用於修復神經損傷的水凝膠包裹慢病毒Lingo-1RNAi複合物及其製備方法
2023-05-22 23:53:26
專利名稱：用於修復神經損傷的水凝膠包裹慢病毒Lingo-1 RNAi複合物及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種水凝膠和慢病毒Ling0-I RNAi的複合物及其製備方法，尤其是一種水凝膠包裹慢病毒Lingo-1 RNAi複合物及其製備方法。
背景技術：
根據可靠的流行病統計，美國約有脊髓損傷病人25萬，且年增I. I萬名新患者，每年新發病率為十萬分之四。據此推算，全世界至少年新增24萬名脊髄損傷病人。 我國是世界人ロ大國，脊髄損傷病人數量也居世界第一。根據我國國家生產安全委員會的初歩統計，毎年由於生產事故所造成的脊髄損傷患者就達5-6萬人，因交通事故造成的脊髄損傷病人多達7-8萬人。據有關資料，我國脊髄損傷患者已達100萬人。對於這些患者來說，即使通過治療能夠使患者的生命得以延續，但脊髄損傷導致的終身殘疾給家庭及社會造成沉重的負擔，也嚴重地影響患者的生活質量。在世界上，神經損傷後的再生修復一直是神經科學研究中的ー項重要課題，脊髄損傷修復的研究已有近百年的歷史。解決脊髓損傷後的中樞神經修復和功能重建，是各國醫學界普遍關注並投入巨資廣泛研究的重大難題。
發明內容
針對上述問題，本發明的目的在於提供ー種對脊髓損傷修復具有顯著效果的水凝膠包裹慢病毒Lingo-1 RNAi複合物；同時，本發明還提供一種所述水凝膠包裹慢病毒Lingo-1 RNAi複合物的製備方法。為實現上述目的，本發明採取的技術方案為ー種水凝膠包裹慢病毒Lingo-IRNAi複合物的製備方法,包括以下步驟(I)慢病毒 Lingo-1 RNAi 的構建；(2)水凝膠的製備將水凝膠與去離子水在無菌條件下配製成質量比為20% 25%的混懸液，將混懸液置於2_8°C至水凝膠充分溶解，過濾除菌，得水凝膠原液；(3)將步驟⑴構建的慢病毒Lingo-1 RNAi與步驟⑵製備的水凝膠原液在2 80C以每毫升水凝膠原液中含I X IO7TU的慢病毒Lingo-1 RNAi的濃度混合，攪拌使其充分混合，得混合液；(4)取步驟(3)得到的混合液以200 μ L每孔加至24孔板，使其平鋪孔底，放置於25 V 37°C培養箱溫育3-5min，取出後，孔底形成不透明薄膠狀物，即得水凝膠包裹慢病毒Lingo-1 RNAi複合物。所述慢病毒Lingo-1 RNAi與水凝膠原液的混合液在溫度> 25°C、彡37°C即可形成凝膠(成膠化)，因此該混合物在液體狀態下移植在體內溫度下易於隨損傷部位裂隙形狀膠化成形，並對局部缺損脊髄起固定力學支撐作用，有效防止瘢痕形成和擴大。採用上述方法得到的水凝膠包裹慢病毒Lingo-1 RNAi複合物膠化後內部形成三維孔洞，為神經再生延伸及突觸形成提供了有利條件。同時，該複合物負載慢病毒Lingo-1 RNAi局部膠化後可有效防止慢病毒Lingo-1 RNAi流失，並持續釋放，有效維持局部感染病毒滴度，阻抑髓鞘抑制因子抑制性信號轉導，促進神經再生和髓鞘形成。上述方法中所述水凝膠原液一般情況下儲存於2-8°C的環境(如醫用冰箱、冷藏櫃等)，所述慢病毒Lingo-1 RNAi儲存於液氮或_80°C環境，製備所述複合物時，將水凝膠原液和慢病毒Lingo-1 RNAi按ー定比例混合，攪拌使充分混合即可。上述方法中所用水凝膠原液、慢病毒Lingo-1 RNAi及製備所得水凝膠包裹慢病毒Lingo-1 RNAi複合物，儲存及運輸方便。步驟⑷中在孔底形成不透明薄膠狀物，即水凝膠包裹慢病毒Lingo-1 RNAi混合液成膠化，螢光顯微鏡下觀察有緑色小顆粒或點狀物質均勻分布於水凝膠中，即證明包裹成功。以上步驟均在無菌條件下操作。慢病毒Lingo-1 RNAi 的構建方法參見文獻 Mi S，Miller RH, Lee X，etal. LINGO-1 negatively regulatesmyelmation by oligodendrocytes. Nat Neurosci,2005,8(6) :745-751。其中綠色螢光蛋白(GFP)標記慢病毒改用增強型綠色螢光蛋白(EGFP)標記。作為本發明所述水凝膠包裹慢病毒Lingo-1 RNAi複合物的製備方法的優選實施方式，所述RNAi的核苷酸序列為UCGAGAAAAAAAAGCACAACAUCGAAAUUGAAUCUCUUGAAUUCAAUUUCGAUGUUGUGCUUA。RNAi的核苷酸序列
