以遍在的內切蛋白酶切割嵌合融合蛋白質生產多基因產物的製作方法

2023-05-22 14:30:06

專利名稱：以遍在的內切蛋白酶切割嵌合融合蛋白質生產多基因產物的製作方法
技術領域：
本發明涉及與基因表達相關的材料和方法。尤其，但並非僅僅涉及以單順反子表達多基因產物的方法，以及該方法在治療學的應用和實施該方法的試劑盒。
在真核細胞中許多基因產物(如激素原，神經肽前體等)最初是以前體分子的形式被合成，之後通過蛋白酶剪切進行翻譯後的加工(有關綜述見參考文獻(Barr，1991 DNA細胞生物學，10，319-328；Steiner等，1992生物和化學雜誌，267，23435-23438))。通過與Kex2，即第一個在酵母中被證實的真核細胞加工性內切蛋白酶(Julius等，1984，細胞，37，1075-1089；Mizuno等，1988，生物化學生物物理學研究通訊，156，246-254)的同源性，許多在胰島、腦下垂體和其它神經內分泌細胞中表達的組織特異性內切蛋白酶(PC2，PC3，PC4，PACE4)已經被鑑定(Smeekens和Steiner，1990，生物化學雜誌，265，2997-3000；Smeekens等，1991，美國科學院進展，88，340-344；Nakayama等，1992，生物化學雜誌，267，5897-5900；Kiefer等，1991 DNA細胞生物學，10，757-769)。相反，定位於高爾基體的內切蛋白酶弗林蛋白酶(Shapiro等，1997，組織化學與細胞化學雜誌，45，3-12)在多種不同的組織中表達(Schalken等，1987，臨床研究，80，1545-1549)，並且在真核生物種屬間高度保守(Barr等，1991，細胞，66，1-3)。弗林蛋白酶代表一類能夠加工自組成型通路分泌的多種蛋白質前體的常見細胞內切蛋白酶。大多數激素原和神經內分泌前體在Lys-Arg或Arg-Arg二鹼性胺基酸殘基處被加工，但是經不可調控或組成型通路分泌的蛋白前體具有更為複雜的弗林蛋白酶切割位點，其共有序列為Arg.X.Arg/Lys.Arg(Bresnahan等，1990，細胞生物學雜誌，111，2851-2859；Hosaka等，1991，生物化學雜誌，266，12127-12130)。弗林蛋白酶蛋白水解活性的直接證據是通過將弗林蛋白酶和von Willebrand因子前體(pro-vWF)的cDNA導入COS細胞的共轉染實驗中得到的。弗林蛋白酶的存在使得pro-vWF在它的天然加工位點Arg-Ser-Lys-Arg處完全成熟，並且顯示了P4位置的Arg的重要性(van de ven等，1990，分子生物學通訊(Mol.Biol.Rep.)，14，265-275；Wise等，1990，美國科學院進展，87，9378-9382)。許多研究表明將弗林蛋白酶的識別位點摻入重組蛋白質可使這些蛋白質從轉導細胞中有效地被分泌。這些研究包括編碼IgG1 Fc段肽的分泌，這是將該片段與降鈣素前體氨基末端區域融合的結果(Liu等，1993，美國科學院進展，90，8957-8961)。同樣，將弗林蛋白酶識別位點摻入重組胰島素原中可以使僅以組成型通路分泌的細胞分泌成熟有活性的人胰島素(Groskreutz等，1994，生物化學雜誌，269，6241-6245)。
在許多生物學應用中需要表達多基因產物。一些目前可利用的技術可以實現該目的，但有局限性。這些技術包括用各作為獨立調控表達單位編碼單個或多個基因的載體順次轉移基因，也可以選擇地將核糖體進入位點序列置於不同編碼序列之間，以允許多順反子轉錄產物的表達，其中每個編碼單位可以被翻譯成相應的蛋白質產物。
