一種基於埃博黴素b代謝途徑的發酵生產方法
2023-05-23 02:33:41 4
專利名稱：一種基於埃博黴素b代謝途徑的發酵生產方法
技術領域：
本發明屬於發酵工程技術領域，涉及微生物發酵製藥技術，具體涉及一種埃博黴素B的發酵生產方法。
背景技術：
埃博黴素是纖維堆囊菌產生的一種次級代謝產物，是一種十六元大環內酯類抗癌藥物，它與抗癌藥物紫杉醇一樣具有促微管聚合作用從而抑制腫瘤細胞的增殖，並且與紫杉醇相比，埃博黴素具有毒性更小，水溶性更好，對耐藥性細胞作用更強，抗腫瘤譜更廣等優點，同時化學結構簡單，易於進行修飾，引起了生物、醫學、製藥及有機合成等學科領域的高度重視，因此是目前學術界密切關注的、醫藥界寄予厚望的、前景廣闊的一類新型抗腫瘤藥物。目前埃博黴素B已進入臨床研究。埃博黴素生物合成的調控機制並不清晰，綜合文獻可知，埃博黴素B的內酯環是由3個乙酸單位、4個丙酸單位和一個噻唑環縮合形成的，而乙酸單元和丙酸單元分別是以丙二酸單醯輔酶A和甲基丙二酸單醯輔酶A為前體的。目前埃博黴素B的產量還比較低，且不穩定，受培養條件和環境的等因素的影響很大。
發明內容
本發明解決的問題在於提供一種基於埃博黴素B代謝途徑的發酵生產方法，能夠提高埃博黴素B的產量，同時降低發酵成本。本發明是通過以下技術方案來實現:一種基於埃博黴素B代謝途徑的發酵生產方法，包括以下步驟:
I)將纖維堆囊菌接種於M26培養基中，在25 35°C下搖床培養72 120h，得到種子液；2)按IOOml接種5 15ml的比例，將種子液接種至含有樹脂的發酵液中，在25 35°C下搖床培養72 120h，在培養O 72h內向含有樹脂的發酵液中添加前體物和/或小分子物質，所述的前體物為乙酸鈉、丙酸鈉、半胱氨酸中的一種或幾種，小分子物質為甲基丙二酸、脂肪族類胺基酸、亞鐵氰化鉀、生物素中的一種或幾種；3)將培養後的發酵液過濾，收集樹脂，樹脂經水洗滌後再經甲醇振蕩，得到含有埃博黴素B的浸提液。所述乙酸鈉、丙酸鈉、甲基丙二酸的用量為0.25 7mmol/L，半胱氨酸及脂肪族類胺基酸的用量為40 80umol/L，亞鐵氰化鉀的用量為I X 10_5 3 X 10_5mOl/L，生物素的用量為:1 10ug/Lo所述的脂肪族類胺基酸為蛋氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸中的一種或幾種。培養初始向含有樹脂的發酵液中分別按5 8ug/L、40 60umol/L、30 50umol/L的量添加生物素、蛋氨酸和半胱氨酸。
培養初始向含有樹脂的發酵液中分別按5 8ug/L、40 60umol/L、30 50umol/L的量添加生物素、纈氨酸和半胱氨酸。培養初始向含有樹脂的發酵液中按5 8ug/L的量添加生物素，發酵培養48h後分別按4 7mmol/L、4 7mmol/L、50 70umol/L的量添加乙酸鈉、甲基丙二酸和半胱氨酸。培養初始向含有樹脂的發酵液中按5 8ug/L的量添加生物素，發酵培養48h後分別按4 7mmol/L、0.3 3mmol/L、50 70umol/L的量添加乙酸鈉、丙酸鈉和半胱氨酸。所述的含有樹脂的發酵液中樹脂的添加量為15 30ml/L，添加的樹脂為大孔樹脂 XAD16。步驟I )、2)所述的搖床培養振蕩速度為150 180r/min ;步驟3)所述的過濾為採用20 60目鐵絲濾網夾篩過濾收集樹脂。所述的發酵液中含有酵母粉20 50g/L、玉米澱粉I 5g/L、磷酸二氫鈉I 2g/L、磷酸氫二鈉 I 2g/L、MgSO4.7H202 5g/L、FeSO4.7Η200.I 0.5g/L、CaCl22 5g/L、MnCl20.1 0.5g/L和葡萄糖10 15g/L，調節pH值為7.2 7.5。與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果:在抗生素生物合成過 程中，前體物起著非常重要的作用，在合適的條件下可以控制菌體合成次級代謝產物的方向並增加其產量，本發明基於埃博黴素B的合成代謝途徑，在發酵培養基中添加經篩選得到的前體物和/或與埃博黴素B合成途徑相關的小分子物質，從而對埃博黴素B的合成代謝途徑進行擾動，可以使優良菌株充分發揮其合成代謝產物的能力，大幅度提高埃博黴素B的發酵水平，從而降低發酵成本，且通過對前體物質和/或小分子物質添加量的控制，可以對埃博黴素的發酵代謝進行調控，本方法操作簡單，環境友好，推動了抗癌藥物的工業化生產。
