羥基化續隨子二萜烷型衍生物的轉化方法及其在製備抗腫瘤藥物中的用途與流程

2023-05-23 02:15:36

本發明屬生物藥物領域，涉及續隨子二萜烷型化合物的轉化方法，具體涉及利用已知微生物對續隨子二萜醇及其衍生物進行微生物轉化，並進一步結合化學醯基化法，製備具有抗癌活性的續隨子二萜烷型衍生物。

背景技術：

現有技術公開了續隨子二萜烷型化合物屬於二萜骨架的天然產物，具有較明顯的抗腫瘤活性與抗腫瘤多藥耐藥性（mdr）。構效關係研究表明，其母核上取代基的差異能明顯改變該類化合物的抗腫瘤活性和mdr活性。

有研究從大戟科植物續隨子euphorbialathyrisl.中分離得到（tetrahedronletters,1971,18:1325-1328）續隨子二萜烷型化合物；隨後從其他植物中陸續分離得到多種續隨子二萜烷型衍生物，如從大戟科植物euphorbialagascae中分離得到5個具有誘導腫瘤細胞凋亡和抗腫瘤多藥耐藥性的續隨子二萜醇酯衍生物（plantamedica,2005,72:162-168）；此外對從植物中分離得到的續隨子二萜烷型衍生物的化學反應修飾，也得到一些抗腫瘤多藥耐藥性活性更好的衍生物（bioorganic&medicinalchemistry,2014,22:6392-6400）。為了發現活性更強的續隨子二萜衍生物，特別是對其結構中低活性碳位點的結構修飾產物，將對進一步研究該類化合物的構效關係有著重要的意義；該類二萜骨架中c-18和c-19位為低活性位點，難以用化學方法接上羥基，而羥基是此類化合物進一步合成修飾的良好起始基團。

微生物轉化是利用微生物生長過程中合成的特異酶完成特定生化反應。據報導，微生物在生長過程中可以合成多種酶，催化不同反應，例如氧化反應、還原反應、水解反應、脫氫反應、縮合反應和開環反應等，這類酶催化反應具有特異性和專屬性，相對於化學反應，在底物的非活性碳原子上進行反應更高效環保。

迄今為止尚未見有關續隨子二萜類化合物的微生物轉化研究的報導。因此，本申請的發明人擬利用微生物對續隨子二萜烷型化合物進行轉化研究，以期獲得一些難以用傳統化學合成製備的特異位點（尤其是c-8、c-18和c-19低活性碳位點）的轉化產物，並結合化學合成法，對微生物轉化產物進一步進行化學修飾。

技術實現要素：

本發明的目的是提供續隨子二萜烷型化合物非活性碳上進行結構改造的方法，尤其是製備具有生理活性、難以通過傳統化學法羥基化得到的續隨子二萜烷型類化合物的微生物轉化方法。

本發明使用拉曼被孢黴mortierellaramanniana分別對續隨子二萜醇(lathyrol)和7β-羥基續隨子二萜醇（7β-hydroxylathyrol）進行了微生物轉化或生物轉化組合化學醯化，獲得以下結構通式的續隨子烷型二萜衍生物：

經鑑定，所獲得的續隨子烷型二萜衍生物化合物為：

化合物118-羥基續隨子二萜醇：r1=r3=h,r2=oh

化合物27β,18-二羥基續隨子二萜醇：r1=r2=oh,r3=h

化合物319-羥基續隨子二萜醇：r1=r2=h,r3=oh

化合物418-煙醯氧基續隨子二萜醇：r1=r3=h,r2=

本發明中所述的微生物轉化法包括以下步驟：

（1）生產菌株為拉曼被孢黴mortierellaramanniana，該菌株在瓊脂培養基上生長良好，將生長在瓊脂培養基上的拉曼被孢黴菌絲劃線接種於馬鈴薯固體培養基上，在20-28°c的恆溫培養箱中培養3-7天，得到試管種；

其中，所述拉曼被孢黴mortierellaramanniana菌種微生物還包括其功能等同的變異體和突變體；

（2）將試管種中的菌絲接種到250ml的三角瓶中，每瓶含有50ml液體馬鈴薯培養基，培養溫度為25-28°c，轉速為130-180rpm，培養時間為24小時，獲得種子液；

（3）將種子液按2%~5%體積比接入新鮮馬鈴薯培養基，28°c，130-180rpm條件下培養24-72小時後，加入轉化底物續隨子二萜醇或7β-羥基續隨子二萜醇,在20-28°c、130-180rpm的條件下轉化培養72-240小時。本發明的一個實施例中，優選將拉曼被孢黴mortierellaramanniana種子液按1%-3%體積比接入馬鈴薯培養基，28℃培養12-48小時，再加入4mg/ml續隨子二萜醇或7β-羥基續隨子二萜醇的乙醇溶液；