然而，這些方法中的每一種都有許多缺點。使用多種質粒是耗時，低效率的，且通常依賴於對每種編碼基因進行不同篩選方法的可用性。多表達盒的摻入可導致啟動子間的相互幹擾，其中載體中一個表達盒的表達會影響(通常是抑制)另一表達盒的表達(Emerman和Temin，1984，細胞，39，449-467；Emerman和Temin，1986，核酸研究，14，9381-9396)。摻入單個核糖體進入位點可使兩個基因有效地表達，但為表達多於兩個基因而摻入兩個或更多的核糖體進入位點序列會導致載體的不穩定。此外，這些方法中沒有一種方法可保證編碼基因的協調表達，因此，完全不適合於需要兩種或多種基因產物以等摩爾比例(即1∶1)或以真正的其它特定摩爾比(如2∶1)的表達。這一點在目的生物學活性是異質性亞基產物的基因轉移研究中需著重考慮(例如IL-12的p40亞基的表達在摩爾數上超過p35亞基會抑制IL-12的免疫刺激活性(Chen等，1997，免疫學雜誌，159，351-359；Mattner等，1997，傳染病學與免疫學(Infect.Immun.)，65，4734-4737)。
此前兩項研究應用了弗林蛋白酶切割位點，但不是用來從單順反子生產多種蛋白質，而是為了將通常狀況下的細胞內蛋白質分泌出來(Liu等，1993，美國科學院進展，90，8957-8961)或產生僅被特定的細胞類型正常分泌的肽(Methot等，1997，生物化學雜誌，272，12994-12999)。在如上所述的第一項研究中，通過弗林蛋白酶切割位點將一種抗體的Fc段融合到降鈣素前體的信號肽中，導致了Fc片段的分泌(Liu等，1993，美國科學院進展，90，8957-8961)。在第二項研究中，經弗林蛋白酶識別位點將血管緊張素II融合到帶信號肽的部分腎素原(prorenin)上，可以使缺乏生產成熟肽所必需的完整修飾系統的細胞能夠分泌血管緊張素II(Methot等，1997，生物化學雜誌，272，12994-12999)。
此處作為例子，本發明者以融合蛋白質的形式表達了IL-2和B7.1，IL-4和B7.1，IL-4和IL-2，IL-12(由兩種亞基組成，p35和p40)，或IL-12和IL-2(由三種亞基組成，IL-12的p35和p40亞基加上IL-2)，在每一個例子中均以包含弗林蛋白酶靶序列的接頭分隔。在這些例子中，所使用的弗林蛋白酶切割位點分別為B7.1/IL-2編碼載體為Gly.Gly.Arg.Gly.Arg.Arg.Gly(圖2A，B，和C)，IL-4編碼載體為Gly.Gly.Arg.Tyr.Arg.Arg.Gly.Gly(圖2D和E)，或IL-12編碼載體為Gly.Arg.Pro.Lys.Arg.Pro(圖2F和G)。這些序列包含弗林蛋白酶切割位點的共有序列(在這些例子中為Arg.Gly.Arg.Arg或Arg.Pro.Lys.Arg)和使該切割位點在空間上更易被接近的附加甘氨酸或脯氨酸殘基。通常弗林蛋白酶的切割位點符合共有序列Arg.X.Y.Arg，其中X可以是任何胺基酸，如甘氨酸，賴氨酸，纈氨酸，酪氨酸，穀氨醯胺或脯氨酸，而Y優選賴氨酸或精氨酸。第三基因殺稻瘟素S脫氨酶經由腦心肌炎病毒核糖體進入位點序列的表達，可允許分離成功轉導的細胞，各轉導細胞中融合基因的組分表達為在適當亞細胞部位內的具有生物學活性的物質。以CTLL試驗和ELISA證實了有生物學活性的人IL-2和IL-4的表達，以人淋巴細胞的激活和ELISA證實了有生物學活性的IL-12的表達。用B7.1的單克隆抗體或其天然配基CTLA4以FACS試驗，以及由其共刺激JurkatT細胞系產生IL-2的能力證實了有生物學活性的人B7.1的表達。
因此，最基本的是，本發明提供了以單順反子產生多基因產物的方法和材料，該順反子以單個融合蛋白質的形式編碼多種產物，融合蛋白質在合成後可經過切割和加工生成其具有生物學活性的構成組分。