權利要求
1.一種用於修復神經損傷的水凝膠包裹慢病毒LingO-I RNAi複合物的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟 (1)慢病毒Lingo-1RNAi的構建； (2)水凝膠的製備將水凝膠與去離子水在無菌條件下配製成質量比為20% 25%的混懸液，將混懸液置於2-8°C至水凝膠充分溶解，過濾除菌，得水凝膠原液； (3)將步驟(I)構建的慢病毒Lingo-1RNAi與步驟(2)製備的水凝膠原液在2 8°C以每毫升水凝膠原液中含I X IO7TU的慢病毒Lingo-1 RNAi的濃度混合，攪拌使其充分混合，得混合液； (4)取步驟(3)得到的混合液以200yL每孔加至24孔板，使其平鋪孔底，放置於25°C 37°C培養箱溫育3-5min，取出後，孔底形成不透明薄膠狀物，即得水凝膠包裹慢病毒Lingo-1 RNAi複合物。
2.如權利要求I所述的水凝膠包裹慢病毒Lingo-1RNAi複合物的製備方法，其特徵在於，所述RNAi的核苷酸序列為UCGAGAAAAAAAAGCACAACAUCGAAAUUGAAU ⑶⑶ UGAAUUCAAUUUCGA 腳腳 G ⑶ UA。
3.如權利要求I所述的水凝膠包裹慢病毒Lingo-1RNAi複合物的製備方法，其特徵在於，所述水凝膠為Pluronic F-127水凝膠。
4.如權利要求I所述的水凝膠包裹慢病毒Lingo-1RNAi複合物的製備方法，其特徵在於，所述步驟(2)中，將混懸液置於4°C至水凝膠充分溶解後，採用O. 22μπι孔徑的瓶蓋式過濾器過濾除菌。
5.一種採用如權利要求I所述方法製備得到的水凝膠包裹慢病毒Lingo-IRNAi複合物，其特徵在於，所述複合物由水凝膠原液和慢病毒Lingo-1 RNAi的混合液製備而成，每毫升水凝膠原液中含I X IO7TU的慢病毒Lingo-1 RNAi，所述水凝膠原液中含有的水凝膠與去離子水的質量比為20% 25%。
6.如權利要求5所述的水凝膠包裹慢病毒Lingo-1RNAi複合物，其特徵在幹，所述RNAi的核苷酸序列為UCGAGAAAAAAAAGCACAACAUCGAAAUUGAAU ⑶⑶ UGAAUUCAAUUUCGA 腳腳 G ⑶ UA。
7.如權利要求5所述的水凝膠包裹慢病毒Lingo-1RNAi複合物，其特徵在於，所述水凝膠為Pluronic F-127水凝膠。
8.一種採用如權利要求I所述方法製備得到的水凝膠包裹慢病毒Lingo-IRNAi複合物在製備治療脊髓損傷的藥物中的應用。
9.如權利要求8所述的水凝膠包裹慢病毒Lingo-1RNAi複合物的應用，其特徵在幹，所述RNAi的核苷酸序列為UCGAGAAAAAAAAGCACAACAUCGAAAUUGAAU ⑶⑶ UGAAUUCAAUUUCGA 腳腳 G ⑶ UA。
10.如權利要求8所述的水凝膠包裹慢病毒Lingo-1RNAi複合物的應用，其特徵在幹，所述水凝膠為Pluronic F-127水凝膠。
全文摘要
本發明公開一種用於修復神經損傷的水凝膠包裹慢病毒Lingo-1 RNAi複合物，採用Lingo-1 RNAi聯合水凝膠生物支架及釋放的策略，RNAi幹擾Lingo-1協同水凝膠促進脊髓損傷軸突再生，為脊髓損傷修復提供了新的治療途徑。本發明還公開了所述水凝膠包裹慢病毒Lingo-1 RNAi複合物的製備方法，所述方法操作方便，易於實現。同時，本發明又公開了所述水凝膠包裹慢病毒Lingo-1RNAi複合物在製備治療脊髓損傷的藥物中的應用。
文檔編號A61L31/06GK102657874SQ201210033970
公開日2012年9月12日 申請日期2012年2月15日 優先權日2012年2月15日
發明者萬勇, 吳洪福, 鄧宇斌 申請人:中山大學