/阿拉伯糖苷酶雙功能酶的核苷酸編碼序列的重組載體，該重組載體包括擴增載體和 表達載體等。表達載體可以是例如大腸桿菌表達載體、釀酒酵母表達載體、畢赤酵母表達載 體、枯草芽孢桿菌表達載體、乳酸菌表達載體、絲狀真菌表達載體、昆蟲表達載體或者哺乳 動物細胞表達載體等常規表達載體。本發明還提供了含有上述的重組載體的重組菌株，該 菌株的宿主細胞可以是大腸桿菌、釀酒酵母、畢赤酵母、枯草芽孢桿菌、乳酸菌、絲狀真菌、 昆蟲或者哺乳動物細胞中等。本發明的新型木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶雙功能的糖苷水解酶，來源於中國犛牛 瘤胃微生物，具有如SEQ ID NO. 2所示的成熟胺基酸序列。該酶屬於糖基水解酶43家族 (Glycoside hydrolase family 43，GH43)，具有木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶雙重功能，並且 在低溫條件下保持高催化活性。本發明中，木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶雙功能酶是指同時具備木糖苷酶和阿拉伯糖 苷酶活性的、胺基酸序列如SEQ ID N0. 2所示的多肽，簡稱為RuXynl。該術語還包括同時具 備木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶活性的、SEQ ID N0. 2序列的變異形式。這些變異形式包括(但 並不限於)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨 基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個 以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或 相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添 加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括與SEQ ID N0. 2的氨基 酸序列的同源性達到80%及以上的序列。本發明的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶雙功能酶，它的核苷酸編碼序列可以如SEQ ID NO. 1所示。本發明的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶雙功能酶的核苷酸編碼序列只是編碼具備木 糖苷酶/阿拉伯糖苷酶活性的多肽的核苷酸序列，例如SEQ ID NO. 1的核苷酸序列及其簡 並序列。該簡併序列是指，SEQ ID NO. 1序列中，有一個或多個密碼子被編碼相同胺基酸的 簡併密碼子所取代後而產生的序列。由於密碼子的簡併性，所以與SEQ ID NO. 1同源性低 至約70%的簡併序列也能編碼出SEQ ID N0. 2所述的序列。該術語還包括與SEQ ID NO. 1 的核苷酸序列的同源性至少70 %，較佳地至少80 %，更佳地至少90 %的核苷酸序列。本發明提供了核酸構建體，其包含與一個或多個可操作調控序列連接的木糖苷酶 /阿拉伯糖苷酶雙功能酶的特徵的核酸序列，所述調控序列能指導木糖苷酶/阿拉伯糖苷 酶在合適表達宿主中表達。本發明的核酸構建體優先地包含大腸桿菌重組載體，也包括，如 釀酒酵母表達載體，畢赤酵母表達載體，枯草芽孢桿菌表達載體，乳酸菌表達載體、絲狀真4菌表達載體、昆蟲表達載體、哺乳動物細胞表達載體。本發明提供了重組宿主細胞，其包含木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶雙功能酶的特徵核 酸序列核酸構建體，本發明的宿主細胞可為單細胞微生物，例如原核生物，或非單細胞微生 物，例如真核生物。在優選的實施方式中，細菌宿主細胞為細菌細胞，例如革蘭氏陽性細菌， 包括但不限於芽孢桿菌屬細胞或者鏈黴菌屬細胞；或者革蘭氏陽性細菌，例如大腸桿菌屬 和假單胞菌屬菌種。本發明宿主細胞可為真核生物，例如哺乳動物、昆蟲、植物或真菌細胞。在 優選的實施方式中，宿主細胞為真菌細胞，如子囊菌門(Ascomycota)，擔子菌門 (Basidiomycota),壺菌門(Chytridiomycota)禾口結合菌門(Zygomycota),以及卵菌門 (Oomycota)和所有有絲分裂孢子真菌。在更優選的實施方案中，所述真菌宿主細胞是酵母 細胞，包括產子囊酵母(Ascosporogenours)、產擔子酵母(Basidiosporogenous)和半知菌 類(Fungi Imperfecti)酵母。上述重組載體和基因工程菌株可以採用本領域常規的技術手段和操作方法製備。