一種基因重組核多角體病毒殺蟲劑的創製方法及應用的製作方法
2023-05-23 02:26:06 2
專利名稱：一種基因重組核多角體病毒殺蟲劑的創製方法及應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物工程技術領域，涉及生物工程技術領域中的DNA重組技術及應用，具體涉及一種基因重組核多角體病毒殺蟲劑的創製方法及應用。
背景技術：
中國是一個農業大國，為了保證農業高產，每年使用大量化學農藥防治害蟲，多數化學農藥對環境造成汙染，嚴重威脅著人類健康。進入WTO以後我國農業生產面對日趨激烈的國際競爭，大量使用有毒化學農藥致使農藥殘留超標，嚴重製約了農產品的出口。因此，減少有毒化學農藥的使用勢在必行，生物農藥是減少化學農藥使用量的有效途徑之一，其中，杆狀病毒殺蟲劑有著重要的應用前景。
與傳統的化學農藥相比，杆狀病毒殺蟲劑對宿主昆蟲具有高度的病原性，對非靶標生物十分安全，能夠在環境中長期存活，對人、畜及其它脊椎動物無害，不汙染環境，能和其他化學農藥混合使用，同時防效時間長，使用方便，所以早在1973年已被聯合國糧農組織和世界衛生組織推薦，作為化學農藥的理想替代品。到目前為止，已有多種杆狀病毒被開發為商品殺蟲劑。苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(AcNPV)屬於杆狀病毒科的核多角體病毒屬，與其它杆狀病毒相比，該病毒的主要優點是宿主範圍較寬，可以感染30多種鱗翅目昆蟲，但缺點是殺蟲速度慢。
隨著分子生物學技術的迅猛發展，現在已經有許多遺傳改良的方法來提高它的殺蟲活性，如利用AcMNPV的P10位點重組表達編碼食蟲蟎Pyemotes tritici(Tormalski MD，Miller L K，Insect paralysis by baculovirus-mediated expression of a mite neurotoxingene，Nature，1991，352(6330)82-85)的神經毒素基因和蘇雲金桿菌Bacillusthuringiensis的毒蛋白CryIA(b)(Sun X，Chen X，Zhang Z，et al.，Bollworm responsesto release of genetically modified Helicoverpa armigera nucleopolyhedroviruses incotton，J Invertebr Pathol，2002，81(2)63-69)。雖然這些方法在一定程度上改善了野生型AcNPV病毒殺蟲集的活性，但是，這些方法中使用的基因是食蟲蟎的神經毒素基因和蘇雲金桿菌的毒蛋白基因，對環境的安全性沒有得到肯定，人們需要找到更多環境安全的基因來改造野生型杆狀病毒殺蟲劑，例如，Harrison和Bonning將組織蛋白酶L基因重組到野生型AcMNPV中，改善了AcMNPV的殺蟲活性，取得了較好的效果殺蟲(Harrison RL，BonningBC.2001.Use of proteases to improve the insecticidal activity of baculoviruses.Biol Control.20199-209)，但是，開發更多更好的基因重組病毒殺蟲劑仍然需要大量工作。
