一種體細胞克隆哺乳動物的製備方法
2023-05-23 05:05:06 1
專利名稱：一種體細胞克隆哺乳動物的製備方法
技術領域：
本發明涉及對哺乳動物進行克隆的方法，更具體地，涉及用體細胞來克隆哺乳動物的方法。本發明還涉及製備用於哺乳動物克隆的重構卵的方法。
哺乳動物細胞核移植，不僅在胚胎生物學研究中是一種很重要的工具，而且對「優良」胚胎(家畜)的擴繁也是一種較好的方法。
在哺乳動物中，已應用早期的胚胎分裂球或胚胎來源的培養細胞(胚胎幹細胞，簡稱為「ES細胞」)來提供細胞核，獲得了相應的克隆動物綿羊(使用8-16細胞)[Willadsen S.M.,et al,Nature,1986]；兔(使用8-細胞)[Stice S.L.,et al,Bio.Reprod.,1989]；豬(使用2-8細胞)[Prather R.S.,et al.Biol.Reprod.,1989]；牛(使用2-32細胞)[Prather R.S.,et al.J.Anim.Sci.,1987，]；山羊(使用8-細胞)[張湧，「國外畜牧-草食家畜分冊」，1993]；小鼠(使用ES-細胞)[Tsunda Y.,et al.Journal ofReproduction and Fertility.,1993]。
近年來，使用體細胞來提供細胞核，也已在一些哺乳動物中成功獲得了克隆動物。1997年，Willmult等人應用乳腺上皮細胞進行核移植產生了綿羊多利[Willmut I.,et al.,Nature.1997]。隨後，又獲得了不同類型的體細胞克隆動物(1)胎兒成纖維細胞核移植綿羊[Schnieke A.E.,et al.,Science,1997]，(2)胎兒成纖維細胞核移植牛[Gibelli J.B.,et al.IBID,1998]，(3)輸卵管上皮細胞核移植牛等。以上核移植動物均是應用細胞融合的方法製備的。
此外，1988年Wakayama T等人利用小鼠的另一種體細胞-即卵丘細胞，先將該體細胞的細胞質去除，然後將細胞核直接注射到去核的鼠卵細胞細胞胞質內，產生了核移植小鼠[Wakayama T.,et al.,Nature,1988]。
然而，所述產生體細胞克隆動物的方法所涉及到的步驟仍很繁多，因此本領域迫切需要步驟更少、效率更高的克隆動物的方法。
本發明的目的就是提供一種步驟更少，效率更高的用體細胞克隆哺乳動物的方法。在該方法中，不對體細胞進行去除細胞質的處理，而是將體細胞直接注射到去核的卵母細胞中，並省去了細胞融合步驟。
本發明的另一目的是提供一種新的獲得用於製備體細胞克隆哺乳動物的重構卵的方法。在該方法中，不對體細胞進行去除細胞質的處理，而是將體細胞直接注射到去核的卵母細胞中，並省去了細胞融合步驟。
在本發明的第一方面，提供了一種體細胞克隆哺乳動物的製備方法，該方法包括以下步驟提供去核的哺乳動物供質卵母細胞和用於供核的哺乳動物體細胞；用顯微注射法，將用於供核的哺乳動物體細胞直接注射入所述的去核供質卵母細胞，形成重構卵；對所述的重構卵進行激活處理，形成激活的重構卵；將所述的激活的重構卵移植到寄母動物的輸卵管中，或者將所述的激活的重構卵在體外或體內進行培養，形成重構胚，然後再將重構胚移植到寄母動物的子宮內；飼養所述的寄母動物，產生體細胞克隆的哺乳動物。
