中試規模木黴高產厚垣孢子液體發酵製備方法

2023-05-22 11:06:36

專利名稱：中試規模木黴高產厚垣孢子液體發酵製備方法
技術領域：
本發明涉及的是一種微生物發酵技術領域的方法，具體是一種中試規模木黴高產厚垣孢子液體發酵製備方法。
背景技術：
木黴菌(Trichoderma spp.)是國際上公認的對環境友好的植物病害生物防治微生物。目前國際上已有50餘種木黴菌菌劑註冊、生產和使用。但是目前商品化的木黴菌製劑主要是以木黴菌分生孢子為主要成分，製劑貨架期較短(僅有三個月)，限制了製劑在生產中應用的有效期限。已有研究表明木黴菌在特定的培養條件下可以產生厚垣孢子，厚垣孢子具有耐乾燥、耐高溫、對土壤抑菌作用不敏感及存活期長等優點，可使孢子易於加工和貯存，有利於在土壤中存活。因此，如何生產出高含量厚垣孢子是提高木黴菌劑貯藏時間和應用時效性的關鍵技術。然而迄今為止，國內外關於木黴菌產厚垣孢子發酵條件的報導或專利主要是利用葡萄糖、燕麥粉做為碳源在三角產瓶-搖床培養條件下建立的，例如鄒勇等U006)通過正交設計研究表明黃綠木黴菌(Trichoderma aureoviride) T-33菌株發酵生產厚垣孢子的優化條件為燕麥粉培養液、30°C、pH 4. 0U40r/min振蕩培養，產生厚垣孢子數量為3. 37 X IO7個/mL。但這一研究主要是在三角瓶和搖床條件下和特定菌株下完成的，生產成本較高，並且缺少普遍適用性，不適合後續的工業化大規模發酵生產。此外，利用馬鈴薯、葡萄糖、蔗糖做為碳源製備木黴菌T-23菌株厚垣孢子(莊敬華等，2005)，同樣存在生產成本過高和缺少普適性的難題。因此有必要篩選更為低廉的營養基質製備木黴菌厚垣孢子製劑。經對現有技術的文獻檢索發現，顧金剛等在《中國生物防治》2008年第M卷第3 期報告中表明「哈茨木黴ACC30371以玉米稈粉培養基為營養基質，在^°C、初始pH 6.0、 250r/min、裝瓶量75mL/250mL的條件下培養，10天後厚垣孢子數量達5. 13 X IO8個/mL。說明利用低成本原材料生產厚垣孢子是可行的，但本研究發酵時間過長，需要10天，而且也只是在三角瓶水平上利用特定木黴菌株完成的，很難反映該方法對各種木黴菌生產厚垣孢子的普適性、以及在工業化水平上發酵生產厚垣孢子所需條件。此外，玉米的秸稈粉碎過程也增加了操作的繁鎖程度，間接增加了生產成本。

發明內容
本發明針對現有技術存在的上述不足，提供一種中試規模木黴高產厚垣孢子液體發酵製備方法，解決了傳統木黴菌厚垣孢子製備成本高、發酵規模小和發酵時間長等問題， 實現了中試發酵水平上，低成本製備木黴菌厚垣孢子產品的目標。本發明是通過以下技術方案實現的，本發明由以下步驟組成步驟一，取木黴菌(Trichoderma spp.)的三種菌株 Τ· koningiopisis、 Τ. atroviride, Τ. harzianum,分別接種於種子菌培養基PDA上進行常溫培養，之後分別接種於種子液中進行發酵培養，得種子菌發酵液；
所述的PDA培養基，其組分及含量為馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L、瓊脂粉25g/L 餘量為水，該PDA培養基通過以下方式製備得到將馬鈴薯去皮後切成塊加水並煮沸，然後用紗布過濾並向濾液中加葡萄糖和瓊脂粉，最後補水定容。所述的種子液培養基的組分及含量為馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L，餘量為水， 該種子液培養基通過以下方式製備得到將馬鈴薯去皮後切成塊加水並煮沸，然後用紗布過濾並向濾液中加葡萄糖，最後補水定容。所述的常溫培養是指在環境下培養3-4天。所述的發酵培養是指在pH 6 7J8°C，溶氧量20-30%以及130-140r/min的旋轉環境下發酵7天。步驟二，將種子菌發酵液接種於中試水平的液體培養基中，經二次發酵得到液體發酵物；所述的接種是指按每200L液體培養基添加1. 