第一方面，本發明提供了一種在靶細胞中以融合蛋白質的形式表達兩種或多種多肽的核酸構建體，所述核酸構建體包含編碼第一多肽的第一序列和編碼第二多肽的第二序列，所述第一和第二序列被編碼一種內切蛋白酶切割位點的接頭序列分隔。
內切蛋白酶切割位點可以是內切蛋白酶識別的任何胺基酸序列。內切蛋白酶的例子包括PC2，PC3，PC4，PACE4和Kex2。優選地，內切蛋白酶為弗林蛋白酶，它識別具有胺基酸序列為Arg.X.Y.Arg的切割位點，其中X是任何胺基酸殘基，Y優選賴氨酸或精氨酸。熟練的技術人員完全有能力提供所需求的具有其它亞細胞定位的其它內切蛋白酶識別和/或靶向的切割位點。
為了使內切蛋白酶切割位點在空間上與內切蛋白酶更易接近，優選接頭序列更進一步包含間隔序列。這種間隔序列可以簡單地是一個或更多個位於編碼內切蛋白酶切割位點的核苷酸任一側的適宜附加密碼子(如甘氨酸編碼密碼子)。切割位點可以由能夠編碼適合內切蛋白酶切割的胺基酸序列的任何DNA序列編碼，優選側翼有較少數目(2，3，4等)適宜的附加胺基酸，從而使切割位點更易接近內切蛋白酶。假如切割位點是弗林蛋白酶的切割位點，它可以是由任何適合弗林蛋白酶切割的DNA序列編碼(如上所描述的Arg.X.Y.Arg)。作為例子，接頭序列可以是AGG-GGT-CGA-CGC。切割位點每側側翼可以有編碼甘氨酸殘基的密碼子作為間隔序列，如編碼Gly.Gly.Arg.Gly.Arg.Arg.Gly.Gly的GGC-GGC-AGG-GGT-CGA-CGC-GGC-GGC。該接頭序列也可能包括由純粹和應用化學國際聯合會規定的共有序列MGN-NNN(除TRR外)-AAR-MGN或MGN-NNN(除TRR外)MGN-MGN(Biochemical Nomenclature and Related Documents，第二版，Portland出版，1992，122-126)。
該核酸構建體可以是DNA，cDNA，RNA，線狀或環狀，單鏈或雙鏈，其中兩種或兩種以上多肽以單順反子轉錄物形式編碼。優選地，該構建體可構成一種可用於轉染或感染宿主細胞的載體的部分，包含該核酸構建體的載體和宿主細胞構成本發明的另一個方面。
第二方面，本發明提供了一種在靶細胞中表達兩種或兩種以上多肽的方法，所述方法包含以下步驟a)構建以上定義的核酸構建體；和b)用所述核酸構建體轉染靶細胞，從而使該核酸構建體表達產生含有由內切蛋白酶切割位點連接的第一和第二多肽的融合蛋白，所述的內切蛋白酶切割位點可以被靶細胞內的內切蛋白酶切割生成單獨的具有生物學活性的第一和第二多肽。
優選地，所述核酸構建體是核酸載體，尤其是病毒載體，如逆轉錄病毒載體的一部分。這種逆轉錄病毒載體可轉染到逆轉錄病毒包裝細胞系中，這種細胞可以用來感染靶細胞。
本發明的構建體和方法可作為研究工具用於研究在靶細胞內兩種或多種多肽的表達和活性。這可以用於生產多亞基蛋白質或蛋白質複合體，將它們從靶細胞中分離後可用於工業，診斷或治療。此外，所述靶細胞本身也可用於這些目的，包括用編碼嵌合蛋白質的可表達一種或多種具有生物學活性的產物(如包含兩種不同亞基的IL-12)的載體轉染而生產細胞疫苗(如腫瘤細胞疫苗)。該方法還可用於在不能正常表達這些蛋白質的細胞內異位表達多蛋白質。該方法的主要優點在於能夠以特定摩爾比例產生兩種或多種蛋白質。這一點對於要求每種亞基以等摩爾量表達的多亞基蛋白質(如IL-12)尤其有用。的確，以不同的摩爾量表達的亞基可產生與蛋白質組合相關的拮抗效應。
此處提供的技術更進一步的應用為，摻入的內切蛋白酶識別和/或切割位點可用於包括組織特異性內切蛋白酶在內的內切蛋白酶切割，因而為單一蛋白質或由多組分組成的嵌合蛋白質的組織特異性加工提供了一種新機制(而非靶向送遞或組織特異性轉錄)，這些蛋白質可能在內切蛋白酶剪切之前沒有活性，因蛋白酶剪切的結果使其激活，從而組織特異性表達由嵌合蛋白質各組分編碼的生物學活性，或由它們協同作用編碼的生物學活性，或它們與細胞內其它組分編碼的生物學活性。
