白藜蘆醇印跡聚合物的製備及用於白藜蘆醇的提取方法
2023-05-23 06:13:21
專利名稱：白藜蘆醇印跡聚合物的製備及用於白藜蘆醇的提取方法
技術領域：
本發明屬於新型化學分離材料的合成領域，及其在虎杖中分離白藜蘆醇的應用。
背景技術：
白藜蘆醇(Resveratrol)是一種天然活性物質，研究認為，白藜蘆醇具有明顯抗癌、抗高血脂、抗菌、抗炎、心血管保護和防治骨質疏鬆等多方面的活性。天然白藜蘆醇存在反式和順式兩種構型，其中反式異構體的生物活性高於順式異構體。
虎杖是我國傳統中草藥，為蓼科植物虎杖的根莖。由於含有反式白藜蘆醇，可以作為白藜蘆醇的主要來源。目前，已經有多種從虎杖中提取白藜蘆醇的方法。
虎杖含有多種成分，包括白藜蘆醇、白藜蘆醇甙；蒽醌類(大黃素、大黃酚等)；酚類；黃酮類及甙等；另外還含有多糖、單糖、有機酸、微量元素以及鞣質。由於成分複雜，目前使用傳統方法(例如液-液萃取、鍵合矽膠固相吸附方法)進行虎杖中白藜蘆醇的提取，所需步驟仍比較繁瑣，導致溶劑及時間成本的增加。
分子印跡技術是以目標分子為模板，製備具有分子識別能力的聚合物的一種技術，分子印跡聚合物在臨床藥物分析、對映體和異構體的分離、固相萃取、膜分離技術等方面都具有良好的應用前景。應用分子印跡聚合物進行中藥有效成分的分離提取，具有高選擇性、高效的特點，可以減少分離步驟，降低成本，是具有應用價值及發展前景的技術。
發明內容本發明的目的是解決使用傳統方法進行虎杖中白藜蘆醇的提取步驟比較繁瑣，導致溶劑及時間成本增加的問題，提供一種白藜蘆醇分子印跡聚合物(下面稱為白藜蘆醇印跡聚合物)的製備及用於白藜蘆醇的提取方法。
本發明提供的白藜蘆醇印跡聚合物的製備方法，包括如下步驟1)、將反式白藜蘆醇作為模板分子，與功能單體4-乙烯基吡啶、交聯劑乙二醇二甲基丙烯酸酯、引發劑偶氮二異丁腈溶解於丙酮中；其中，模板分子與功能單體的摩爾比為1∶4到1∶6之間，功能單體與交聯劑的摩爾比為1∶5到1∶6之間；引發劑與功能單體和交聯劑總量的摩爾比約為1∶100；按功能單體和交聯劑總量每克溶於約1mL丙酮中(在印跡聚合物製備中，模板分子、功能單體與交聯劑應用較多的摩爾比為1∶4∶20)；溶液除氧後，密封，在60℃水浴中聚合24h；2)、將上步中得到的聚合物粉碎，過篩，以10％醋酸-甲醇溶液和甲醇洗提，除去聚合物中的模板分子和未反應的試劑，製得粒徑約為36μm的白藜蘆醇印跡聚合物顆粒。
在研究過程中，比較了以不同的功能單體α-甲基丙烯酸(MAA)、丙烯醯胺(AM)和4-乙烯基吡啶(4-VP)，及不同的溶劑乙酸乙酯、丙酮為條件得到的印跡聚合物，其中以4-乙烯基吡啶為單體、丙酮為溶劑得到的聚合物具有最佳的選擇性。將印跡聚合物與非印跡聚合物(以除不加印跡分子外，其它合成條件同印跡聚合物合成得到的聚合物)比較證明，印跡聚合物具有類似於免疫親和柱的識別位點，對於白藜蘆醇有很好的選擇性。
一種用上述方法製備的白藜蘆醇印跡聚合物從虎杖中分離提取白藜蘆醇的方法，該方法的具體步驟如下1)、將虎杖粉碎後，以甲醇提取；2)、提取液濃縮後，加入裝有上述方法製得的白藜蘆醇印跡聚合物顆粒的150mm×4.6mm分子印跡色譜柱中(也可以用於半製備色譜柱)，以體積比80/20的甲醇-水作為流動相進行分離；3)、在上步分離中，除白藜蘆醇和大黃素外，其他組分首先被衝出色譜柱，其次是白藜蘆醇，最後是大黃素，依次收集流出的組分，分別得到白藜蘆醇(純度為80％)和大黃素(純度為90％)。
本發明的優點及效果本發明提供了一種新型分離材料的合成方法及高效的白藜蘆醇分離方法。該方法以反式白藜蘆醇(trans-resveratrol)為模板分子，利用分子印跡技術製備了白藜蘆醇印跡聚合物。並以白藜蘆醇印跡聚合物為色譜固定相，建立了虎杖中白藜蘆醇的提取分離方法，該分離方法可以在一步完成對於虎杖提取液中白藜蘆醇的分離提取，回收率達到80％以上，同時可以分離虎杖中的大黃素(emodin)，回收率達到98％。