我們在前期研究中克隆到了棉鈴蟲蛻皮調節轉錄因子激素接受子3(HHR3)(基因全序列已經提交GenBank，http://www.ncbi.nlm.nih，接受號AF271059；)和棉鈴蟲組織蛋白酶B基因(HCB)(基因全序列已經提交Genbank，http://www.ncbi.nlm.nih，接受號AF222788)。棉鈴蟲HHR3基因屬於甾醇類激素受體超家族和核受體超家族，該基因在蛻皮期間有短暫表達，在蛻皮激素誘導的信號級聯反應中發揮重要的作用(Zhao X F，Jang X J，XuY P，et al.，Recombinant expression and purification of inclusion bodies of themolt-regulating transcription factor-HHR3 from Helicoverpa armigera，Acta EntomolSenica，2004，47(3)281-286)。棉鈴蟲組織蛋白酶B基因在成蟲脂肪體降解和卵黃蛋白降解中發揮功能(Zhao X F，Wang J X，Xu X L，et al.，Molecular cloning and expressionpatterns of molt-regulating transcription factor-HHR3 from Helicoverpa armigera，Insect Mole Biol，2004，13(4)407-412)。本發明的思路是將棉鈴蟲的蛻皮激素接受子3基因和棉鈴蟲組織蛋白酶B基因重組到野生型AcMNPV病毒中，用這些昆蟲來源的功能基因通過調控害蟲的生長發育來增加野生型AcMNPV病毒的殺蟲能力，達到既提高病毒活力又對環境安全的目的；同時將綠色螢光蛋白基因(EGFP，Genbank，http://www.ncbi.nlm.nih，接受號DQ005470)重組到野生型AcMNPV病毒中，作為基因重組病毒的標記，以便在田間使用時跟蹤檢測病毒的分布和對天敵的影響；此外還將棉鈴蟲核多角體病毒的基因(HaPolh)(Genbank，http://www.ncbi.nlm.nih，接受號AF303045)重組到野生型AcMNPV病毒中，使該基因重組病毒殺蟲劑可以抵抗田間的紫外光和其它惡劣的自然環境，從而可以作為殺蟲劑在田間使用。
發明內容
針對現有技術的不足，本發明的目的是提供一種殺蟲效果好、可以在田間使用並可以被跟蹤的基因重組AcNPV病毒及其製備方法。
本發明將綠色螢光蛋白基因、昆蟲功能基因和多角體蛋白基因重組到缺失多角體蛋白基因的AcNPV上，創製具有綠色螢光蛋白標記的、有昆蟲功能基因插入的、具有多角體蛋白基因的AcNPV殺蟲劑。利用本發明可以創製各種基因重組病毒殺蟲劑，用於鱗翅目害蟲防治。
本發明提供一種基因重組核多角體病毒殺蟲劑，其特徵是，將綠色螢光蛋白基因、昆蟲功能基因和多角體蛋白基因重組到缺失多角體蛋白基因的AcNPV上。
優選的，所述綠色螢光蛋白基因為EGFP(Genbank，http://www.ncbi.nlm.nih，接受號DQ005470)；所述昆蟲功能基因為棉鈴蟲蛻皮調節轉錄因子激素接受子3(HHR3，http://www.ncbi.nlm.nih，接受號AF271059)和棉鈴蟲組織蛋白酶B基因(HCB，基因全序列已經提交Genbank，http://www.ncbi.nlm.nih，接受號AF222788)或其它有調控昆蟲生長發育的昆蟲功能基因，如棉鈴蟲幾丁質酶基因(http://www.ncbi.nlm.nih，接受號AF515667)，所述多角體蛋白基因為棉鈴蟲核多角體病毒的核多角體蛋白基因(HaPolh，Genbank，http://www.ncbi.nlm.nih，接受號AF303045)或其它多角體病毒的多角體蛋白基因，如AcNPV核多角體蛋白基因(AcPolh，Genbank，http://www.ncbi.nlm.nih，接受號K02700)，以及在上述基因的基礎上進行修飾或鹼基突變產生的基因。
