柯薩奇病毒a16核酸檢測用引物、探針及試劑盒的製作方法

2023-05-23 03:43:56 1

專利名稱：：柯薩奇病毒a16核酸檢測用引物、探針及試劑盒的製作方法
技術領域：
：本發明涉及生物檢測技術，特別涉及柯薩奇病毒A16核酸檢測用引物、探針及試劑盒。
背景技術：
：柯薩奇病毒A16(Cox^chev/ms爿M，簡稱CA16)為單股正鏈RNA病毒，屬於小RNA病毒科(屍/coraw/rWae)。CA16是導致兒童手足口病的一種重要病原，所引起的臨床症狀與腸道病毒71型感染引起的手足口病難於區別，但通常情況下，CA16感染一般不引起嚴重的神經系統相關的疾病，由於其亞臨床感染常常被忽略。世界上許多國家和地區曾報導CA16所致手足口病的流行，且每隔3-5年有一次大流行。近年來由於CA16與心肌炎、心包炎及其它嚴重疾病的相關而逐漸受到重視，曰本、馬來西亞和臺灣都有CA16引起手足口病暴發流行的報導。1983-2003年，曰本手足口病的流行是由CA16、CA16地方變異抹和腸道病毒71型交替出現引起。因此，疾病預防控制機構以及醫院急需特異性強，敏感性高，操作簡便，可用於手足口病等暴發疫情和臨床病例的早期快速診斷的方法。手足口病於2008年5月2日已被納入傳染病防治法規定的丙類傳染病進行管理。因此，快速、簡單、高靈敏度的檢測方法對該病的防控極其重要。經典的檢測腸病毒的方法多採用細胞培養、特異性抗體檢測，該方法步驟煩瑣，檢測周期長，而且一些腸道病毒難以在細胞中進行增殖，容易出現漏檢；傳統的RT-PCR也被用於檢測EV71和CA16，但檢測時間需要6小時。實時螢光RT-PCR(wa/Wme//wr^a^7r-PO)技術具有靈敏度高、特異性強、速度快、抗汙染、高通量等優點逐漸取代了傳統RT-PCR技術。本發明選擇柯薩奇病毒A16VP1基因設計了用於螢光RTJCR檢測的引物及探針序列，建立了柯薩奇病毒A16螢光RT-PCR檢測技術，反應結束即可根據擴增曲線判定是否有柯薩奇病毒A16。
發明內容本發明所要解決的技術問題是提供一種用於柯薩奇病毒A16實時螢光RT-PCR檢測的引物、探針序列及試劑盒，使得能夠快速簡單地判斷樣品是否有柯薩奇病毒A16,為手足口病的病原學診斷提供科學依據。為了解決上述技術問題，本發明在分析已報導柯薩奇病毒A16VP1基因序列的基礎上，分別設計引物及焚光探針，所述的引物由正向引物和反向引物組成，其核苷酸序列如下正向引物5，-GAACCATCACTCCACACAGGAG-3，；反向引物5'-GTACCCGTGGTGGGCATTG-3，。本發明設計的探針的核苷酸序列如下5'-CAGCCATTGGGAATTTCTTTAGCCGTG-3，，該探針一端標記有報告螢光染料，另一端標記有淬滅螢光染料。其中，報告螢光染料可釆用下列螢光基團中的任意一種Fam、Hex、Tet、Joe、Vic、FITC、Cy3和Cy5。淬滅焚光染料可採用下列焚光基團中的任意一種Tamra、Rox、Dabcyl、BHQ1和BHQ2。根據TaqMan技術，在常規PCR的基礎上添加了一條標記有兩個螢光染料基團的核苷酸探針，例如將報告螢光染料標記在探針的5'端，淬滅螢光染料標記在探針的3'端，兩者構成能量轉移結構，即報告焚光染料所發射的焚光可被淬滅焚光染料吸收，當二者距離變遠時，抑制作用減弱，報告螢光染料信號增強。在擴增反應過程中，探針同模板上的目的擴增片段雜交，由於Taq酶具有5'端到3'端的外切酶活性，在擴增延伸階段將探針切斷，淬滅焚光染料的抑制作用消失，報告螢光染料信號增強，從而實現對柯薩奇病毒A16的檢測。本發明進一步給出了應用上述引物和探針檢測柯薩奇病毒A16核酸的方法，該方法是以樣品RNA為模板，利用上述的正向引物、反向引物以及探針進行實時螢光RT-PCR擴增，每個循環結束採集數據，反應結束後根據擴增曲線判定結果。