本發明方法中的分子印跡分離固定相具有很好的選擇性，能夠分離反式和順式白藜蘆醇。
本發明提供的分子印跡聚合物同時也能夠將其它結構類似物(包括虎杖中含有的虎杖甙等)與白藜蘆醇分離。反式白藜蘆醇和其他結構類似物在不同甲醇-水的流動相條件下均具有差別很大的保留因子(k)，因此都能夠被分離。白藜蘆醇印跡聚合物可以用於複雜體系(例如植物)中白藜蘆醇的高效提取分離。
本發明應用於虎杖中白藜蘆醇的提取，具有高效的分離、純化結果。
圖1是順、反式白藜蘆醇在印跡聚合物(以4-乙烯基吡啶為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯劑，丙酮為溶劑製備)固定相上的色譜拆分圖，其中，cis-表示順式白藜蘆醇，Trans-表示反式白藜蘆醇；圖2是流動相中水含量對白藜蘆醇及其類似物在分子印跡柱上的保留(以保留因子k表示)的影響示意圖，圖中，■，表示反式白藜蘆醇；，表示雙酚A；●，表示白藜蘆醇甙；△，表示順式白藜蘆醇；，表示兒茶酚；圖3是以三種功能單體製備的印跡聚合物對於白藜蘆醇的吸附曲線。圖中，P1，P2，P3分別為以α-甲基丙烯酸、丙烯醯胺和4-乙烯基吡啶為功能單體製備的白藜蘆醇印跡聚合物，均以乙酸乙酯為溶劑；圖4(a)、(b)、(c)是以三種功能單體製備的印跡聚合物對於順式及反式白藜蘆醇分離的色譜圖。圖中，P1，P2，P3分別為以α-甲基丙烯酸、丙烯醯胺和4-乙烯基吡啶為功能單體製備的白藜蘆醇印跡聚合物，均以乙酸乙酯為溶劑；圖5是虎杖提取液的白藜蘆醇和大黃素的分離色譜圖；圖6(a)、(b)是反相液相色譜法測定經印跡聚合物色譜柱分離後的白藜蘆醇和大黃素的純度的色譜圖；圖中，B為分離後的白藜蘆醇組分(峰a為白藜蘆醇)的色譜圖，C為分離後的大黃素組分(峰b為大黃素)的色譜圖。
具體實施方式
實施例1製備分子印跡聚合物將反式白藜蘆醇(模板分子)、4-乙烯基吡啶(功能單體)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(交聯劑)、偶氮二異丁腈(引發劑)溶解於丙酮中，稱量0.45g(2.0mmol)反式白藜蘆醇，溶解於約9mL丙酮中，依次加入4-乙烯基吡啶0.84g(8.0mmol)、乙二醇二甲基丙烯酸酯7.9g(40mmol)、偶氮二異丁腈0.094g(0.57mmol)，超聲溶解15min，通氮氣除氧10min，然後將混合液轉入安培瓶中， 密封，60℃ 水浴中聚合24h。將聚合物粉碎，過篩，得到一定粒徑的無定型顆粒。先後以10％醋酸-甲醇溶液和甲醇洗提，除去聚合物中的模板分子和未反應的試劑，將顆粒裝入色譜柱(150mm×4.6mm)中，用於色譜分離。分子印跡分離固定相具有很好的選擇性，能夠分離反式和順式白藜蘆醇，見色譜圖(圖1，其中，cis-表示順式白藜蘆醇，Trans-表示反式白藜蘆醇)。
研究證明，分子印跡聚合物也能夠分離其它結構類似物(包括虎杖中含有的虎杖甙)。反式白藜蘆醇和其他結構類似物在不同甲醇-水的流動相條件下均具有差別很大的保留因子(k)，即都能夠被分離(見圖2，圖中，■，表示反式白藜蘆醇；、表示雙酚A；●、表示白藜蘆醇甙；△、表示順式白藜蘆醇；、表示兒茶酚)。
實施例2以乙酸乙酯代替丙酮作為溶劑，其它條件同上，進行分子印跡聚合物的製備，得到用於白藜蘆醇分離的印跡聚合物。
比較以不同的功能單體(α-甲基丙烯酸、丙烯醯胺和4-乙烯基吡啶)得到的印跡聚合物，實驗結果表明，以丙烯醯胺為單體得到的聚合物也有一定的選擇性，但低於以4-乙烯基吡啶為單體得到的聚合物，三種聚合物的吸附性能的比較見圖3(圖中，P1，P2，P3分別為以α-甲基丙烯酸、丙烯醯胺和4-乙烯基吡啶為功能單體製備的白藜蘆醇印跡聚合物，均以乙酸乙酯為溶劑)。三種聚合物的對於順式和反式白藜蘆醇分離的色譜圖見圖4(圖中，P1，P2，P3分別為以α-甲基丙烯酸、丙烯醯胺和4-乙烯基吡啶為功能單體製備的白藜蘆醇印跡聚合物，均以乙酸乙酯為溶劑)。