具體實施例方式下面結合具體的實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。對比例:埃博黴素B的發酵生產方法，包括以下步驟:I)將纖維堆囊菌ATCC25531菌種接種於一瓶含有50ml M26培養基的250ml三角瓶中，在30°C、170r/min的條件下搖床培養72h後，得到作為發酵培養的種子液；其中，M26培養基組分為:土豆澱粉8.0g/L，大豆蛋白腖2.0g/L，葡萄糖2.0g/L，酵母粉2.0g/L,MgSO4.7Η201.0g/L, CaCl2L 0g/L，EDTA_Fe3+lmL/L，微量元素 lmL/L，以 KOH調節pH值為 7.2 ；2)將5ml種子液接種到50ml含有樹脂的發酵液中，發酵容器為250ml三角瓶，在30°C、170r/min搖床培養96h ;添加的樹脂為大孔樹脂XAD16，添加量為20ml/L ;其中，發酵培養基成分為:酵母粉20g/L、玉米澱粉5g/L、磷酸二氫鈉2g/L、磷酸氫二鈉2g/L、MgSO4.7H205g/L、FeSO4.7Η200.lg/L、CaCl25g/L、MnCl20.lg/L 和葡萄糖 10g/L，用 KOH 調節pH值為7.2 ；3)發酵結束後用30目鐵絲濾網夾篩過濾發酵液後收集樹脂，樹脂經蒸餾水洗滌三次再經甲醇振蕩浸提，所得浸提液烘乾後定容，進行高效液相色譜檢測，色譜條件為:色譜柱:YffG, C18,10 μ m, 250 X 4.6mm ;檢測波長:249nm ;流動相:甲醇:/Κ =65:35 (體積比);進樣體積:20 μ L ;流速:lml/min。測得埃博黴素B含量為32.7mg/L。實施例1基於埃博黴素B代謝途徑的發酵生產方法，包括以下步驟:I)將纖維堆囊菌ATCC25531菌種接種於一瓶含有50ml M26培養基的250ml三角瓶中，在30°C、170r/min的條件下搖床培養72h後，得到作為發酵培養的種子液；其中，M26培養基組分為:土豆澱粉8.0g/L，大豆蛋白腖2.0g/L，葡萄糖2.0g/L，酵母粉2.0g/L,MgSO4.7Η201.0g/L, CaCl2L 0g/L，EDTA_Fe3+lmL/L，微量元素 lmL/L，以 KOH調節pH值為 7.2 ；2)將5ml種子液接種到50ml含有樹脂的發酵液中，並在初始發酵液中按照I X 10_5 3X 10_5mOl/L的量添加亞鐵氰化鉀，發酵容器為250ml三角瓶，在30°C、170r/min搖床培養96h ;添加的樹脂為大孔樹脂XAD16，添加量為20ml/L ;其中，發酵培養基成分為:酵母粉20g/L、玉米澱粉5g/L、磷酸二氫鈉2g/L、磷酸氫二鈉2g/L、MgSO4.7H205g/L、FeSO4.7Η200.lg/L、CaCl25g/L、MnCl20.lg/L 和葡萄糖 10g/L，用 KOH 調節 pH 值為 7.2。3)發酵結束後用30目鐵絲濾網夾篩過濾發酵液後收集樹脂，樹脂經蒸餾水洗滌三次再經甲醇振蕩浸提，所得浸提液烘乾後定容進行高效液相色譜檢測，色譜條件為:色譜柱:YffG, C18,10 μ m, 250 X 4.6mm ;檢測波長:249nm ;流動相:甲醇:/Κ =65:35 (體積比);進樣體積:20 μ L ;流速:lml/min。結果顯示埃博黴素B的產量與對照組相比，提高了 9.8%。