具體地說本發明以RNA為摸板，進行實時螢光RT-PCR反應，即在25(al反應體系加入2.5^il10xOneStepRNAPCRBuffer,2juldNTP(各2.5mM),上述正向引物和反向引物(10|iM)各1.5jil，O，上述探針(lOjiM),0.5|ilTaq酶，0.5^1RNaseInhibitor(40U/pl)，0.5)ilAMVRTaseXL(5U/|al)，5|alRNA，10.5|ilRNaseFreedH20。其中，上述反應條件可以是42。C反轉錄25min,95。C變性3min,以95。C10s，60°C1min(收集螢光信號)擴增40個循環。當然，可以根據本發明給出的引物對或者其擴增產物序列設計其他類型的探針，以適用不同方法的焚光PCR檢測。進一步，還可以將本發明的引物、探針以及相關試劑組裝成試劑盒，以方便使用。本發明根據柯薩奇病毒A16VP1基因序列設計的引物特異性好，用於螢光PCR檢測的靈敏度高。本發明檢測方法準確性高、靈敏度高，其能夠快速簡單地判斷樣品是否有柯薩奇病毒A16,為手足口病的病原學診斷及鑑別診斷提供了科學依據。圖1是實時螢光RT-PCR技術柯薩奇病毒A16核酸檢測的特異性實驗的檢測結果圖2是本發明檢測方法的靈敏度實驗的檢測結果圖。具體實施例方式下面實施例用於對本發明的進一步說明，但不用來限制本發明的範圍。引物及探針的設計和合成根據GenBank中CA16VP1基因序列，利用生物軟體PrimerExpressV2.0分別在其保守位點設計引物和Taqman探針，並通過NCBI資料庫進行了Blast同源性比對驗證。引物序列為CA16Pf(正向)5，-GAACCATCACTCCACACAGGAG-3'CA16Pr(反向)5，-GTACCCGTGGTGGGCATTG-3，探針的序列為5，-CAGCCATTGGGAATTTCTTTAGCCGTG-3'該探針的5'端用報告螢光染料VIC標記，3'端用淬滅焚光染料BHQ2標記。RNA的提取病毒樣品RNA的抽提用RocheHighPureviralRNAkit試劑盒提取，取0.5克左右糞便標本，力口TE500jil製成10-20。/。的懸液，8000rpm離心5分鐘；取200(il標本上清加400ial結合液，混合均勻，加入純化過濾管中，10000rpm,15s;棄去過濾液，換一新的收集管，加入500fi1inhibitorremovalbuffer,10000rpm離心l分鐘；棄去過濾液，換一新的收集管，加入450ial洗液，10000rpm離心l分鐘；重洗一次；最後離心，13000rpm,10s,棄去殘餘的洗液；去掉收集管，換一個乾淨的無RNA的1.5m正ppendrof離心管，用50fil洗脫液加入過濾管中，10000卬m離心l分鐘，將提取的RNA移到一個新的離心管中，於-80°C保存。Real-timeRT-PCR擴增方法的建立:1、實時螢光RT-PCR反應體系以RNA為模板，進行實時RT-PCR反應。螢光定量RT-PCR反應體系如下表tableseeoriginaldocumentpage62、實時螢光RT-PCR反應條件將樣品管放入ABI公司7300螢光PCR儀後，設置如下條件進行反應42°C反轉錄25min，95。C變性3min，以95°C10s,60°C1min(收集螢光信號)擴增40個循環。每個循環結束採集數據。反應結束後根據擴增曲線判定結果。柯薩奇病毒A16核酸Real-timeRT-PCR方法的特異性確定利用建立起的螢光RT-PCR反應體系對9抹不同的人類病毒進行檢測，檢測結果如圖l所示，3林CA16病毒(編號為CA16-SZ13,CA16-GZ07，CA16-SZ08)均出現相應的特異性螢光擴增曲線(參見圖中A所指)，呈陽性反應。而其他6抹人類病毒(包括3林滅活的脊髓灰質炎病毒PolioI、PolioII、PolioIII,兩抹輪狀病毒、1抹諾如病毒。)