另一方面，本發明提供了所述的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶雙功能酶的製備方法， 包括培養重組菌株和分離目標蛋白，依次包括以下步驟(1)利用引物進行聚合酶反應擴增，獲得權利要求1所述的木糖苷酶/阿拉伯糖苷 酶雙功能酶的核苷酸編碼序列，構建木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶雙功能酶重組表達載體；(2)將重組表達載體導入表達宿主細胞，在重組菌體表達木糖苷酶/阿拉伯糖苷 酶雙功能酶；(3)分離回收木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶雙功能酶。上述重組載體和基因工程菌株可以採用本領域常規的技術手段和操作方法製備。 本發明的製備本發明木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶的方法，還可以包括中國犛牛瘤胃微生物宏 基因組文庫構建及篩選。中國犛牛瘤胃微生物宏基因組文庫構建及篩選的具體方法是取青海犛牛的瘤 胃內容物，構建瘤胃未培養細菌宏基因組文庫；篩選具有木糖苷酶活性的陽性克隆。 β-木苷酶的文庫篩選採用螢光底物4-甲基傘形酮β- -1，4-木糖苷作為底物。將96孔 板微量培養的細胞凍融破碎後加入10μ 1的lmg/ml 4-甲基傘形酮β _D_1，4_木糖苷的底 物(50mM citrate-phosphate pH4. 8)，37°C反應 30 分鐘後加入 30 μ 1 IM Na2CO3,紫外下呈 現螢光即為具有木糖苷酶活性的陽性克隆。本發明的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶雙功能酶也可以按照SEQ ID NO. 2所示序列人工合成。本發明提供了所述的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶雙功能酶在降解纖維素反應中的 應用，例如在飼料組合物的製備、半纖維素或阿拉伯木聚糖的糖化或乙醇生產方面的用途。本發明的新型木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶雙功能的糖苷水解酶，具有木糖苷酶和阿 拉伯糖苷酶雙重功能，並且在低溫條件下保持高催化活性。木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶的性質可用本領域已知的方法進行檢測，本發明的實施 例中，木糖苷酶底物為對硝基酚- β -D木糖苷(para-nitrophenyl-β -D-xylopyranoside， pNPX)，阿拉伯糖苷酶底物為對硝基酚-β -D阿拉伯呋喃糖苷(para-nitrophenyl- α -L-ar abinofuranoside, pNPA)。
本發明提供的纖維素降解酶的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶，同時具有較高的 β -D-木糖苷酶和-α -L-阿拉伯糖苷酶活性。實施實驗中顯示木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶不 僅能顯著提高木寡糖的產量，而且能將寡聚木聚糖降解成木糖。本發明提供的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶與已報報導的木糖苷酶相比，適冷性強， 反應溫度範圍4°C _55°C，最佳的為40°C，隨著溫度的升高，酶的催化常數kcat逐漸升高，催 化常數是指酶在底物飽和時，每秒鐘每個酶分子轉換底物的分子數。反應PH範圍4. 0-8.0， 最佳的為7.0。本發明的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶降解半纖維素，條件溫和，抑制物少，可應用於 各種工業，例如用於生物質轉化，如用於由包含生物質的纖維素生產燃料乙醇的過程中，用 於澱粉糖化過程，用於飼料組合物中，提高動物對粗纖維的利用率，或用於麵包製造麵團 中。本發明提供的新型木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶蛋白，不僅有水解α -1,4-L-阿拉伯 糖苷鍵和β-1，4- -木糖苷鍵的功能，而且能夠在低溫的環境下保持較高的活性。本發明 提供的新型木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶雙功能蛋白可用於纖維素生物轉化、化工、紡織、食 品、生物能源、飼料添加、醫藥工業方面等應用領域。本發明還提供了一種含有木聚糖酶和所述的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶雙功能酶 的組合物。本發明的的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶雙功能酶與木聚糖酶組合，能夠更好的降解 木聚糖。