本發明還提供一種基因重組核多角體病毒殺蟲劑的製備方法，包括如下步驟[1]針對插入AcNPV中的綠色螢光蛋白基因、有殺蟲活性的功能基因和核多角體病毒多角體蛋白基因，根據基因序列分別設計帶酶切位點的引物，用PCR方法分別擴增綠色螢光蛋白基因、功能基因和核多角體病毒多角體蛋白基因，[2]在大腸桿菌中擴增並提取供體質粒pFASTBAC；[3]用限制性內切酶SmaI和KpnI分別切開綠色螢光蛋白基因PCR產物和pFASTBAC質粒，將綠色螢光蛋白基因與質粒連接，形成帶有綠色螢光蛋白基因的pFASTBAC重組質粒；[4]用EcoRI和NotI切開功能基因和帶有綠色螢光蛋白基因的pFASTBAC質粒，將兩者連接起來；[5]用NotI切開核多角體蛋白基因和帶有綠色螢光蛋白基因和功能基因的pFASTBAC質粒，將二者連接起來，從而構建成功具有上述3種基因的重組pFASTBAC質粒；[6]將含有3種基因插入的重組pFASTBAC質粒轉入大腸桿菌DH10BAC菌株，將3種基因轉位到杆粒上，形成基因重組杆粒，用傳統的質粒提取方法純化基因重組杆粒；[7]將杆粒轉染昆蟲細胞(如Sf21，Sf9，或其它昆蟲細胞)，形成基因重組AcNPV病毒粒子；[8]用含有基因重組AcNPV病毒粒子的細胞培養液注射棉鈴蟲幼蟲，產生基因重組AcNPV病毒；其中，步驟[2]中所述的供體質粒是pFASTBAC質粒。
其中，步驟[1]中所述功能基因為任何有殺蟲功能的基因，優選棉鈴蟲激素接受子3基因(GenBank，accession number AF337637)。
其中，步驟[1]中所述綠色螢光蛋白是EGFP(GenBank，accession number DQ005470)其中，步驟[1]中所述多角體蛋白基因是任何核多角體病毒的多角體蛋白基因，優選棉鈴蟲核多角體病毒多角體蛋白基因(GenBank，accession number AF303045)。
其中，步驟[6]所述的杆粒是在AcNPV病毒的多角體基因處加入了轉位位點(mini-attTn7)的AcNPV病毒。
其中，步驟[7]中所述的昆蟲細胞是任何一種昆蟲細胞，優選Sf21細胞所述的一種基因重組核多角體病毒殺蟲劑的及應用，其特徵是所述的基因重組AcNPV病毒可以被生產並用於生產中害蟲防治。優選的，所述的基因重組AcNPV病毒可以用於生產中鱗翅目害蟲防治。
利用本發明的方法創製的基因重組AcNPV病毒，可以幹擾棉鈴蟲等鱗翅目害蟲的正常生長，降低害蟲生長速度，降低害蟲半數存活時間，具有多角體蛋白基因，較野生型AcNPV病毒有更好的殺蟲效果。
發明的方法創製的基因重組AcNPV病毒，可以幹擾棉鈴蟲的正常生長，降低棉鈴蟲和其他害蟲的生長速度，降低棉鈴蟲半數存活時間，具有多角體蛋白基因，較野生型AcNPV病毒有更好的殺蟲效果。
我們利用AcNPV做基因重組病毒殺蟲劑創製的親本病毒，插入棉鈴蟲HHR3和HCB基因，恢復多角體蛋白基因，同時用綠色螢光蛋白標記基因重組病毒，由此方法創製的基因重組AcNPV病毒對棉鈴蟲等鱗翅目害蟲有更好的殺蟲效果。因為許多農業和林業害蟲都屬於鱗翅目昆蟲，如菜青蟲、棉鈴蟲、煙夜蛾、甜菜夜蛾、斜紋夜蛾、小地老虎、玉米螟、水稻螟、松毛蟲等，因此，該基因重組病毒可以廣泛應用於鱗翅目害蟲控制。