實施例2基於埃博黴素B代謝途徑的發酵生產方法，包括以下步驟:I)將纖維堆囊菌ATCC25531菌種接種於一瓶含有50ml M26培養基的250ml三角瓶中，在25°C、160r/min的條件下搖床培養`96h，得到作為發酵培養的種子液；其中M26培養基成分同實施例1 ;2)將5ml種子液接種到50ml含有樹脂的發酵液中，並在初始發酵液中分別按照3X10_5mOl/L和8ug/L的量添加亞鐵氰化鉀和生物素，發酵容器為250ml三角瓶，在25°C、160r/min條件下搖床培養72h ;添加的樹脂為大孔樹脂XAD16，添加量為20ml/L ;其中，發酵培養基成分為:酵母粉25g/L、玉米澱粉4g/L、磷酸二氫鈉2g/L、磷酸氫二鈉2g/L、MgSO4.7H203g/L、FeSO4.7Η200.2g/L、CaCl25g/L、MnCl20.lg/L 和葡萄糖 15g/L，用 KOH 調節pH值為7.3 ；3)發酵結束後用30目鐵絲濾網夾篩過濾發酵液後收集樹脂，樹脂經蒸餾水洗滌三次再經甲醇振蕩浸提，所得浸提液烘乾後定容，進行高效液相色譜檢測，色譜條件同實施例1，結果顯示埃博黴素B的產量與對照組相比，提高了 12.7%。實施例3I)將纖維堆囊菌ATCC25531菌種接種於一瓶含有50ml M26培養基的250ml三角瓶中，在30°C、160r/min的條件下搖床培養96h，得到作為發酵培養的種子液；其中M26培養基組分同實施例1 ;2)將7.5ml種子液接種到50ml含有樹脂的發酵培養基中，培養24h後向發酵液中按0.5mmol/L的量加入丙酸鈉，發酵容器為250ml三角瓶，在30°C、160r/min條件下搖床培養96h ;添加的樹脂為大孔樹脂XAD16，添加量為30ml/L;其中，發酵培養基成分為:酵母粉35g/L、玉米澱粉5g/L、磷酸二氫鈉lg/L、磷酸氫二鈉lg/L、MgSO4.7H205g/L、FeSO4.7Η200.lg/L、CaCl22g/L、MnCl20.3g/L 和葡萄糖 10g/L，用 KOH 調節 pH 值為 7.5 ；3)發酵結束後用30目鐵絲濾網夾篩過濾發酵液後收集樹脂，樹脂經蒸餾水洗滌三次再經甲醇振蕩浸提，所得浸提液烘乾後定容，進行高效液相色譜檢測，色譜條件同實施例1，結果顯示埃博黴素B的產量與對照組相比，提高了 12.1%。實施例4I)將纖維堆囊菌ATCC25531菌種接種於一瓶含有50ml M26培養基的250ml三角瓶中，在30°C、170r/min的條件下搖床培養72h，得到作為發酵培養的種子液；其中M26培養基成分同實施例1 ;2)將2.5ml種子液接種到50ml含有樹脂的發酵液中，在35°C、150r/min搖床培養96h，其中，在培養24h後向發酵液中按照0.25mmol/L和7mmol/L的量添加乙酸鈉和丙酸鈉，發酵容器為250ml三角瓶，添加的樹脂為大孔樹脂XAD16，添加量為20ml/L ;其中，發酵培養基成分為:酵母粉20g/L、玉米澱粉lg/L、磷酸二氫鈉2g/L、磷酸氫二鈉2g/L、MgSO4.7H203g/L、FeSO4.7Η200.4g/L、CaCl23g/L、MnCl20.5g/L 和葡萄糖 15g/L，用 KOH 調節pH值為7.2 ；3)發酵結束後用20目鐵絲濾網夾篩過濾發酵液後收集樹脂，樹脂經蒸餾水洗滌三次再經甲醇振蕩浸提，所得浸提液烘乾後定容，進行高效液相色譜檢測，色譜條件同實施例1，結果顯示埃博黴素B的產量與對照組相比，提高了 19.3%。實施例5I)將纖維堆囊菌ATCC25531菌種接種於一瓶含有50ml M26培養基的250ml三角瓶中，在35°C、150r/min的條件下搖床培養120h，得到作為發酵培養的種子液；其中M26培養基成分同實施例1所 用；2)將4.5ml種子液接種到50ml含有樹脂的發酵培養基中，在30°C、180r/min條件下搖床培養120h，其中，在培養72h後向發酵液中分別按2.5mmol/L和80umol/L的量加入丙酸鈉和半胱氨酸，發酵容器為250ml三角瓶，添加的樹脂為大孔樹脂XAD16，添加量為30ml/L ;其中，發酵培養基成分為:酵母粉50g/L、玉米澱粉2g/L、磷酸二氫鈉lg/L、磷酸氫二鈉 lg/L、MgSO4.7H205g/L、FeSO4.7Η200.lg/L、CaCl23g/L、MnCl20.3g/L 和葡萄糖 15g/L，用KOH調節pH值為7.5 ；3)發酵結束後用30目鐵絲濾網夾篩過濾發酵液後收集樹脂，樹脂經蒸餾水洗滌三次再經甲醇振蕩浸提，所得浸提液烘乾後定容，進行高效液相色譜檢測，色譜條件同實施例1，結果顯示埃博黴素B的產量與對照組相比，提高了 22.4%。