在本發明的另一方面，提供了一種獲得用於製備體細胞克隆哺乳動物的重構卵的方法，該方法包括以下步驟提供去核的哺乳動物供質卵母細胞和用於供核的哺乳動物體細胞；用顯微注射法，將用於供核的哺乳動物體細胞直接注射入所述的去核供質卵母細胞，形成重構卵；對所述的重構卵進行激活處理，形成激活的重構卵。
本發明的方法與現有技術相比，其發明點在於省去了對體細胞去除細胞質的處理步驟，而是將體細胞直接注射到去核的卵母細胞中，並省去了細胞融合步驟。由於省去了這些步驟，因此導致克隆哺乳動物的方法或產生重構卵的方法更加簡易，效率更高。
在說明書附圖中，
圖1顯示了現有技術中產生體細胞克隆哺乳動物的方法。
圖2顯示了本發明的產生體細胞克隆哺乳動物的方法。
圖3顯示了在本發明方法中通過手術衝卵而獲得哺乳動物卵母細胞。
圖4顯示了在本發明方法中進行顯微操作的照片。
圖5A-D顯示了對哺乳動物(羊)卵母細胞進行去核操作，以及將體細胞顯微注射到去核卵母細胞。其中，圖5A是在去核前的卵母細胞；圖5B是去核過程中的卵母細胞；圖5C是將體細胞注射到去核卵母細胞之前(移核之前)；圖5D是將體細胞注射到去核卵母細胞之後(移核之後)。
圖6顯示了由體細胞克隆發育而成早期胚胎。
圖7A和7B分別了顯示了貼壁生長的羊乳腺上皮細胞(放大200倍)和懸浮的乳腺上皮細胞(放大200倍)。
圖8顯示了本發明一實例中產生體細胞克隆羊的流程圖。
現參見
圖1，圖中顯示了現有技術中產生體細胞克隆哺乳動物的方法。該方法包括以下步驟(1)獲得提供細胞質的卵母細胞(簡稱為「供質卵母細胞」)。
一般地，獲得供質卵母細胞可由以下兩種方法獲得。一是從卵巢卵泡上取出未成熟卵母細胞，並在體外成熟；一是供細胞質的哺乳動物經超數排卵誘導後，從其輸卵管內衝出中Ⅱ期卵母細胞。這些獲得供質卵母細胞的方法都是本領域的常規技術。
(2)獲得供核細胞(即提供細胞核的細胞)一般地，獲得供核細胞可採用成年動物的體組織(如皮膚)、未期體細胞(如顆粒細胞)等，將有關組織剪碎和消化後，分散成單個體細胞，然後在體外培養，形成細胞系。也可直接消化成單個體細胞。
(3)卵母細胞的去核一般，將卵母細胞的核遺傳物質在顯微鏡下應用去核針機械去除，從而獲得去核的卵母細胞。
(4)移核現有技術中的移核過程通常有兩種方式。第一種是將含細胞質的體細胞移入卵周隙中，然後將注入卵周隙的體細胞和卵母細胞在融合液內通過電刺激而發生融合，形成融合式的移核卵(重構卵)。第二種是先將體細胞的細胞質去除，再把體細胞核(不含或含少量胞質)直接注入去核卵母細胞的胞質內，形成注射式的移核卵(重構卵)。
(5)激活對步驟(4)中形成的重構卵，通過電刺激法或化學法加以激活，形成被激活的重構卵。
(6)體內或體外培養，或者直接移植為了觀察重構胚的發育情況，對於步驟(5)中形成的被激活的重構卵，可以將其移入輸卵管而在體內進行短暫培養，或者利用飼養細胞(feeder cell)(例如輸卵管上皮細胞)進行體外培養。然後，將發育的胚胎移入寄母動物(受體)的子宮中。
此外，對於步驟(5)中形成的被激活的重構卵，也可將其直接移入寄母動物(受體)的輸卵管內，待其妊娠產仔。
(7)飼養妊娠的寄母動物對妊娠的寄母動物小心飼養，以產生體細胞克隆動物。對生出的動物通過DNA指紋分析來驗證。
現參見圖2，圖中顯示了本發明的產生體細胞克隆哺乳動物的方法。本發明方法包括以下步驟(1)獲得供質卵母細胞該步驟可與上述的現有技術的步驟(1)相同。較佳地，供質卵母細胞是通過母畜的超數排卵而獲得的。本領域常規的製備供質卵母細胞的方法都可適用於本發明。
(2)獲得供核體細胞該步驟可與上述的現有技術的步驟(2)相同。本領域常規的製備供核體細胞的方法都可適用於本發明。