該發明所使用的構建基因重組病毒的思路、HHR3基因和HCB基因及構建方法都是首次報導。
具體實施例方式
下面結合實驗，對利用本發明的方法得到的基因重組病毒殺蟲劑的作用作進一步的說明。
方法(1)針對綠色螢光蛋白基因、昆蟲功能基因(如HHR3基因、HCB基因或其它基因如棉鈴蟲幾丁質酶基因)和多角體蛋白基因3種插入基因，分別設計帶酶切位點的引物，用PCR方法分別擴增綠色螢光蛋白基因、棉鈴蟲激素接受子3基因和棉鈴蟲核多角體病毒多角體蛋白基因；在大腸桿菌中擴增並提取pFASTBAC質粒；用限制性內切酶SmaI和KpnI分別切開綠色螢光蛋白基因的PCR產物和pFASTBAC質粒，將綠色螢光蛋白基因與質粒連接，形成帶有綠色螢光蛋白基因的pFASTBAC質粒；在此基礎上，再以相同的方法，用EcoRI和NotI切開棉鈴蟲激素接受子3基因和帶有綠色螢光蛋白基因的pFASTBAC質粒，將兩者連接起來；再以相同的方法，用NotI切開核多角體蛋白基因和帶有綠色螢光蛋白基因和棉鈴蟲激素接受子3基因的pFASTBAC質粒，將二者連接起來，從而構建成功具有上述3種基因的供體pFASTBAC質粒。
方法(2)將方法(1)中得到的含有3種基因插入的供體質粒轉入大腸桿菌DH10BAC菌株，將上述3種基因轉位到杆粒上，形成基因重組杆粒，用傳統的質粒提取方法純化基因重組杆粒，將杆粒轉染Sf21細胞，形成基因重組AcNPV病毒粒子，將含有病毒的細胞培養液注射棉鈴蟲幼蟲，產生基因重組AcNPV病毒。
基因重組AcNPV病毒的殺蟲活性檢測用蘭色食用色素標記基因重組AcNPV病毒多角體，飼餵棉鈴蟲3齡幼蟲，病毒包含體濃度為5×107PV/ml，每40頭一組，設3個重複。每天記錄幼蟲的體重，觀察記錄幼蟲的形態變化，檢測蟲體中綠色螢光蛋白的表達情況，用野生型AcNPV病毒做對照，對實驗結果進行統計分析，計算幼蟲的半數存活時間和死亡率。結果顯示，基因重組AcNPV病毒較野生型病毒有更好的殺蟲效果，表現為不正常蛻皮，體重下降，半數存活時間降低。
以下實施例是對本發明的進一步說明，但本發明並不局限於此。
實施例1針對綠色螢光蛋白基因、昆蟲功能基因(如HHR3基因、HCB基因或其它基因)和多角體蛋白基因3種插入基因，根據基因序列分別設計和合成帶酶切位點的引物，用PCR方法分別擴增綠色螢光蛋白基因、棉鈴蟲激素接受子3基因和棉鈴蟲核多角體病毒多角體蛋白基因；在大腸桿菌中擴增並提取pFASTBAC質粒；用限制性內切酶SmaI和KpnI分別切開綠色螢光蛋白基因PCR產物和pFASTBAC質粒，將綠色螢光蛋白基因與質粒連接，形成帶有綠色螢光蛋白基因的pFASTBAC重組質粒；在此基礎上，再以相同的方法，用EcoRI和NotI切開棉鈴蟲激素接受子3基因和帶有綠色螢光蛋白基因的pFASTBAC質粒，將兩者連接起來；再以相同的方法，用NotI切開核多角體蛋白基因和帶有綠色螢光蛋白基因和棉鈴蟲激素接受子3基因pFASTBAC質粒，將二者連接起來，從而構建成功具有上述3種基因的重組pFASTBAC質粒。
將含有上述3種基因插入的重組pFASTBAC質粒轉入大腸桿菌DH10BAC菌株，將3種基因轉位到杆粒上，形成基因重組杆粒，用傳統的質粒提取方法純化基因重組杆粒，將杆粒轉染Sf21細胞，形成基因重組AcNPV病毒粒子，將含有病毒的細胞培養液注射棉鈴蟲幼蟲，產生基因重組AcNPV病毒。