實施例6I)將纖維堆囊菌ATCC25531菌種接種於一瓶含有50ml M26培養基的250ml三角瓶中，在30°C、170r/min的條件下搖床培養72h，得到作為發酵培養的種子液；其中M26培養基成分同實施例1 ;2)將5ml種子液接種到50ml含有樹脂的發酵液中，在35°C、150r/min搖床培養96h，其中，在培養24h後向發酵液中分別按照3mmol/L、0.25mmol/L和I 10ug/L的量添加乙酸鈉、丙酸鈉和生物素，發酵容器為250ml三角瓶，添加的樹脂為大孔樹脂XAD16，添加量為15ml/L ;其中，發酵培養基成分為:酵母粉20g/L、玉米澱粉lg/L、磷酸二氫鈉2g/L、磷酸氫二鈉 lg/L、MgSO4.7H202g/L、FeSO4.7Η200.5g/L、CaCl24g/L、MnCl20.2g/L 和葡萄糖 12g/L，用KOH調節pH值為7.2 ；3)發酵結束後用20目鐵絲濾網夾篩過濾發酵液後收集樹脂，樹脂經蒸餾水洗滌三次再經甲醇振蕩浸提，所得浸提液烘乾後定容，進行高效液相色譜檢測，色譜條件同實施例1，結果顯示埃博黴素B的產量比對照組提高了 26.8%。實施例7I)將纖維堆囊菌ATCC25531菌種接種於一瓶含有50ml M26培養基的250ml三角瓶中，在35°C、150r/min的條件下搖床培養120h，得到作為發酵培養的種子液；其中M26培養基成分同實施例1所用；2)將4.5ml種子液接種到50ml含有樹脂的發酵培養基中，在30°C、160r/min條件下搖床培養72h，其中，在培養24h後向發酵液中分別按40umol/L、60umol/L和50umol/L的量加入蘇氨酸、天冬氨酸和異亮氨酸；發酵容器為250ml三角瓶，添加的樹脂為大孔樹脂XAD16，添加量為30ml/L ;其中，發酵培養基成分為:酵母粉20g/L、玉米澱粉5g/L、磷酸二氫鈉 lg/L、磷酸氫二鈉 lg/L、MgSO4.7H204g/L、FeSO4.7Η200.lg/L、CaCl23g/L、MnCl20.3g/L和葡萄糖10g/L,用KOH調節pH值為7.5 ;3)發酵結束後用30目鐵絲濾網夾篩過濾發酵液後收集樹脂，樹脂經蒸餾水洗滌三次再經甲醇振蕩浸提，所得浸提液烘乾後定容，進行高效液相色譜檢測，色譜條件同實施例1，結果顯示埃博黴素B的產量與對照組相比，提高了 14.5%。實施例8I)將纖維堆囊菌ATCC25531菌種接種於一瓶含有50ml M26培養基的250ml三角瓶中，在30°C、170r min的條件下搖床培養72h，得到作為發酵培養的種子液；其中M26培養基成分同實施例1 ;2)將5ml種子液接種到50ml含有樹脂的發酵液中，在35°C、180r/min搖床培養120h，其中，在培養24h後向發酵液中分別按照2mmol/L和5mmol/L的量添加乙酸鈉和甲基丙二酸；發酵容器為250ml三角瓶，在35°C、180r/min搖床培養120h ;添加的樹脂為大孔樹脂XAD16，添加量為15ml/L ;其中，發酵培養基成分為:酵母粉30g/L、玉米澱粉5g/L、磷酸二氫鈉 2g/L、磷酸氫二鈉 lg/L,MgSO4 *7H205g/L,FeSO4.7Η200.4g/L、CaCl24g/L、MnCl20.2g/L和葡萄糖12g/L，用KOH調節pH值為7.5 ;3)發酵結束後用40目鐵絲濾網夾篩過濾發酵液後收集樹脂，樹脂經蒸餾水洗滌三次再經甲醇振蕩浸提，所得浸提液烘乾後定容，進行高效液相色譜檢測，色譜條件同實施例1，結果顯示埃博黴素B的產量比對照組提高了 27.1%。