（4）將發酵液用布氏漏鬥減壓過濾，獲得發酵濾液，按照1:1.5體積比用乙酸乙酯萃取3次，合併乙酸乙酯層，減壓蒸乾，發酵產物用矽膠柱層析法分離得到發酵產物18-羥基續隨子二萜醇衍生物(1和2)和發酵產物19-羥基續隨子二萜醇衍生物(3)；

其中，所述的液體培養基包括組分：200g馬鈴薯去皮，切成1立方釐米小丁，1l水微沸煎煮20分鐘，隨後用8層紗布趁熱過濾，放涼後用水將濾液補齊至1l，加入20g葡萄糖，攪拌溶解；分裝並經121°c高壓滅菌20分鐘後，放涼使用；

其中，所述的固體培養基包含組分：液體培養基加入1%瓊脂，加熱溶解並分裝，121°c高壓滅菌20分鐘後，放涼使用。

本發明中，對續隨子二萜醇經拉曼被孢黴mortierellaramanniana轉化所得的轉化產物18-羥基續隨子二萜醇(1)進一步進行化學煙醯化，得到18-煙醯氧基續隨子二萜醇(4)。

本發明中，所述的生物轉化組合化學醯化法，包括以下步驟：

製備18-煙醯氧基續隨子二萜醇(4)：將10-15mg的18-羥基續隨子二萜醇(1)溶於無水四氫呋喃，滴加1-2滴三乙胺，1-2mgdmap，磁力攪拌混合均勻，在冰浴條件下投入1個當量的煙醯氯鹽酸鹽，逐漸升至室溫，最後加熱回流反應10-15小時，加入碳酸氫鈉飽和溶液終止反應，用乙酸乙酯萃取5-7次，合併萃取液，加入適量的無水nahco3除水溶性成分後過濾，合併有機相。有機溶劑回收後用製備液相分離，流動相比例為60%甲醇-水，保留時間在35分鐘為18-煙醯氧基續隨子二萜醇(4)，保留時間在20分鐘為18-羥基續隨子二萜醇(1)。

本發明利用拉曼被孢黴mortierellaramanniana產生的羥化酶對續隨子二萜醇型化合物進行生物轉化，製備了羥基化續隨子二萜烷衍生物，其中c-18羥基衍生物產率高達40%。其中，利用該菌產生的羥基化酶對續隨子二萜醇的c-18和c-19位進行羥化反應，製備得到其羥基化產物1和3；利用該菌產生的羥基化酶對7β-羥基續隨子二萜醇進行羥化反應，製備得到其羥基化產物2。本發明對製備得到的轉化產物進一步進行單醯基化反應，得到c-18煙醯氧基取代產物(4)。本發明在該類二萜的c-18和c-19位引入羥基，增加了續隨子二萜醇的化學結構修飾位點，增加水溶性，提高了成藥性。更進一步，本發明製得的續隨子烷型化合物可製備抗腫瘤多藥耐藥性的藥物或藥物組合物，其中含有所述的化合物或其藥學上可接受的溶劑及藥學上可接受的載體。

具體實施方式

實施例1製備18-羥基續隨子二萜醇(1)和19-羥基續隨子二萜醇(3)

採用兩步活化法活化菌種，獲得的種子液以1%體積比接種於裝有250ml馬鈴薯培養基、體積為1l三角瓶中，28°c，180rpm條件下搖瓶培養48h，每瓶活化後的菌液加入5mg/ml續隨子二萜醇的乙醇溶液，終濃度為0.1mg/ml。同條件培養72h後，抽濾發酵液，濾液加乙酸乙酯萃取3次，合併後回收乙酸乙酯，得到發酵液提取物；

發酵液提取物用少量乙酸乙酯溶解，以矽膠（100目-200目）拌樣，上樣於裝有40~50g柱層析矽膠（200-300目）的矽膠柱內，用二氯甲烷-甲醇（20:1）洗脫，先後得到含底物續隨子二萜醇、19-羥基續隨子二萜醇(3)和18-羥基續隨子二萜醇(1)的流分，回收溶劑，用丙酮溶解殘渣，將樣品溶液點於矽膠薄層板上，以二氯甲烷-甲醇（10:1）上行法展開，取出晾乾溶劑後，噴以10%的硫酸-乙醇溶液，加熱顯色，樣品點在矽膠薄層板中為磚紅色-棕色斑點，其中轉化主產物18-羥基續隨子二萜醇(1)，rf值為0.4左右，產率40~45%；微量轉化產物19-羥基續隨子二萜醇(3)的rf值為0.5左右，產率2~5%；底物續隨子二萜醇的rf值為0.6左右。化合物1和3的nmr結構鑑定數據如表1所示。

實施例2製備7β,18-二羥基續隨子二萜醇(2)