組合酶能將木聚糖完全降解為單糖木糖，而沒有加入RuXynl的反應液中，木聚糖 酶的主要產物是木二糖，並且沒有木糖產生。因此，將木聚糖酶和RuXynl的混合酶降解木 聚糖，降解更徹底，能夠更高效的利用降解產物。本發明提供的一種新型適冷的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶雙功能酶。該酶具有木糖 苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶的活性，可用於纖維素生物轉化、化工、紡織、食品、生物能源、飼 料添加、醫藥工業等應用領域。並且，該酶具有低溫酶的性質。低溫纖維素酶最適作用溫度 可低至20°C。由於反應溫度較低，不但在低溫條件下可以高效反應，而且在生產工藝中可以 通過較低溫度的熱處理使酶失活，節約能量與費用，成為人們研究開發的熱點。因此，本發 明的新型適冷的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶雙功能酶在生物能源，醫藥等領域具有著重要的 應用價值。


圖1 Ruxynl大腸桿菌重組表達載體示意圖。圖2 瓊脂糖電泳檢測重組表達載體酶切。Ml =DNA ladder ；1 重組載體pET21/ RuXynl的EcoR I和Xho I雙酶切結果。圖3 重組酶RuXynl表達、Ni-NTA親和柱純化的蛋白SDS-PAGE電泳圖。M2 protein marker ；泳道 11-14 分別是 300mmol、150mmol、IOOmmol、80mmol 的咪唑洗脫收集液。圖4 重組酶RuXynl的最適反應pH值。圖5 重組酶RuXynl的最適反應溫度。圖6 重組酶RuXynl的pH值穩定性。本圖的縱坐標Ln (relative activity)表示時間t min的活力/Omin的活力比值的自然對數值。圖7 重組酶RuXynl的米氏常數(Km)-溫度曲線。圖8 重組酶RuXynl的轉換常數(k。at)_溫度曲線。縱坐標velocity是速率。圖9 重組酶RuXynl木糖苷酶對木糖的耐受曲線。本圖的縱坐標相對活性 (relative activity)值是以OmM的木糖時酶的催化速度為100%。圖10 重組酶RuXynl阿拉伯糖苷酶對阿拉伯糖的耐受曲線。本圖的縱坐標相對 活性(relative activity)值是以OmM的阿拉伯糖時酶的催化速度為100%。圖11 重組酶RuXynl與木聚糖酶組合物降解木聚糖的還原糖產率。縱坐標是還 原糖(reducing sugar)。圖12 矽膠板薄層層析檢測木聚糖酶解產物。
具體實施例方式實施例1犛牛瘤胃微生物宏基因組cosmid文庫的構建及木糖苷酶的活性篩選採集中國青海犛牛瘤胃樣品，採用3層紗布過濾，濾液離心收集瘤胃微生物菌體， 瘤胃微生物宏基因組的提取方法參見An et al.(《Anaerobe》2005年第11卷第207-215 頁)。瘤胃未培養細菌宏基因組文庫的構建方法參照Epicentre公司pTOB::TNC Cosmid Cloning Kit試劑盒產品說明書。抽提的宏基因組DNA經End-R印air Enzyme Mix末 端補平，與試劑盒中的去磷酸化的載體pWEB: :TNC連接，連接產物用MaxPlax Lambda Packaging Extracts 包裝後、侵染宿主菌 Ε. coli EPI100，後塗布於 LB_ampicillin 平板， 37°C培養12 1 長出菌落，即為該批樣品的宏基因組文庫。β -木苷酶的文庫篩選採用 螢光底物4-甲基傘形酮β- -1，4-木糖苷作為底物。將96孔板微量培養的細胞凍融破碎 後加入10 μ 1的lmg/ml 4-甲基傘形酮β _D_1，4-木糖苷的底物(50mMcitrate-phosphate pH4.8)，37°C反應30分鐘後加入30μ 1 IM Na2CO3，紫外下呈現螢光即為具有β -木糖苷酶 活性的陽性克隆。實施例2瘤胃微生物來源的RuBGXl基因的序列的克隆及分析將篩選到的cosmid陽性文庫克隆，在pGEMllz中進行亞克隆、功能篩選並測序分 析。具體為將篩選到的陽性克隆的cosmid質粒用Sau3AI部分酶切為2-51Λ片段，連接 入經BamHI酶切並去磷酸化的pGEMllz載體中，轉化DH5a，以實施例1中描述的方法對 亞克隆文庫進行功能篩選，得到的亞克隆以T7和SP6通用引物測序，通過分析軟體DNAMAN 分析β-1，4-木糖苷酶基因的編碼區序列，確定其基因核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示， 並命名為RuXynl。RuXynl編碼332個胺基酸，其胺基酸序列見SEQ ID Ν0. 2，理論分子 量為42kDa。