(3)卵母細胞的去核該步驟可與上述的現有技術的步驟(2)相同。本領域常規的去核方法都可適用於本發明。
(4)移核在該步驟中，將步驟(2)中的供核體細胞直接用顯微注射法而注入去核的卵母細胞中，形成重構卵。即在本發明方法中，不必對體細胞去除胞質，也不必先將體細胞移入卵周隙中再進行融合處理。
(5)激活對步驟(4)中形成的重構卵，通過電刺激法或化學法加以激活，形成被激活的重構卵。本領域中的常規的激活處理方法都可用於本發明。通常，對重構卵的激活處理可用電刺激和/或化學刺激法進行。較佳地，在本發明中對重構卵的激活處理選自下組(ⅰ)重構卵在0.2-0.4M甘露醇，3-5mg／ml的胎牛血清，0.08-0.12mM MgSO4的激活液中，進行1-3次電刺激，電壓為600-800V/cm，每次電刺激持續20-80μs；(ⅱ)重構卵在0.2-0.4M甘露醇，3-5mg／ml的胎牛血清，0.08-0.12mM MgSO4的激活液中，進行1-3次電刺激，電壓為600-800V/cm，每次電刺激持續20-80μs，然後再如下進行化學法激活即在5-20μM離子黴素中激活5分鐘，並在1-5μM 6-DMAP(6-dimethylaminopurine，即6-二甲基氨基嘌呤)激活1-6小時。
(6)體內或體外培養，或者直接移植該步驟可與上述的現有技術的步驟(6)相同。本領域常規的對重構卵進行體內或體外培養，或者直接移植的方法，都可適用於本發明。
(7)飼養妊娠的寄母動物該步驟可與上述的現有技術的步驟(7)相同。本領域常規的飼養妊娠寄母動物的方法以及檢驗體細胞克隆動物的方法，都可適用於本發明。
通過上述的比較可以看出，本發明的方法與現有技術相比，省去了對體細胞去除細胞質的處理步驟，而是將體細胞直接注射到去核的卵母細胞中，並省去了細胞融合步驟。由於省去了這些步驟，因此導致克隆哺乳動物的方法或產生重構卵的方法更加簡易，效率更高。
本發明方法可適用於各種哺乳動物，較佳地該哺乳動物是非人的哺乳動物。可用於本發明方法的哺乳動物的例子包括(但並不限於)羊、牛、豬、馬、狗、貓、老虎、猴、兔、小鼠和大鼠。此外，人也可作為一種適用於本發明方法的哺乳動物。
適用於本發明方法的體細胞包括各種已分化的體細胞，例如來自各種組織(如皮膚、乳腺、輸卵管、肌肉等)和器官(如耳、卵巢等)的細胞。可用於本發明方法的體細胞的例子包括(但並不限於)皮膚細胞、乳腺細胞、輸卵管細胞、耳細胞、卵巢細胞、上皮細胞、成纖維細胞、內皮細胞、卵丘細胞、肌肉細胞、神經細胞、成骨細胞。
本領域中各種獲得卵母細胞的方法以及對卵母細胞進行去核處理的方法都可用於本發明。在本發明的一個實例中，去核的哺乳動物供質卵母細胞是這樣獲得的通過超數排卵法獲得處於中Ⅱ期卵母細胞，然後進行去核處理獲得去核的哺乳動物供質卵母細胞。
在本發明方法中，在體細胞被直接注射之前，可對其進行預處理，以使其充分分散成單個細胞。例如，在如下條件下進行處理將培養的體細胞用0.1-0.5％的胰蛋白酶消化以後，再應用1-10mg/L蛋白酶E，36-39℃，3-8％CO2中消化1-20min，然後用於直接注射。
在本發明方法中，體細胞和卵母細胞可以來自同一動物，也可來自同種動物或異種動物。
在本發明中，對於被激活的重構卵，可以被直接移入寄母動物(受體)的輸卵管內，待其妊娠產仔。或者可以將其移入輸卵管而在體內進行短暫培養，或者利用飼養細胞(feeder cell)(例如輸卵管上皮細胞)進行體外培養，形成重構胚，以便觀察重構胚的發育情況。然後回收該重構胚，將其移植到寄母動物的子宮內，待其妊娠產仔。