採用兩步活化法活化菌種，獲得的種子液以1%體積比接種於裝有250ml馬鈴薯培養基、體積為1l三角瓶中，28°c，180rpm條件下搖瓶培養48h，每瓶活化後的菌液加入5mg/ml的7β-羥基續隨子二萜醇的乙醇溶液，終濃度為0.1mg/ml，同條件培養72h後，發酵液抽濾，濾液加乙酸乙酯萃取3次，合併後回收乙酸乙酯，得到發酵液提取物；

發酵液提取物用少量乙酸乙酯溶解，以矽膠（100-200目）拌樣，上樣裝有40~50g柱層析矽膠（200-300目）的矽膠柱內，用二氯甲烷-甲醇（20:1）洗脫，得到含7β,18-二羥基續隨子二萜醇(2)的流分，回收溶劑，用丙酮溶解殘渣，將樣品溶液點於矽膠薄層板上，以二氯甲烷-甲醇（10:1）上行法展開，取出晾乾溶劑後，噴以10%的硫酸-乙醇溶液，加熱顯色，7β,18-二羥基續隨子二萜醇(2)在矽膠薄層板中顯示一個磚紅色-棕色斑點，rf值為0.35左右；底物7β-羥基續隨子二萜醇rf值為0.6左右。化合物2的nmr結構鑑定數據如表1所示。

表1是轉化產物18-羥基續隨子二萜醇(1)、7β,18-二羥基續隨子二萜醇(2)和19-羥基續隨子二萜醇(3)的nmr數據(400mhz,cd3od)。

表1

實施例3製備18-煙醯氧基續隨子二萜醇（4）

取10mg乾燥無水的18-羥基大戟因子l3(1)於50ml圓底燒瓶內，加入10-15ml無水四氫呋喃，加入8ml三乙胺、微量4-二甲氨基吡啶（dmap），用磁力攪拌器攪拌溶解混合，冰浴條件下加入1個當量的煙醯氯鹽酸鹽，共同攪拌反應至室溫8小時，若反應未完成再回流加熱反應1~3小時；

檢測反應是否完成：用毛細管吸取少量反應液，點樣於矽膠薄層板，平行點樣18-羥基續隨子二萜醇，採用二氯甲烷-甲醇（20:1）上行法展開，完畢後取出晾乾，254nm紫外燈下檢視，反應完成的標誌是在反應液展開處，與18-羥基續隨子二萜醇相同位置（rf=0.3）沒有亮斑或僅有微弱亮斑，在rf=0.6左右處產生新的亮斑；

確定反應完成後，加入20ml飽和碳酸氫鈉淬滅，反應液用等體積乙酸乙酯萃取6~10次，合併乙酸乙酯層，回收溶劑得到殘渣。殘渣用少量甲醇溶解，經製備液相（流動相為60%甲醇:水），分離得到18-煙醯氧基續隨子二萜醇（4），其保留時間為35分鐘。

實施例418-煙醯氧基續隨子二萜醇（4）的抗腫瘤多藥耐藥活性測試

採用人乳腺癌細胞（mcf-7）及耐阿黴素人乳腺癌細胞（mcf-7/adm）外排羅丹明-123能力變化評價待測化合物的體外抗腫瘤多藥耐藥性（mdr）活性。mcf-7及mcf-7/adm細胞培養基為含有10%小牛血清的rpmi-1640培養基，在37℃、5%co2細胞培養箱培養至細胞密度為70~80%鋪滿。mcf-7及mcf-7/adm細胞經10%胰蛋白酶消化後，吹散製成單細胞懸液，計數後調整細胞濃度為105/ml，將細胞懸浮液加入1.5ml離心管，每管體積為500ml，再加入含不同藥物濃度的培養基500ml，每個濃度設置3個復孔，於37℃、5%co2孵育10min。實驗組含藥培養基藥物濃度分別為80μm、40μm、8μm(終濃度為40、20、和4μm)，陰性對照組加入含有dmso溶液的培養基。孵育10min後，實驗組與陰性對照組加入100μl羅丹明-123的pbs溶液（終濃度2.2μm），再置於37℃，含5%co2的細胞孵育箱內孵育20min；空白組加入等體積不含羅丹明-123的空白pbs溶液。孵育結束後，離心棄培養基，並用pbs清洗細胞2次。用200μmpbs緩衝液吹散細胞沉澱，mcf-7及mcf-7/adm細胞懸浮液樣品經流式細胞儀測得10000個細胞螢光值的均值greenb，逆轉程度far=（greenbmcf-7/adm實驗組/greenbmcf-7/adm陰性對照組）/（greenbmcf-7實驗組/greenbmcf-7陰性對照組）；

結果顯示，18-煙醯氧基續隨子二萜醇（4）與18-羥基續隨子二萜醇在40mm的far(40μm)分別為2.4和1.0，提高2.4倍，表明c-18煙醯氧基化，能提高續隨子二萜醇的抗腫瘤多藥耐藥活性。