實施例9I)將纖維堆囊菌ATCC25531菌種接種於一瓶含有50ml M26培養基的250ml三角瓶中，在30°C、180r/min的條件下搖床培養120h，得到作為發酵培養的種子液；其中M26培養基成分同實施例1 ;2)將5ml種子液接種到50ml含有樹脂的發酵液中，在30°C、180r/min搖床培養120h,其中，在初始發酵液中添加6ug/L生物素,發酵培養48h後，按照4mmol/L、0.3mmol/L和60umol/L的量加入乙酸鈉、丙酸鈉和半胱氨酸；發酵容器為250ml三角瓶；添加的樹脂為大孔樹脂XAD16，添加量為20ml/L ;其中，發酵液成分為:酵母粉25g/L、玉米澱粉2g/L、磷酸二氫鈉 2g/L、磷酸氫二鈉 lg/L、MgSO4.7H202g/L、FeSO4.7Η200.5g/L、CaCl22g/L、MnCl20.2g/L和葡萄糖10g/L,用KOH調節pH值為7.3 ；3)發酵結束後用60目鐵絲濾網夾篩過濾發酵液後收集樹脂，樹脂經蒸餾水洗滌三次再經甲醇振蕩浸提，所得浸提液烘乾後定容，進行高效液相色譜檢測，色譜條件同實施例1，結果顯示埃博黴素B的產量比對照組提高了 31.9%。實施例10I)將纖維堆囊菌ATCC25531菌種接種於一瓶含有50ml M26培養基的250ml三角瓶中，在30°C、180r/min的條件下搖床培養120h，得到作為發酵培養的種子液；其中M26培養基成分同實施例1 ;2)將5ml種子液接種到50ml含有樹脂的發酵液中，在30°C、180r/min搖床培養120h,其中，在初始發酵液中添加5ug/L生物素,發酵培養48h後,按照5mmol/L、l.0mmol/L和50umol/L的量加入乙酸鈉、丙酸鈉和半胱氨酸；發酵容器為250ml三角瓶，添加的樹脂為大孔樹脂XAD16，添加量為20ml/L ;其中，發酵液成分同實施例9 ；3)發酵結束後用60目鐵絲 濾網夾篩過濾發酵液後收集樹脂，樹脂經蒸餾水洗滌三次再經甲醇振蕩浸提，所得浸提液烘乾後定容，進行高效液相色譜檢測，色譜條件同實施例1，結果顯示埃博黴素B的產量比對照組提高了 28.7%。實施例11I)將纖維堆囊菌ATCC25531菌種接種於一瓶含有50ml M26培養基的250ml三角瓶中，在30°C、180r/min的條件下搖床培養120h，得到作為發酵培養的種子液；其中M26培養基成分同實施例1。2)將5ml種子液接種到50ml含有樹脂的發酵液中，在30°C、180r/min搖床培養120h,其中，在初始發酵液中添加8ug/L生物素,發酵培養48h後,按照7mmol/L、3.0mmol/L和70umol/L的量加入乙酸鈉、丙酸鈉和半胱氨酸；發酵容器為250ml三角瓶，添加的樹脂為大孔樹脂XAD16，添加量為20ml/L ;其中，發酵液成分同實施例9 ；3)發酵結束後用60目鐵絲濾網夾篩過濾發酵液後收集樹脂，樹脂經蒸餾水洗滌三次再經甲醇振蕩浸提，所得浸提液烘乾後定容，進行高效液相色譜檢測，色譜條件同實施例1，結果顯示埃博黴素B的產量比對照組提高了 29.9%。實施例12I)將纖維堆囊菌ATCC25531菌種接種於一瓶含有50ml M26培養基的250ml三角瓶中，在25°C、180r/min的條件下搖床培養96h，得到作為發酵培養的種子液；其中M26培養基成分同實施例1 ;2)將6ml種子液接種到50ml含有樹脂的發酵液中，在初始發酵液中按照6ug/L、50umol/L,40umol/L量添加生物素、纈氨酸和半胱氨酸，發酵容器為250ml三角瓶，在25°C、180r/min搖床培養96h ;添加的樹脂為大孔樹脂XAD16，添加量為15ml/L ;其中，發酵液成分為:酵母粉50g/L、玉米澱粉lg/L、磷酸二氫鈉lg/L、磷酸氫二鈉lg/L、MgSO4.7H203g/L、FeSO4.7Η200.2g/L、CaCl25g/L、MnCl20.lg/L 和葡萄糖 12g/L，用 KOH 調節 pH 值為 7.3 ；3)發酵結束後用30目鐵絲濾網夾篩過濾發酵液後收集樹脂，樹脂經蒸餾水洗滌三次再經甲醇振蕩浸提，所得浸提液烘乾後定容，進行高效液相色譜檢測，色譜條件同實施例1，結果顯示埃博黴素B的產量比對照組提高了 31.6%。實施例13