利用SMART軟體(http//www. expasy. ch) ·)對RuXynl的蛋白結構域進行 了分析，結果表明RuXynl屬於糖基水解酶家族43 (Glycoside hydrolase family 43)， 且RuXynl的N端胺基酸序列沒有疏水性信號肽序列，說明該酶為胞內酶。同源比對利 用 NCBI (http //www, ncbi. nlm. nih. rov/)的 blast 軟體分析，RuXynl 的基因序列比對 結果表明與野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)的木糖苷酶的同源性最高，核苷 酸序列相似度為75%，RuXynl的蛋白序列比對結果則表明與Bacteroides sp. 43家族的 xylosidase (ref | ZP_04542936. l|)的同源性最高，相似度達67 %，因此，RuXynl的同源性比對結果說明RuXynl是一個新型的半纖維素降解酶。實施例3RuXynl基因在大腸桿菌中的重組表達RuXynl在大腸桿菌中的重組表達採用6His融合表達策略，選用了大腸桿菌 表達載體pET_21a(+)(購自Novagen公司)。具體為設計合成一組寡核苷酸引物 正向引物 21axynlFE :GGCGAATTC GCTGATAAAGTTAAGAAACGC 和反向引物 21axynlFX CCGCTCGAGCTCATCCATGCCTTCGATGGTGCGG (序列中的以下劃線部分分別是限制性內酶EcoRI 和)(h0I的酶切位點，基因序列以斜體表示)，通過PCR擴增RuXynl基因，經瓊脂糖電泳回 收後用EcoRI和BioI分別酶切後，與EcoRI和BioI酶切的載體pET_21a(+)連接，構建的 RuXynl重組表達載體示意圖如圖1所示。連接產物轉化大腸桿菌ToplO菌株，得到的轉化 子利用上述引物進行菌落PCR篩選，獲得轉化子通過雙酶切和測序驗證，EcoR I和B10I酶 切結果如圖2所示。將測序正確的重組載體(命名為pET21a/RUXynl)轉化大腸桿菌表達 菌株E. coli BL21(DE3)進行重組表達。RuXynl的重組表達與純化參照pET表達系統使用 說明書進行。Ni-NTA親和柱純化的重組蛋白，經SDS-PAGE電泳檢測，結果表明最佳洗脫的 咪唑濃度範圍為80-150mM，獲得的蛋白大小為42kD左右，與推斷的RuXynl分子量一致(如 圖3)。實施例4RuXynl的最適反應條件的分析木糖苷酶活性的分析以對硝基酚- β -D木糖苷(para-nitrophenyl-β -D-xylop yranoside, pNPX)為底物，阿拉伯糖苷酶的底物則採用對硝基酚-β _D阿拉伯呋喃糖苷(ρ ara-nitrophenyl-α -L-arabinofuranoside, pNPA)。最適反應pH值的測定以2. 5mM的 pNPX溶解在pH3. 5至pH8. O的50mM檸檬酸-磷酸緩衝液中，反應中止條件為加入等體積的 IMNa2CO3，利用分光光度儀在410nm檢測對硝基酚釋放量來測定酶的活性。從圖4可以發現 RuXynl的最適反應pH值為7. 0，且酸性條件下酶的活力較鹼性條件穩定，表明該酶屬於中 性偏酸性的半纖維素酶。最適的木糖苷酶活性溫度和最適的阿拉伯糖苷酶活性溫度的分析 分別以2. 5mM pNPX(pH7. 0)和2. 5mM pNPA(pH7. 0)為底物，溫度測定範圍從4°C _55°C，結 果如圖5所示，RuXynl的木糖苷酶活性最適溫度為40°C，而阿拉伯糖苷酶活性的最佳活性 溫度為45°C，並且RuXynl具有很強的低溫耐受性(cold-tolerance)，4°C時仍保留10%左 右的活力。木糖苷酶的酶活單位定義為指每分鐘催化pNPX生成Ιμπιο 對硝基苯酚 (p-nitrophenol)所需要的酶量為一個酶活單位(IU)；阿拉伯糖苷酶的酶活單位定義為 指每分鐘催化PNPA生成1 μ mol對硝基苯酚所需要的酶量為一個酶活單位(IU)。以IOmM 的2. 5mM pNPX(pH7. 0)和IOmM pNPA(pH7. 0)分別測定40°C時RuXynl木糖苷酶活性和阿 拉伯糖苷酶活性，結果表明，重組RuXynl能夠催化pNPX生成對硝基苯酚，具備木糖苷酶 活性(39.3IU/mg蛋白)；同時，能夠催化pNPA生成對硝基苯酚，具備阿拉伯糖苷酶活性 (12.9IU/mg 蛋白)。實施例5RuXynl的穩定性的分析RuXyn 1的pH穩定性的分析通過分析RuXyn 1在不同的pH值下t1/2 (酶活性喪失50%所需的時間)。測定方法分別將RuXynl在ρΗ5· 0、ρΗ6· 0、ρΗ7· 0和ρΗ8· 0的檸檬 酸-磷酸緩衝液中，40°C處理一定時間後測定RuXynl殘餘的木糖苷酶活，以時間為橫坐標， 相對活力的自然對數(In)為縱坐標作圖，結果如圖6所示。t1/2的計算採用公式為t1/2 = ln2/kinact (kinact為In相對活力與時間的斜率，通過計算獲得pH5. 0的t1/2為49min，pH6. 