2L種子菌發酵液的比例進行接種。所述的液體培液基的組分含量為玉米粉40-60g/L，硫酸銨450-550mg/L，餘量為無菌水。所述的玉米粉的粒度為40目以下。所述的二次發酵是指在pH 3 4J8.0°C 48.8°C，溶解氧 20-30%，i;35-140r/ min的旋轉環境下發酵5-8天。與現有技術相比，本發明具有以下創新點1.本發明所用基本培養基組分為玉米粉，價格低於傳統的燕麥粉培養基。其他輔助成分的數量及用量也低於傳統的產厚垣孢子培養基。2.本發明厚垣孢子製備方法實現了在300L中試水平上低成本發酵生產厚垣孢子的目標，不再僅限於通過三角瓶-搖床實驗產生厚垣孢子。3.本發酵條件不僅適用於單一種屬木黴菌產厚垣孢子的液體發酵，對於其他種木黴菌株液體發酵產厚垣孢子也具有普遍適應性。4.本發明解決了利用傳統培養基發酵製備厚垣孢子時間過長、操作複雜、產量低等問題。本發明涉及的木黴菌是按照Christian P. Kubicek和Gary E.Harman主編的 ((Trichoderma and Gliocladium》第一卷(Taylor 和 Francis Ltd, 1998)中介紹的土壤稀釋法進行分離，並利用木黴菌選擇性培養基[Josie Williams, John Μ. Clarkson, Peter R. Mills, and Richard M. Cooper A Selective Medium for Quantitative Reisolation of Trichoderma harzianum from Agaricus bisporus Compost, Appl Environ Microbiol. 2003July ；69 (7) :4190 4191)]培養得到。本發明涉及擬康寧木黴(T. koningiopsis)已經在《李廣記陳捷劉銅劉力行*，木黴屬中國新記錄種T. koningiopisis記述，微生物學通報pl663_1665》公開。本發明涉及深綠木黴(T.atroviride)已經在《Jun Tang, Lixing Liu, Xiuli Huang, Yingying Li, Yunpeng Chen, and Jie Chen. Proteomic analysis of Trichoderma atro viride mycelia stressed by organophosphate pesticide dichlorvos. Can. J. Microbiol. pl21_127》公開。本發明涉及哈茨木黴(Τ. harz ianum)已經在《唐俊孫文良伍柯瑾劉力行陳捷女，木黴菌發酵液蛋白對玉米彎孢菌葉斑病的誘導抗性作用，安徽農業科學，P8564-8566》公開。上述三株木黴菌株均由上海交通大學農業與生物學院植物病理學實驗室保存。
具體實施例方式下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護範圍不限於下述的實施例。實施例1步驟一隨意選取10株木黴菌株，分別接種於PDA(馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g， IOOOmL水)平板上培養3天；在平板上菌落周邊打取菌餅，接入種子液培養基(馬鈴薯200g，葡萄糖20g，1000m L水)發酵3天後，轉接至200L液體培養基(組分馬鈴薯 200g，葡萄糖 20g, MgSO4 · 7H20 0. 5g, FeSO4 · 7H20 0. 0075g, MnSO4O. 0025g, ZnSO4O. 002g, KH2P043. 83g，NaNO3L 42g，(NH4)2SO4L lg，CaCl2Ig,水 1000m L)中，於 300L 液體發酵罐 (FUS30L發酵系統，上海國強生化工程裝備有限公司)發酵7天；發酵參數pH6-7、溶氧量 20-30%。