I)將纖維堆囊菌ATCC25531菌種接種於一瓶含有50ml M26培養基的250ml三角瓶中，在25°C、180r/min的條件下搖床培養96h，得到作為發酵培養的種子液；其中M26培養基成分同實施例1 ;2)將6ml種子液接種到50ml含有樹脂的發酵液中，在初始發酵液中按照5ug/L、60umOl/L、30umOl/L量添加生物素、纈氨酸和半胱氨酸，發酵容器為250ml三角瓶，在25°C、180r/min搖床培養96h ;添加的樹脂為大孔樹脂XAD16，添加量為15ml/L，其中，發酵液成分同實施例12 ；3)發酵結束後用30目鐵絲濾網夾篩過濾發酵液後收集樹脂，樹脂經蒸餾水洗滌三次再經甲醇振蕩浸提，所得浸提液烘乾後定容，進行高效液相色譜檢測，色譜條件同實施例1，結果顯示埃博黴素B的產量比對照組提高了 30.2%。實施例14I)將纖維堆囊菌ATCC25531菌種接種於一瓶含有50ml M26培養基的250ml三角瓶中，在25°C、180r/min的條件下搖床培養96h，得到作為發酵培養的種子液；其中M26培養基成分同實施例1。2)將6ml種子液接種到50ml含有樹脂的發酵液中，在初始發酵液中按照8ug/L、40umOl/L、50umOl/L量添加生物素、纈氨酸和半胱氨酸，發酵容器為250ml三角瓶，在25°C、180r/min搖床培養96h ;添加的樹脂為大孔樹脂XAD16，添加量為15ml/L，其中，發酵液成分同實施例12 ；3)發酵結束後用30目鐵絲濾網夾篩過濾發酵液後收集樹脂，樹脂經蒸餾水洗滌三次再經甲醇振蕩浸提，所得浸提液烘乾後定容，進行高效液相色譜檢測，色譜條件同實施例1，結果顯示埃博黴素B的產量比對照組提高了 31.7%。實施例15·I)將纖維堆囊菌ATCC25531菌種接種於一瓶含有50ml M26培養基的250ml三角瓶中，在35°C、160r/min的條件下搖床培養96h，得到作為發酵培養的種子液；其中M26培養基成分同實施例1，2)將5ml種子液接種到50ml含有樹脂的發酵液中，在初始發酵液中，中按6ug/L、50UmOl/L、40UmOl/L的量加入生物素、蛋氨酸和半胱氨酸，發酵容器為250ml三角瓶，在30°C、170r/min搖床培養96h ;添加的樹脂為大孔樹脂XAD16，添加量為25ml/L ;其中，發酵液成分為:酵母粉30g/L、玉米澱粉4g/L、磷酸二氫鈉lg/L、磷酸氫二鈉2g/L、MgSO4.7H205g/L、FeSO4.7Η200.2g/L、CaCl25g/L、MnCl20.lg/L 和葡萄糖 15g/L，用 KOH 調節pH值為7.2 ；3)發酵結束後用30目鐵絲濾網夾篩過濾發酵液後收集樹脂，樹脂經蒸餾水洗滌三次再經甲醇振蕩浸提，所得浸提液烘乾後定容，進行高效液相色譜檢測，色譜條件同實施例1，結果顯示埃博黴素B的產量比對照組提高了 30.7%。實施例16I)將纖維堆囊菌ATCC25531菌種接種於一瓶含有50ml M26培養基的250ml三角瓶中，在35°C、160r/min的條件下搖床培養96h，得到作為發酵培養的種子液；其中M26培養基成分同實施例1，2)將5ml種子液接種到50ml含有樹脂的發酵液中，在初始發酵液中，中按5ug/L、60umOl/L、30umOl/L的量加入生物素、蛋氨酸和半胱氨酸，發酵容器為250ml三角瓶，在30°C、170r/min搖床培養96h ;添加的樹脂為大孔樹脂XAD16，添加量為25ml/L，其中，發酵液成分同實施例15 ；3)發酵結束後用30目鐵絲濾網夾篩過濾發酵液後收集樹脂，樹脂經蒸餾水洗滌三次再經甲醇振蕩浸提，所得浸提液烘乾後定容，進行高效液相色譜檢測，色譜條件同實施例1，結果顯示埃博黴素B的產量比對照組提高了 29.3%。實施例17I)將纖維堆囊菌ATCC25531菌種接種於一瓶含有50ml M26培養基的250ml三角瓶中，在35°C、160r/min的條件下搖床培養96h，得到作為發酵培養的種子液；其中M26培養基成分同實施例1，2)將5ml種子液接種到50ml含有樹脂的發酵液中，在初始發酵液中，中按8ug/L,40umol/L,50umol/L的量加入生物素、蛋氨酸和半胱氨酸，發酵容器為250ml三角瓶，在30°C、170r/min搖床培養96h ;添加的樹脂為大孔樹脂XAD16，添加量為25ml/L，其中，發酵液成分同實施例15 ；3)發酵結束後用30目鐵絲濾網夾篩過濾發酵液後收集樹脂，樹脂經蒸餾水洗滌三次再經甲醇振蕩浸提，所得浸提液烘乾後定容，進行高效液相色譜檢測，色譜條件同實施例1，結果顯示埃博黴素B的產量比對照組提高了 30.9%。