用蘭色食用色素標記基因重組AcNPV病毒多角體，飼餵棉鈴蟲3齡幼蟲，病毒包含體濃度為5×107PV/ml，每40頭一組，設3個重複。每天記錄幼蟲的體重，觀察記錄幼蟲的形態變化，檢測蟲體中綠色螢光蛋白的表達情況，用野生型AcNPV病毒做對照，對實驗結果進行統計分析，計算幼蟲的半數存活時間和死亡率。結果顯示，基因重組AcNPV病毒較野生型病毒有更好的殺蟲效果，表現為不正常蛻皮，體重下降，半數存活時間降低。用該基因重組AcNPV病毒開發殺蟲劑。
表1用HCH基因構建的基因重組AcNPV病毒對棉鈴蟲半數存活時間的影響
使用的病毒濃度為每毫升生理鹽中3×107個病毒包含體。表中a和b表示野生型病毒和基因重組病毒的殺蟲效果有顯著差異，野生型AcMNPV病毒的半數存活時間是112小時，基因重組病毒AcMNPV-GFP-HCB-Polh的半數存活時間是96小時。
實施例2將實施例1中的棉鈴蟲激素接受子3基因換成其它功能基因如棉鈴蟲幾丁質酶基因(http://www.ncbi.nlm.nih，接受號AF515667)，針對不同的插入基因，分別設計帶酶切位點的引物，用PCR方法分別擴增綠色螢光蛋白基因、其它基因和棉鈴蟲核多角體病毒多角體蛋白基因；在大腸桿菌中擴增並提取pFASTBAC質粒；用限制性內切酶SmaI和KpnI分別切開綠色螢光蛋白基因PCR產物和pFASTBAC質粒，將綠色螢光蛋白基因與質粒連接，形成帶有綠色螢光蛋白基因的pFASTBAC重組質粒；在此基礎上，再以相同的方法，用EcoRI和NotI切開其它功能基因和帶有綠色螢光蛋白基因的pFASTBAC質粒，將兩者連接起來；再以相同的方法，用NotI切開核多角體蛋白基因和帶有綠色螢光蛋白基因和其它功能基因的pFASTBAC質粒，將二者連接起來，從而構建成功具有上述基因的重組pFASTBAC質粒。
將含有基因插入的重組pFASTBAC質粒轉入大腸桿菌DH10BAC菌株，將基因轉位到杆粒上，形成基因重組杆粒，用傳統的質粒提取方法純化基因重組杆粒，將杆粒轉染Sf21細胞，形成基因重組AcNPV病毒粒子，將含有病毒的細胞培養液注射棉鈴蟲幼蟲，產生基因重組AcNPV病毒。
用蘭色食用色素標記基因重組AcNPV病毒多角體，飼餵棉鈴蟲3齡幼蟲，病毒包含體濃度為5×107PV/ml，每40頭一組，設3個重複。每天記錄幼蟲的體重，觀察記錄幼蟲的形態變化，檢測蟲體中綠色螢光蛋白的表達情況，用野生型AcNPV病毒做對照，對實驗結果進行統計分析，計算幼蟲的半數存活時間和死亡率。結果顯示，基因重組AcNPV病毒較野生型病毒有更好的殺蟲效果，表現為不正常蛻皮，體重下降，半數存活時間降低。用該基因重組AcNPV病毒開發殺蟲劑。殺蟲效果與表1接近。
實施例3將實施例1和2中的棉鈴蟲核多角體病毒多角體蛋白基因換成其它多角體病毒的核多角體蛋白基因，如AcPolh(Genbank，http://www.ncbi.nlm.nih，接受號K02700)或BmPolh，針對插入基因，分別設計帶酶切位點的引物，用PCR方法分別擴增綠色螢光蛋白基因、其它功能基因和其它核多角體病毒多角體蛋白基因；在大腸桿菌中擴增並提取pFASTBAC質粒；用限制性內切酶SmaI和KpnI分別切開綠色螢光蛋白基因PCR產物和pFASTBAC質粒，將綠色螢光蛋白基因與質粒連接，形成帶有綠色螢光蛋白基因的pFASTBAC重組質粒；在此基礎上，再以相同的方法，用EcoRI和NotI切開其它基因和帶有綠色螢光蛋白基因的pFASTBAC質粒，將兩者連接起來；再以相同的方法，用NotI切開核多角體蛋白基因和帶有綠色螢光蛋白基因和其它功能基因的pFASTBAC質粒，將二者連接起來，從而構建成功具有上述基因的重組pFASTBAC質粒。