在本發明方法中，還包括驗證步驟即對重構胚或出生的動物進行DNA指紋分析，以驗證是否是克隆動物。也可根據克隆動物的表型(例如毛的顏色和斑紋)來驗證是否是克隆動物。
下面結合實施例進一步詳細地描述本發明，應理解，這些實施例僅用於闡述目的而不用於限制本發明範圍。
實施例A、方法供質母畜超數排卵技術(提供卵母細胞)超數排卵是指採用製劑誘導動物一次排出正常排卵數若干倍的方法。進行一次超排所耗費用還比受體同步要多得多。通過激素[孕馬血清促性激素(PMSG)；促卵泡激素(FSH)、促卵泡激素釋放因子(LRH)]處理，使母畜呈非季節性排卵，並且在一次排卵中，能排出較多的卵子。對激素處理過的、使用過的動物，仍可以再重複超排使用3-4次，是在時間間隔、激素用量等方面有所不同，這樣充分地利用了試驗動物。有多種超數排卵技術可供使用。
在本發明中採用的具體方法是每隻動物肌注氯前列烯醇(PG，上海計劃生育研究所)0.06-0.1mg/次，間隔10-14天後注射第二次，在第二次注射PG 10-14天後開始超排，即首先肌肉注射FSH(寧波激素製品廠)，用量按7-12IU/kg計(不同種動物用量不盡相同)，分6次，2次/日，每次間隔8-12小時。間隔24小時發情時注射LRH(上海東風製藥廠)，25ug/次，注射LRH後28-30小時回收卵母細胞。
受體母畜的激素處理(受體同步)為與提供卵母細胞胞質的供質母羊同步，受體母羊間隔10-14天分兩次肌肉注射PG，在供質母羊超排注射PG前24小時，受體也同時注射PG，受體注射LRH的時間及劑量與供體相同。
哺乳動物體細胞系的建立在哺乳動物體細胞克隆過程中，動物體細胞的體外培養及細胞系的建立亦是很重要。根據所需克隆動物的種類和要求，選擇組織或器官建立細胞系。其方法為將組織、器官或末分化細胞用胰酶消化成單個細胞，用M199或RM1640等常規培養液(加10％胎牛血清)培養，傳代，遺傳分析，冷凍保存或作供核用。
卵母細胞的收集供質卵母細胞供體母畜在注射LRH後26-30小時，進行卵母細胞的收集。收集是通過手術的方法，在母畜的腹部作一切口，將母畜的輸卵管與卵巢暴露在體外，用衝卵液(F10培養液+5％BSA)從輸卵管中衝出卵母細胞(見圖3)，將收集的卵母細胞培養在CZB培養液中。
卵母細胞去核將卵母細胞移入手術液中，在顯微鏡下，用持卵針固定卵母細胞，卵母細胞排出的極體處於鐘錶3點位，去核針正對著或稍偏離極體去除極體與一部分胞質(見圖5A和5B)。
體細胞注射培養的體細胞經0.25％的胰蛋白酶消化以後，移入手術液中。再應用蛋白酶E(1-10mg/L)，37℃，5％CO2中消化1-10分鐘。洗滌以後，移入手術液中，再將細胞注射進去核的卵母細胞中(圖5C和5D)，形成重構卵。
重構卵的激活重構卵採用兩種方法激活一是將重構卵在激活液(0.3M甘露醇，4mg／ml胎牛血清，0.1mM MgSO4)中進行電刺激(電壓600-800V/cm，每次持續40μs)後，再用化學方法激活(10μM離子黴素5分鐘+2μM 6-DMAP 2-6小時)。激活後重構卵移入正常的CZB培養液中培養。反應溫度通常為37℃±2℃範圍內。
重構卵體內培養應用手術的方法，將激活的重構卵吸入移卵管，將移卵管從輸卵管喇叭口處插入，將卵移入輸卵管內，隨後在輸卵管與子宮連拉部用縫線結紮。在體內培養6天後，剪下輸卵管，用培養液衝出胚胎(即重構胚)，觀察胚胎發育情況。