0 的 t1/2 為 99min，pH7. 0 的 t1/2 為 17;3min，pH8. 0 的 t1/2 為 3%iin，說明 RuXynl 在中性條件下 即pH7.0時最穩定。實施例6金屬離子及部分化學試劑RuXynl活性的影響在酶的最適合條件下(pH70，40°C )測定金屬離子及部分化學試劑對RuXynl水解 pNPX和pNPA活力的影響。反應體系為酶在一定濃度的金屬離子及部分化學試劑(詳見 下表)中，室溫處理30min後加入終濃度為5mM的pNPG或pNPX，40°C反應5分鐘後加入1 倍體積的IM Na2CO3的中止反應，410nm分光光度法測定產物pNP生成量，結果如下表，5mM 的乙二胺四乙酸(EDTA)對木糖苷酶性和阿拉伯糖苷酶活性抑制分別是23. 7%和33. 5%, 說明RuXynl並非金屬離子依賴型酶，但是，IOmmol金屬離子如Mg2+、Ca2+和Mn2+可以提高酶 活性。從結果還發現10%濃度的乙醇對木糖苷酶性和阿拉伯糖苷酶活性抑制也分別只有 21%和33%左右，該結果表明該酶可適用於纖維乙醇的同步發酵。
權利要求
1.一種木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶雙功能酶，其特徵是，其胺基酸序列如SEQID NO. 2所示。
2.如權利要求1所述的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶雙功能酶，其特徵是，它的核苷酸編碼 序列如SEQ ID NO. 1所示。
3.一種含有權利要求1所述的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶雙功能酶的核苷酸編碼序列的重組載體。
4.如權利要求3所述的重組載體，其特徵是，該重組載體是大腸桿菌表達載體、釀酒酵 母表達載體、畢赤酵母表達載體、枯草芽孢桿菌表達載體、乳酸菌表達載體、絲狀真菌表達 載體、昆蟲表達載體或者哺乳動物細胞表達載體中的任意一種。
5.一種含有權利要求3所述的重組載體的重組菌株。
6.如權利要求5所述的重組菌體，其特徵是，該菌株的宿主細胞是大腸桿菌、釀酒酵 母、畢赤酵母、枯草芽孢桿菌、乳酸菌、絲狀真菌、昆蟲或者哺乳動物細胞中的任意一種。
7.如權利要求1所述的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶雙功能酶的製備方法，包括培養重組 菌株和分離目標蛋白，其特徵是該製備方法依次包括以下步驟(1)利用引物進行聚合酶反應擴增，獲得權利要求1所述的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶雙 功能酶的核苷酸編碼序列，構建木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶雙功能酶重組表達載體；(2)將重組表達載體導入表達宿主細胞，在重組菌體表達木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶雙 功能酶；(3)分離回收木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶雙功能酶。
8.如權利要求1所述的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶雙功能酶的製備方法，其特徵是按照 SEQ ID NO. 2所示序列人工合成所述的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶雙功能酶。
9.權利要求1所述的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶雙功能酶在飼料組合物的製備、半纖維 素或阿拉伯木聚糖的糖化或乙醇生產方面的用途。
10.一種含有木聚糖酶和權利要求1所述的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶雙功能酶的組合物。
全文摘要
本發明屬生物工程領域，提供了一種新型具有耐低溫，並且有β-D-木苷酶活性和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性的雙功能酶RuXyn1。RuXyn1的胺基酸編碼序列如SEQ ID No 2所示，其核苷酸編碼序列如SEQ ID No 1所示。RuXyn1可以採用基因工程方法或者人工合成方法製備。RuXyn1不僅有阿拉伯糖苷酶和木糖苷酶的功能，而且能夠在低溫的環境下保持較高的活性，可用於纖維素生物轉化、化工、紡織、食品、生物能源、飼料添加、醫藥工業方面等應用領域。
文檔編號C12R1/19GK102051350SQ200910198068
公開日2011年5月11日 申請日期2009年10月30日 優先權日2009年10月30日
發明者呂紅, 周峻崗, 袁漢英 申請人:復旦大學