將含有基因插入的重組pFASTBAC質粒轉入大腸桿菌DH10BAC菌株，將基因轉位到杆粒上，形成基因重組杆粒，用傳統的質粒提取方法純化基因重組杆粒，將杆粒轉染Sf21細胞，形成基因重組AcNPV病毒粒子，將含有病毒的細胞培養液注射棉鈴蟲幼蟲，產生基因重組AcNPV病毒。
用蘭色食用色素標記基因重組AcNPV病毒多角體，飼餵棉鈴蟲3齡幼蟲，病毒包含體濃度為5×107PV/ml，每40頭一組，設3個重複。每天記錄幼蟲的體重，觀察記錄幼蟲的形態變化，檢測蟲體中綠色螢光蛋白的表達情況，用野生型AcNPV病毒做對照，對實驗結果進行統計分析，計算幼蟲的半數存活時間和死亡率。結果顯示，基因重組AcNPV病毒較野生型病毒有更好的殺蟲效果，表現為不正常蛻皮，體重下降，半數存活時間降低。用該基因重組AcNPV病毒開發殺蟲劑。殺蟲效果與表1接近。
實施例4在實施例1、2和3中，不插入綠色螢光蛋白基因，針對其它功能基因和其它核多角體蛋白基因，分別設計帶酶切位點的引物，用PCR方法分別擴增其它功能基因和其它核多角體病毒多角體蛋白基因；在大腸桿菌中擴增並提取pFASTBAC質粒；用限制性內切酶EcoRI和NotI切開其它功能基因和pFASTBAC質粒，將兩者連接起來；再以相同的方法，用NotI切開其它核多角體蛋白基因和帶有其它功能基因的pFASTBAC質粒，將二者連接起來，從而構建成功具有2種插入基因的重組pFASTBAC質粒。
將含有2種基因插入的重組pFASTBAC質粒轉入大腸桿菌DH10BAC菌株，將2種基因轉位到杆粒上，形成基因重組杆粒，用傳統的質粒提取方法純化基因重組杆粒，將杆粒轉染Sf21細胞，形成基因重組AcNPV病毒粒子，將含有病毒的細胞培養液注射棉鈴蟲幼蟲，產生基因重組AcNPV病毒。
用蘭色食用色素標記基因重組AcNPV病毒多角體，飼餵棉鈴蟲3齡幼蟲，病毒包含體濃度為5×107PV/ml，每40頭一組，設3個重複。每天記錄幼蟲的體重，觀察記錄幼蟲的形態變化，用野生型AcNPV病毒做對照，對實驗結果進行統計分析，計算幼蟲的半數存活時間和死亡率。結果顯示，基因重組AcNPV病毒較野生型病毒有更好的殺蟲效果，表現為不正常蛻皮，體重下降，半數存活時間降低。用該基因重組AcNPV病毒開發殺蟲劑。殺蟲效果與表1接近。
實施例5在實施例1、2、3和4的基礎上，用蘭色食用色素標記基因重組AcNPV病毒多角體，飼餵其它鱗翅目幼蟲，如甜菜夜蛾、菜青蟲、煙夜蛾、斜紋夜蛾、小地老虎、玉米螟、水稻螟、松毛蟲等，病毒包含體濃度為5×107PV/ml，每40頭一組，設3個重複。每天記錄幼蟲的體重，觀察記錄幼蟲的形態變化，用野生型AcNPV病毒做對照，對實驗結果進行統計分析，計算幼蟲的半數存活時間和死亡率。結果顯示，基因重組AcNPV病毒較野生型病毒有更好的殺蟲效果，表現為不正常蛻皮，體重下降，半數存活時間降低。用該基因重組AcNPV病毒開發殺蟲劑。
表2用HCH基因構建的基因重組AcNPV病毒對甜菜夜蛾的半數存活時間的影響
使用的病毒濃度為每毫升生理鹽中3×107個病毒包含體。表中a和b表示野生型病毒和基因重組病毒的殺蟲效果有顯著差異，野生型AcMNPV病毒的半數存活時間是112小時，基因重組病毒AcMNPV-GFP-HCB-Polh的半數存活時間是96小時。
權利要求
1.一種基因重組核多角體病毒殺蟲劑，其特徵是，綠色螢光蛋白基因、昆蟲功能基因和多角體蛋白基因重組到缺失多角體蛋白基因的AcNPV上。