胚胎移植將發育的重構胚移入與胚胎發育同步的寄母動物(受體)子宮內。1個月後B超檢查是否妊娠，精心飼養，待其產仔。
克隆動物驗證將出生的動物、提供供核細胞的動物與受體羊的DNA進行指紋分析，驗證是否克隆動物。
B、材料在本發明中所用的M199培養基、RMl640培養基、F10培養基和CZB培養基等都是本領域中常規的培養基(培養液)。其中，CZB培養液的配方如下表1、CZB培養液
實施例1用來自莎能奶山羊的乳腺上皮細胞來克隆莎能奶山羊在該實施例中，所用的具體技術路線如圖8所示。具體而言，包括以下步驟1、乳腺上皮細胞獲得與培養用手術方法，無菌地取約1cm2的乳腺組織，在超淨臺內用PBS洗滌、剪碎、0.125％胰酶消化0.5-3小時，滅菌紗布過濾後離心，沉澱用M199培養液(含10％FBS)懸浮，於四孔板培養。待細胞長滿後，傳代、冷凍或用於供核。
2、山羊超排與受體羊的同步山羊超排每隻動物肌注PG，0.06-0.1mg／次，間隔10-14天後注射第二次，在第二次注射PG 10-14天後開始超排，即首先肌肉注射FSH，用量按7-12IU/Kg計(不同種動物用量不盡相同)，分6次，2次/日，每次間隔8-12小時。間隔24小時，發情時注射LRH，25ug/次，根據羊的體重作適當調整。
受體羊的同步為與提供卵母細胞胞質的供質母羊同步，受體母羊間隔10-14天分兩次肌肉注射PG，在供質母羊超排注射PG前24小時，受體也同時注射PG，受體注射LRH的時間及劑量同供體。
3、卵母細胞的回收山羊注射LRH後28-30小時後，通過手術回收卵母細胞(圖3)。按手術常規剪毛、消毒、打開腹腔、拉出子宮與輸卵管，用10ml針筒7號針頭，衝卵液為F10培養液+5％BSA。被衝出輸卵管內的卵子接於園杯內。在體視解剖鏡下，將檢出的卵母細胞置於CZB培養液中，在37℃，5％二氧化碳培養箱中培養。
4、供質卵母細胞的去核與注射供核體細胞將卵母細胞移於含7.5ug/ml細胞鬆弛素B的CZB培養液(表一)中20分鐘，再移至含20mM HEPES的CZB培養液中。同時將已消化成球形的乳腺上皮細胞亦移至該液中。將卵母細胞去核(圖5A和5B)。去核後再將乳腺上皮細胞直接注入卵母細胞的胞質內，形成的細胞稱之為重構卵(圖5C和5D)。重構卵置於CZB液中培養30分鐘，然後進行激活處理。
5、激活與包埋將重構卵置於含細胞鬆弛素B(7.5ug/ml)+離子黴素(10μM)中的CZB培養液中，37℃培養5分鐘。然後，移至含細胞鬆弛素B(7.5ug／ml)+6-DMAP(2μM)的CZB中，於37℃，液滴法培養2-6小時。激活後的重構卵移至CZB培養液中，進行包埋。
包埋採用雙層包埋。所用的包埋液是0.8％與1.0％瓊脂糖(低熔點)溶液。該包埋液是這樣製備的在10ml錐形玻璃離心管內將適量的瓊脂糖與生理鹽水混合煮沸，至完全溶解後置於41℃，水浴待用。
包埋時，在一塑料平皿中加入含Ca2+、Mg2+的PBS液，在PBS液底部用吸管加入胎牛血清，將待包埋的卵母細胞移入血清層，使其自然下沉，待位於底壁，吸出。然後移入另一含剛倒出的0.8％瓊脂糖的小平皿中，將卵母細胞的位置移動2-4次(起到洗滌作用)，再均勻吸卵(卵與卵之間有一定的距離，但相靠不是太遠)，移至PBS中。讓其自然凝固，再分割，換一口徑稍大的吸管，按相同方法進行第二層包埋，不同點在於包埋液的瓊脂糖濃度為1.0％。