實施例18I)將纖維堆囊菌ATCC25531菌種接種於一瓶含有50ml M26培養基的250ml三角瓶中，在30°C、170r/min的條件下搖床培養96h，得到作為發酵培養的種子液；其中M26培養基成分同實施例1 ;2)將6ml種子液接種到50ml含有樹脂的發酵液中，在30°C、170r/min搖床培養96h,其中，在初始發酵液中加入6ug/L生物素,發酵培養48h後，按照4mmol/L、6mmol/L和60umol/L的量加入乙酸鈉、甲基丙二酸和半胱氨酸；發酵容器為250ml三角瓶，添加的樹脂為大孔樹脂XAD16，添加量為20ml/L ;其中，發酵液成分為:酵母粉30g/L、玉米澱粉Ig/L、磷酸二氫鈉 lg/L、磷酸氫二鈉 lg/L、MgS04.7H203g/L、FeS04.7H200.2g/L、CaC123g/L、MnC120.2g/L和葡萄糖lOg/L,用KOH調節pH值為7.2 ；3)發酵結束後用50目鐵絲濾網夾篩過濾發酵液後收集樹脂，樹脂經蒸餾水洗滌三次再經甲醇振蕩浸提，所得浸提液烘乾後定容，進行高效液相色譜檢測，色譜條件同實施例1，結果顯示埃博黴素B的產量與對照組相比，提高了 32.3%。實施例19I)將纖維堆囊菌ATCC25531菌種接種於一瓶含有50ml M26培養基的250ml三角瓶中，在30°C、170r/min的條件下搖床培養96h，得到作為發酵培養的種子液；其中M26培養基成分同實施例1 ;2)將6ml種子液接種到50ml含有樹脂的發酵液中，在30°C、170r/min搖床培養96h,其中，在初始發酵液中加入5ug/L生物素,發酵培養48h後，按照5mmol/L、4mmol/L和50umol/L的量加入乙酸鈉、甲基丙二酸和半胱氨酸；發酵容器為250ml三角瓶，添加的樹脂為大孔樹脂XAD 16，添加量為20ml/L，發酵液成分同實施例18 ；3)發酵結束後用50目鐵絲濾網夾篩過濾發酵液後收集樹脂，樹脂經蒸餾水洗滌三次再經甲醇振蕩浸提，所得浸提液烘乾後定容，進行高效液相色譜檢測，色譜條件同實施例1，結果顯示埃博黴素B的產量與對照組相比，提高了 31.0%。實施例20I)將纖維堆囊菌ATCC25531菌種接種於一瓶含有50ml M26培養基的250ml三角瓶中，在30°C、170r/min的條件下搖床培養96h，得到作為發酵培養的種子液；其中M26培養基成分同實施例1 ;2)將6ml種子液接種到50ml含有樹脂的發酵液中，在30°C、170r/min搖床培養96h,其中，在初始發酵液中加入8ug/L生物素,發酵培養48h後，按照7mmol/L、7mmol/L和70umol/L的量加入乙酸鈉、甲基丙二酸和半胱氨酸；發酵容器為250ml三角瓶，添加的樹脂為大孔樹脂XAD16，添加量為20ml/L，發酵液成分同實施例18 ；3)發酵結束後用50目鐵絲濾網夾篩過濾發酵液後收集樹脂，樹脂經蒸餾水洗滌三次再經甲醇振蕩浸提，所得浸提液烘乾後定容，進行高效液相色譜檢測，色譜條件同實施例1，結果顯示埃博黴素B的產量與對照組相比，提高了 29.1%。埃博黴素B的內酯環是由3個乙酸單位、4個丙酸單位和一個噻唑環縮合形成的，而乙酸單元和丙酸單元分別是以丙二酸單醯輔酶A和甲基丙二酸單醯輔酶A為前體的，添加的纈氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸等胺基酸與甲基丙二酸單醯輔酶A的合成有關，亞鐵氰化鉀可以降低ATP含量，有利於解除ATP的反饋抑制作用，生物素是代謝途徑中有關酶的輔酶。因此添加的前體物質乙酸鈉，丙酸鈉，半胱氨酸和/或與埃博黴素合成途徑相關的小分子物質甲基丙二酸、胺基酸分子、亞鐵氰化鉀、生物素會大幅度提高埃博黴素B的產量，以降低生產成本。綜上，本發明通過在 發酵培養基中添加埃博黴素B合成相關的前體物和小分子物質，在很大程度上提高了埃博黴素B的產量，降低了生產成本，本發明的工藝可以進行發酵罐放大生產，為抗癌藥物的工業化生產奠定了實驗基礎。
權利要求