實施例3虎杖提取及色譜分離將虎杖粉碎後，過60目篩，加甲醇超聲後，浸提24h。再經超聲20min後過濾，得到提取液。提取液濃縮後，加入分子印跡色譜柱，以甲醇-水(體積比80/20)作為流動相進行分離。收集流出組分，蒸去溶劑，得到白藜蘆醇(純度為80％)和大黃素(純度為90％)。虎杖提取液的分離色譜圖見圖5。在分離中，除了白藜蘆醇和大黃素外，其他組分首先被衝出色譜柱，其次是白藜蘆醇，最後是大黃素，具有高效的分離、純化結果。
經測定證明，這種提取方法得到的白藜蘆醇和大黃素的回收率分別約為82％和98％，五次分離(平行實驗)得到的結果見下表。
表1以分子印跡聚合物進行虎杖中白藜蘆醇和大黃素分離提取的回收率及組分純度(5次平均值)
經白藜蘆醇印跡聚合物提取分離後，以反相液相色譜方法測定得到的白藜蘆醇和大黃素的純度(色譜柱裝有粒徑為5μm的Inertsil ODS-2C18固定相，尺寸為150×4.6mm的不鏽鋼分析柱)，色譜圖見圖6(其中，圖B為分離後的白藜蘆醇組分(峰a為白藜蘆醇)的色譜圖，圖C為分離後的大黃素組分(峰b為大黃素)的色譜圖，計算得出的純度見表1。
權利要求
1.一種白藜蘆醇印跡聚合物的製備方法，其特徵是該方法包括如下步驟1)、將反式白藜蘆醇作為模板分子，與功能單體4-乙烯基吡啶、交聯劑乙二醇二甲基丙烯酸酯、引發劑偶氮二異丁腈溶解於丙酮中；其中，模板分子與功能單體的摩爾比為1∶4到1∶6之間，功能單體與交聯劑的摩爾比為1∶5到1∶6之間；引發劑與功能單體和交聯劑總量的摩爾比為1∶100；按功能單體和交聯劑總量每克溶於1mL丙酮中；溶液除氧後，密封，在60℃水浴中聚合24h；2)、將上步中得到的聚合物粉碎，過篩，洗提，除去聚合物中的模板分子和未反應的試劑，製得白藜蘆醇印跡聚合物顆粒。
2.根據權利要求1所述的白藜蘆醇印跡聚合物的製備方法，其特徵是在印跡聚合物製備中，模板分子、功能單體與交聯劑的較佳摩爾比為1∶4∶20。
3.一種用權利要求1製備的白藜蘆醇印跡聚合物從虎杖中分離提取白藜蘆醇的方法，其特徵是該方法的具體步驟如下1)、將虎杖粉碎後，以甲醇提取；2)、提取液濃縮後，加入裝有權利要求1中製得的白藜蘆醇印跡聚合物顆粒的150mm×4.6mm分子印跡色譜柱或半製備色譜柱中，以體積比80/20的甲醇-水作為流動相進行分離；3)、在上步分離中，除白藜蘆醇和大黃素外，其他組分首先被衝出色譜柱，其次是白藜蘆醇，最後是大黃素，依次收集流出的組分，分別得到白藜蘆醇和大黃素。
4.根據權利要求3所述的從虎杖中分離提取白藜蘆醇的方法，其特徵是得到的白藜蘆醇的純度為80％，大黃素的純度為90％。
全文摘要
白藜蘆醇印跡聚合物的製備及用於白藜蘆醇的提取方法。印跡聚合物的製備包括將反式白藜蘆醇作為模板分子，與功能單體4－乙烯基吡啶、交聯劑乙二醇二甲基丙烯酸酯、引發劑偶氮二異丁腈溶解於丙酮中，水浴中聚合；聚合物粉碎，過篩，用醋酸－甲醇將模板分子及未反應試劑洗脫出來，製得白藜蘆醇印跡聚合物顆粒。從虎杖中提取白藜蘆醇的方法包括虎杖以甲醇提取後濃縮，加入分子印跡色譜柱中，以甲醇－水為流動相分離；收集流出組分，得到白藜蘆醇(純度80％)和大黃素(純度90％)。本發明中的分子印跡固定相具有高選擇性，可分離白藜蘆醇順反異構體，同時也能夠分離其它結構類似物(包括虎杖中的虎杖甙等)。本發明具有高效的分離、純化結果。
文檔編號C08F2/44GK1978473SQ20061013041
公開日2007年6月13日 申請日期2006年12月20日 優先權日2006年12月20日
發明者董襄朝, 馬淑娟, 莊曉磊 申請人:南開大學