6、重構卵的體內培養與回收應用手術的方法，將包埋後的重構卵吸入移卵管，將移卵管從輸卵管喇叭口處插入，將重構卵移進輸卵管內，隨後在輸卵管與子宮連接部用縫線結紮。在體內培養6天後，剪下輸卵管，用培養液衝出胚胎(重構胚)，觀察胚胎發育情況。
7、重構胚的移植將發育的重構胚移入與胚胎發育同步的受體子宮內。1個月後B超檢查是否妊娠，精心飼養，待其產仔。
8、克隆動物驗證將出生的動物、提供供核體細胞的動物與寄母羊的DNA進行指紋分析，驗證是否克隆動物。
結果如下(一)超數排卵
超排效果卵巢發育率(以卵巢直徑＞1cm計)90％(9/10)平均每隻山羊排卵數10.2枚(102枚/10)平均每隻山羊回收卵數8.6(86/10)回收卵效率84％(86/102)由以上結果可以看出，山羊卵巢發育好，回收卵效率高，但平均每隻山羊排卵數稍低。
(二)受體同步發情通過PG處理後，羊的同步率為78％(12/16)。
(三)體細胞培養已建立了莎能奶山羊乳腺上皮細胞系、輸卵管上皮細胞與顆粒細胞系。在代供過程中進行了染色體數分析。觀察了100個分裂相，2倍染色體佔70％以上。
本試驗所用的乳腺上皮細胞為原代細胞(見圖7A和7B)，亦未進行冷凍與飢餓處理。
(四)去核與體細胞注射去核總卵數75枚，其中成活73枚，成活率97％(73/75)體細胞注射後成活卵數68枚重構卵存活率93％(68/73)
(五)激活與體內短暫培養重構卵的激活採用化學激活法，激活後的胚胎移入普通山羊輸卵管內培養6天後，手術回收，觀察重構胚發育情況。
(六)胚發育與移植1、重構胚早期發育情況表
2、移植將發育至32細胞以上的胚胎移植至受體子宮內。每隻受體移入4枚。
(七)對胚胎的驗證對上述處於桑椹階段和早期/晚期囊胚階段的胚胎，取少量細胞進行PCR擴增(DNA指紋分析)，結果表明指紋與莎能奶山羊的相同。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
權利要求
1．一種體細胞克隆哺乳動物的製備方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟提供去核的哺乳動物供質卵母細胞和用於供核的哺乳動物體細胞；用顯微注射法，將用於供核的哺乳動物體細胞直接注射入所述的去核供質卵母細胞，形成重構卵；對所述的重構卵進行激活處理，形成激活的重構卵；將所述的激活的重構卵移植到寄母動物的輸卵管中，或者將所述的激活的重構卵在體外或體內進行培養，形成重構胚，然後再將重構胚移植到寄母動物的子宮內；飼養所述的寄母動物，產生體細胞克隆的哺乳動物。
2．如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的激活的重構卵被移植到哺乳動物輸卵管內作體內培養，形成重構胚，然後回收該重構胚，將其移植到寄母動物的子宮內。
3．如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述哺乳動物體細胞選自下組的細胞皮膚細胞、乳腺細胞、輸卵管細胞、耳細胞、卵巢細胞、上皮細胞、成纖維細胞、內皮細胞、卵丘細胞、肌肉細胞、神經細胞、成骨細胞。
4．如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述體細胞在直接注射之前，在如下條件下進行處理將培養的體細胞用0.1-0.5％的胰蛋白酶消化以後，再應用1-10mg/L蛋白酶E，36-39℃，3-8％CO2中消化1-20min，然後用於直接注射。