1.一種基於埃博黴素B代謝途徑的發酵生產方法，其特徵在於，包括以下步驟: 1)將纖維堆囊菌接種於M26培養基中，在25 35°C下搖床培養72 120h，得到種子液； 2)按IOOml接種5 15ml的比例，將種子液接種至含有樹脂的發酵液中，在25 35°C下搖床培養72 120h，在培養O 72h內向含有樹脂的發酵液中添加前體物和/或小分子物質，所述的前體物為乙酸鈉、丙酸鈉、半胱氨酸中的一種或幾種，小分子物質為甲基丙二酸、脂肪族類胺基酸、亞鐵氰化鉀、生物素中的一種或幾種； 3)將培養後的發酵液過濾，收集樹脂，樹脂經水洗滌後再經甲醇振蕩，得到含有埃博黴素B的浸提液。
2.根據權利要求1所述的一種基於埃博黴素B代謝途徑的發酵生產方法，其特徵在於，所述乙酸鈉、丙酸鈉、甲基丙二酸的用量為0.25 7mmol/L，半胱氨酸及脂肪族類胺基酸的用量為40 80umol/L，亞鐵氰化鉀的用量為1X10—5 3X10_5mol/L，生物素的用量為I 10ug/Lo
3.根據權利要求1或2所述的一種基於埃博黴素B代謝途徑的發酵生產方法，其特徵在於，所述的脂肪族類胺基酸為蛋氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸中的一種或幾種。
4.根據權利要求3所述的一種基於埃博黴素B代謝途徑的發酵生產方法，其特徵在於，在培養初始向含有樹脂的發酵液中分別按5 8ug/L、40 60umol/L、30 50umol/L的量添加生物素、蛋氨酸和半胱氨酸。
5.根據權利要求3所述的一種基於埃博黴素B代謝途徑的發酵生產方法，其特徵在於，在培養初始向含有 樹脂的發酵液中分別按5 8ug/L、40 60umol/L、30 50umol/L的量添加生物素、纈氨酸和半胱氨酸。
6.根據權利要求2所述的一種基於埃博黴素B代謝途徑的發酵生產方法，其特徵在於，在培養初始向含有樹脂的發酵液中按5 8ug/L的量添加生物素，發酵培養48h後分別按4 7mmol/L、4 7mmol/L、50 70umol/L的量添加乙酸鈉、甲基丙二酸和半胱氨酸。
7.根據權利要求2所述的一種基於埃博黴素B代謝途徑的發酵生產方法，其特徵在於，在培養初始向含有樹脂的發酵液中按5 8ug/L的量添加生物素，發酵培養48h後分別按4 7mmol/L、0.3 3mmol/L、50 70umol/L的量添加乙酸鈉、丙酸鈉和半胱氨酸。
8.根據權利要求1所述的一種基於埃博黴素B代謝途徑的發酵生產方法，其特徵在於，所述的含有樹脂的發酵液中樹脂的添加量為15 30ml/L，添加的樹脂為大孔樹脂XAD16。
9.根據權利要求1所述的一種基於埃博黴素B代謝途徑的發酵生產方法，其特徵在於，步驟I )、2)所述的搖床培養振蕩速度為150 180r/min ;步驟3)所述的過濾為採用20 60目鐵絲濾網夾篩過濾收集樹脂。
10.根據權利要求1所述的一種基於埃博黴素B代謝途徑的發酵生產方法，其特徵在於，所述的發酵液中含有酵母粉20 50g/L、玉米澱粉I 5g/L、磷酸二氫鈉I 2g/L、磷酸氫二鈉 I 2g/L、MgSO4.7H202 5g/L、FeSO4.7Η200.I 0.5g/L、CaCl22 5g/L、MnCl20.1 0.5g/L和葡萄糖10 15g/L，調節pH值為7.2 7.5。
全文摘要
本發明公開了一種基於埃博黴素B代謝途徑的發酵生產方法，屬於發酵工程技術領域，包括以下步驟1)將纖維堆囊菌接種於M26培養基中，搖床培養，得到種子液；2)將種子液接種至含有樹脂的發酵液中，在25～35℃下搖床培養72～120h，向含有樹脂的發酵液中添加前體物和小分子物質；3)將培養結束的發酵液過濾，收集樹脂，樹脂經水洗滌後再經甲醇振蕩浸提，得到含有埃博黴素B的浸提液。本發明在發酵液中添加經篩選得到的前體物和與合成途徑相關的小分子物質，對埃博黴素B的合成代謝途徑進行擾動，使優良菌株充分發揮其合成代謝產物的能力，大幅度提高埃博黴素B的發酵水平，從而降低發酵成本，推動了抗癌藥物的工業化生產。
文檔編號C12R1/01GK103243134SQ20131013034
公開日2013年8月14日 申請日期2013年4月15日 優先權日2013年4月15日
發明者龔國利, 王娜, 劉麗麗 申請人:陝西科技大學