2.一種如權利要求1所述的基因重組核多角體病毒殺蟲劑，其特徵是，所述綠色螢光蛋白基因為EGFP；所述昆蟲功能基因為棉鈴蟲蛻皮調節轉錄因子激素接受子3、棉鈴蟲組織蛋白酶B基因或棉鈴蟲幾丁質酶基因；所述多角體蛋白基因為棉鈴蟲核多角體病毒的核多角體蛋白基因或AcNPV核多角體蛋白基因、以及在上述基因的基礎上進行修飾或鹼基突變產生的基因。
3.一種如權利要求1或2所述的基因重組核多角體病毒殺蟲劑的製備方法，包括下述步驟[1]針對插入AcNPV中的綠色螢光蛋白基因、有殺蟲活性的功能基因和核多角體病毒多角體蛋白基因，根據基因序列分別設計帶酶切位點的引物，用PCR方法分別擴增綠色螢光蛋白基因、功能基因和核多角體病毒多角體蛋白基因，[2]在大腸桿菌中擴增並提取供體質粒pFASTBAC；[3]用限制性內切酶SmaI和KpnI分別切開綠色螢光蛋白基因PCR產物和pFASTBAC質粒，將綠色螢光蛋白基因與質粒連接，形成帶有綠色螢光蛋白基因的pFASTBAC重組質粒；[4]用EcoRI和NotI切開功能基因和帶有綠色螢光蛋白基因的pFASTBAC質粒，將兩者連接起來；[5]用NotI切開核多角體蛋白基因和帶有綠色螢光蛋白基因和功能基因的pFASTBAC質粒，將二者連接起來，從而構建成功具有上述3種基因的重組pFASTBAC質粒；[6]將含有3種基因插入的重組pFASTBAC質粒轉入大腸桿菌DH10BAC菌株，將3種基因轉位到杆粒上，形成基因重組杆粒，用傳統的質粒提取方法純化基因重組杆粒；[7]將杆粒轉染昆蟲細胞(如Sf21，Sf9，或其它昆蟲細胞)，形成基因重組AcNPV病毒粒子；[8]用含有基因重組AcNPV病毒粒子的細胞培養液注射棉鈴蟲幼蟲，產生基因重組AcNPV病毒。
4.如權利要求3所述的一種基因重組核多角體病毒殺蟲劑的製備方法，其特徵是步驟[2]中所述供體質粒是pFASTBAC質粒。
5.如權利要求3所述的一種基因重組核多角體病毒殺蟲劑的製備方法，其特徵是步驟[1]中所述有殺蟲活性的功能基因為棉鈴蟲激素接受子3基因。
6.如權利要求3所述的一種基因重組核多角體病毒殺蟲劑的製備方法，其特徵是步驟[1]中所述綠色螢光蛋白是EGFP。
7.如權利要求3所述的一種基因重組核多角體病毒殺蟲劑的製備方法，其特徵是步驟[1]中所述的多角體蛋白基因是棉鈴蟲核多角體病毒多角體蛋白基因。
8.如權利要求3所述的一種基因重組核多角體病毒殺蟲劑的創製方法及應用，其特徵是步驟[7]中所述昆蟲細胞是Sf21細胞。
9.如權利要求1或2所述的一種基因重組核多角體病毒殺蟲劑的及應用，其特徵是所述的基因重組AcNPV病毒可以被生產並用於生產中害蟲防治。
10.如權利要求1或2所述的一種基因重組核多角體病毒殺蟲劑的應用，其特徵是，所述的基因重組AcNPV病毒可以用於生產中鱗翅目害蟲防治。
全文摘要
本發明公開了一種基因重組核多角體病毒殺蟲劑及其製備方法的方法，包括構建綠色螢光蛋白供體質粒、將外源基因插入供體質粒、還原多角體蛋白基因、將綠色螢光蛋白及外源基因和多角體蛋白基因轉入核多角體病毒、轉染昆蟲細胞、在蟲體擴增病毒、收集和儲存病毒等步驟。利用本發明的方法創製的基因重組病毒較野生型病毒對棉鈴蟲等鱗翅目害蟲有更好的控制效果，可用於開發高殺蟲活性的生物殺蟲劑用於鱗翅目害蟲控制。
文檔編號A01P7/04GK1926991SQ20061006897
公開日2007年3月14日 申請日期2006年9月29日 優先權日2006年9月29日
發明者趙小凡, 王金星 申請人:山東大學