步驟二用IM HCL溶液將200L液體發酵培養基(玉米粉10kg，硫酸銨IOOg)酸度調整到 PH4-5之後加入300L(裝罐量200L)發酵罐(FUS300L發酵系統，上海國強生化工程裝備有限公司)中。將1. 2L的種子菌接種於液體發酵培養基中，設定發酵參數溶解氧量20-30%。 從發酵後第3天開始取樣顯微鏡(40倍物鏡)檢查厚垣孢子的產量變化。本實施例的效果1、實驗設計分別取2個發酵條件下不同木黴菌株的發酵液，利用血球計數板對厚垣孢子數量進行統計。結果表明利用方法二(步驟二)發酵所得的厚垣孢子數量普遍高於利用方法一 (步驟一)發酵所得的厚垣孢子數量。在供試的10株木黴菌中，有9株菌在利用方法一時所得厚垣孢子數量大於利用方法二時。表1不同方法厚垣孢子產生數量(個/mL)不同菌株 1 權利要求
1.一種中試規模木黴高產厚垣孢子液體發酵製備方法，其特徵在於，由以下步驟組成步驟一，取木黴菌的三種菌株T. koningiopsis、T. atroviride或Τ. harzianum,分別接種於種子菌培養基上進行常溫培養，之後分別接種於種子液中進行發酵培養，得種子菌發酵液；步驟二，將種子菌發酵液接種於中試水平的液體培養基中，經二次發酵得到液體發酵物。
2.根據權利要求1所述的中試規模木黴高產厚垣孢子液體發酵製備方法，其特徵是， 所述的PDA培養基，其組分及含量為馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L、瓊脂粉25g/L餘量為水，該PDA培養基通過以下方式製備得到將馬鈴薯去皮後切成塊加水並煮沸，然後用紗布過濾並向濾液中加葡萄糖和瓊脂粉，最後補水定容。
3.根據權利要求1所述的中試規模木黴高產厚垣孢子液體發酵製備方法，其特徵是， 所述的種子液培養基的組分及含量為馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L，餘量為水，該種子液培養基通過以下方式製備得到將馬鈴薯去皮後切成塊加水並煮沸，然後用紗布過濾並向濾液中加葡萄糖，最後補水定容。
4.根據權利要求1所述的中試規模木黴高產厚垣孢子液體發酵製備方法，其特徵是， 所述的常溫培養是指在環境下培養3-4天。
5.根據權利要求1所述的中試規模木黴高產厚垣孢子液體發酵製備方法，其特徵是， 所述的發酵培養是指在PH 6 7J8°C，溶氧量20-30%以及130-140r/min的旋轉環境下發酵7天。
6.根據權利要求1所述的中試規模木黴高產厚垣孢子液體發酵製備方法，其特徵是， 所述的接種是指按每200L液體培養基添加1. 2L種子菌發酵液的比例進行接種。
7.根據權利要求1所述的中試規模木黴高產厚垣孢子液體發酵製備方法，其特徵是， 所述的液體培液基的組分含量為玉米粉40-60g/L，硫酸銨450-550mg/L，餘量為無菌水。
8.根據權利要求1所述的中試規模木黴高產厚垣孢子液體發酵製備方法，其特徵是， 所述的玉米粉的粒度為40目以下。
9.根據權利要求1所述的中試規模木黴高產厚垣孢子液體發酵製備方法，其特徵是， 所述的二次發酵是指在PH 3-4，28. O0C -28. 8°C，溶解氧20-30%，135-140r/min的旋轉環境下發酵5-8天。
全文摘要
一種微生物發酵技術領域的中試規模木黴高產厚垣孢子液體發酵製備方法，通過取木黴菌的三種菌株T.koningiopisis、T.atroviride、T.harzianum，分別接種於種子菌培養基PDA上進行常溫培養，之後分別接種於種子液中進行發酵培養，得種子菌發酵液；再將種子菌發酵液接種於中試水平的液體培養基中，經二次發酵得到液體發酵物。本發明解決了傳統木黴菌厚垣孢子製備成本高、發酵規模小和發酵時間長等問題，實現了中試發酵水平上，低成本製備木黴菌厚垣孢子產品的目標。
文檔編號C12N1/14GK102154194SQ20111008107
公開日2011年8月17日 申請日期2011年3月31日 優先權日2011年3月31日
發明者張婷, 王秉麗, 陳捷 申請人:上海交通大學