則均沒有螢光信號產生(參見圖中B所指)，判為陰性。結果表明，所設計的引物探針只對目的病毒(即，CA16病毒)特異，與其它^^測對象無交叉反應。試驗結果以柯薩奇病毒A16的RNA為模板，通過實時螢光RT-PCR檢測可觀察到明顯的螢光強度變化，而其他病毒的螢光強度沒有變化。靈敏度實驗:將CA16體外轉錄RNA用DEPC處理的水分別稀釋，進行相對靈敏度檢測，在25pl反應體系中，RNA分別被稀釋成5.0x107、5.0x106、5.0x105、5.0x104、5.0x103、5.0x102、5.0xl(^拷貝數,檢測結果如圖2所示，結果證實CA16病毒檢測的最低檢測限均達到50個模板拷貝。核苷酸序列表何雅青肖性龍<120〉柯薩奇病毒A16核酸檢測用引物、探針及試劑盒<160〉3Patentlnversion3.3122DNA人工序列人工序列的描述1gaaccatcactccacacagg昭2<211〉19DNA人工序列<223〉人工序列的描述<400〉2gtacccgtggtgggcattg327DNA人工序列人工序列的描述探針3cagccattgggaatttctttagccgtg278引物22引物權利要求1、一種柯薩奇病毒A16核酸檢測用引物，其特徵在於，該引物的核苷酸序列為正向引物5』-GAACCATCACTCCACACAGGAG-3』；反向引物5』-GTACCCGTGGTGGGCATTG-3』。2、一種與權利要求1所述引物配合使用的探針，其特徵在於，該探針的核苷酸序列為5'-CAGCCATTGGGAATTTCTTTAGCCGTG-3',該探針一端標記有報告螢光染料，另一端標記有淬滅螢光染料。3、如權利要求2所述的探針，其特徵在於報告螢光染料採用VIC螢光基團，標記在探針的5，端，淬滅螢光染料採用BHQ2螢光基團，標記在探針的3'端。4、一種檢測柯薩奇病毒A16核酸的方法，其特徵在於該方法以樣品RNA為模板，利用權利要求1所述的正向引物和反向引物以及權利要求2或3所述的探針進行實時螢光RT-PCR擴增，每個循環結束採集數據，反應結束後根據擴增曲線判定結果。5、如權利要求4所述的方法，其特徵在於，實時焚光RT-PCR擴增反應採用25(il反應體系，該反應體系的組分如下2.5^110xOneStepRNAPCRBuffer，終濃度為0.4mM的dNTP，終濃度為0.6jiM的所述正向引物，終濃度為0.6(iM的所述反向引物，終濃度為0.2liM的所述探針，終濃度為2.5U的Taq酶，終濃度為20U的RNaseInhibitor,終濃度為2.5U的AMVRTaseXL,5)il樣品脂A,10.5|ilRNaseFreedH20;實時螢光RT-PCR擴增反應的反應條件如下42。C反轉錄25min;95。C變性3min;以95°C10s,60°C1min擴增40個循環。6、一種柯薩奇病毒A16核酸檢測用試劑盒，其特徵在於含有權利要求1所述的正向引物和反向引物。7、如權利要求6所述的試劑盒，其特徵在於還包括權利要求2或3所述的探針。全文摘要本發明涉及柯薩奇病毒A16核酸檢測用引物、探針及試劑盒，其引物的核苷酸序列為正向引物5』-GAACCATCACTCCACACAGGAG-3』；反向引物5』-GTACCCGTGGTGGGCATTG-3』。其探針的核苷酸為5』-CAGCCATTGGGAATTTCTTTAGCCGTG-3』。還提供了檢測柯薩奇病毒A16核酸的方法，該方法以樣品RNA為摸板，利用上述引物和探針進行實時螢光RT-PCR擴增，每個循環結束後根據擴增曲線判定結果。本發明引物特異性好，檢測方法快速簡單，準確性高，靈敏度高，為手足口病及相關疾病的病原學診斷及鑑別診斷提供了科學依據。文檔編號C12Q1/68GK101676406SQ20081021616公開日2010年3月24日申請日期2008年9月18日優先權日2008年9月18日發明者何雅青,肖性龍申請人:何雅青;肖性龍