5．如權利要求l所述的方法，其特徵在於，對重構卵的激活處理選自下組(ⅰ)重構卵在0.2-0.4M甘露醇，3-5mg/ml的胎牛血清，0.08-0.12mM MgSO4的激活液中，進行1-3次電刺激，電壓為600-800V/cm，每次電刺激持續20-80μs；(ⅱ)重構卵在0.2-0.4M甘露醇，3-5mg／ml的胎牛血清，0.08-0.12mM MgSO4的激活液中，進行1-3次電刺激，電壓為600-800V/cm，每次電刺激持續20-80μs，然後再如下進行化學法激活即在5-20μM離子黴素中激活5分鐘，並在1-5μM 6-DMAP激活1-6小時。
6．如權利要求1所述的方法，其特徵在於，該哺乳動物選自羊、牛、豬、馬、狗、貓、老虎、猴、兔、小鼠和大鼠。
7．如權利要求1所述的方法，其特徵在於，該方法還包括驗證步驟對重構胚或出生的動物進行DNA指紋分析，以驗證是否是克隆動物。
8．如權利要求1所述的方法，其特徵在於，提供去核的哺乳動物供質卵母細胞是這樣獲得的通過超數排卵法獲得處於中Ⅱ期卵母細胞，然後進行去核處理獲得去核的哺乳動物供質卵母細胞。
9．一種獲得用於製備體細胞克隆哺乳動物的重構卵的方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟提供去核的哺乳動物供質卵母細胞和用於供核的哺乳動物體細胞；用顯微注射法，將用於供核的哺乳動物體細胞直接注射入所述的去核供質卵母細胞，形成重構卵；對所述的重構卵進行激活處理，形成激活的重構卵。
10．如權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述哺乳動物體細胞選自下組的細胞皮膚細胞、乳腺細胞、輸卵管細胞、耳細胞、卵巢細胞、上皮細胞、成纖維細胞、內皮細胞、卵丘細胞、肌肉細胞、神經細胞、成骨細胞；所述體細胞在直接注射之前，在如下條件下進行處理將培養的體細胞用0.1-0.5％的胰蛋白酶消化以後，再應用1-10mg/L蛋白酶E，36-39℃，3-8％CO2中消化1-20min，然後用於直接注射；而且，對重構卵的激活處理選自下組(ⅰ)重構卵在0.2-0.4M甘露醇，3-5mg／ml的胎牛血清，0.08-0.12mM MgSO4的激活液中，進行1-3次電刺激，電壓為600-800V/cm，每次電刺激持續20-80μs；(ⅱ)重構卵在0.2-0.4M甘露醇，3-5mg/ml的胎牛血清，0.08-0.12mM MgSO4的激活液中，進行1-3次電刺激，電壓為600-800V/cm，每次電刺激持續20-80μs，然後再如下進行化學法激活即在5-20μM離子黴素中激活5分鐘，並在1-5μM 6-DMAP激活1-6小時。
全文摘要
本發明提供了一種獲得用於克隆哺乳動物的重構卵的方法,包括步驟:提供去核供質卵母細胞和供核體細胞;用顯微注射法,將供核體細胞直接注入去核供質卵母細胞,形成重構卵;和對重構卵進行激活處理,形成激活的重構卵。本發明還提供了一種用所述重構卵產生體細胞克隆哺乳動物的方法。本發明方法省去了細胞融合和去除體細胞的細胞質步驟,因此更加簡易,效率更高。
文檔編號A61D19/00GK1294902SQ9911997
公開日2001年5月16日 申請日期1999年11月8日 優先權日1999年11月8日
發明者成國祥, 陳建泉 申請人:上海中路生物工程有限公司