可選擇地，根據本發明的技術能夠用於疾病治療，其中細胞類型可被靶向而產生兩種或多種多肽。這種治療可包括基因治療，用於治療不能合成有活性的多肽或不能合成正常水平的多肽或兩種情況兼有的病人，從而達到由野生型多肽，即所編碼的多肽本身或其進一步修飾的產物提供的效應。對此將在下面作更詳細的描述。


圖1表示分泌的組成型通路和推測的弗林蛋白酶對嵌合蛋白質作用方式的圖解概述。
圖2表示包含IL-2，IL-4，IL-12p35，IL-12p40和B7.1不同組合的融合基因」構建體的7種逆轉錄病毒載體的圖解說明。
圖3表示利用CTLA4-Ig和FITC-Ig以流式細胞術檢測被pWZLB7/IL2M，pWZLIL4/B7M和pWZLIL2B7M感染的AM12細胞表面表達B7.1的情況。
圖4表示以pWZLIL2/B7M轉導的GP+envAM12和GP+E86細胞上清中TCGF(T細胞生長因子)活性的抗體封閉實驗。1∶4稀釋的上清中加入1μg/ml不相關抗體(UPC10)或中和性抗IL-2(5334.2)抗體。-測量摻入的3H胸腺嘧啶並與未加抗體的相同稀釋度上清比較。
圖5A表示CTLL細胞對pWZLIL4/B7M轉導的AM12細胞培養上清中存在的細胞因子的增殖反應。
圖5B表示存在或缺乏1μg/ml中和性IL-2和/或IL-4抗體時所檢測的CTLL細胞對pWZLIL4/IL2M轉導的AM12細胞培養上清中存在的細胞因子的增殖反應。結果以脈衝4小時後所摻入的3H胸腺嘧啶的cpm表示。
圖6表示以pWZLIL2B7M載體轉導的GP+E86和GP+envAm12包裝細胞為刺激細胞的Jurkat共刺激試驗。條形表示在Jurkat細胞存在下，存在或缺乏所示抗體(1μg/ml)條件下對PHA-P和GP+E86或GP+envAM12包裝細胞為刺激細胞產生反應所生成的IL-12，縮寫AM12＝GP+envAM12。
圖7即表1是以ELISA或CTLL試驗定量測定的轉導細胞的細胞因子產生，以測定生物學活性。
圖8即表2是以流式細胞術檢測的在NIH/3T3，32Dp210，K562和OIB細胞表面上B7和IL-2的表達。
圖9即表3是在人腫瘤細胞內IL-2和B7.1的表達圖解說明。
圖10即表4是在融合基因載體轉導的Cos7細胞內細胞因子(IL-2和IL-12)的生物學活性的圖解說明。
發明詳述本發明的核酸構建體可以分離物、分離和/或純化形式提供。該核酸可以是全部或部分合成的，可以包含基因組DNA，cDNA或RNA。
該核酸構建體可包含許多編碼多肽的序列，各序列由編碼組織特異性的或遍在的內切蛋白酶切割位點的接頭序列所分隔，本領域的技術人員應用此處的信息和參考資料以及本領域公知的技術(如參考Sambrook，Fristsch和Maniatis，「分子克隆實驗指南，冷泉港實驗室出版，1989，和Ausubel等，簡明分子生物學方法，John Wiley和Sons 1992)可以容易地製備這種核酸構建體。這些技術包括(i)應用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增此類核酸樣品，如來源於基因組的材料，(ii)化學合成，或(iii)製備cDNA序列。可以對核酸序列進行修飾，如應用誘點突變，以表達被修飾的多肽或利用用來表達構建體的靶細胞的偏好性密碼子。
為實現核酸構建體的表達，可將序列插入到帶有效連接在核酸上的控制序列的載體中以調控其表達。可以選擇或構建合適的載體，使其包含合適的調控序列，包括啟動子序列、終止子片段、多聚腺苷酸化序列、增強子序列、標記基因和其它適當的序列。載體可以是質粒，病毒例如噬菌體或噬粒，合適即可。更進一步的細節見，如分子克隆實驗指南，第二版，Sambrook等，1989，冷泉港實驗室出版。許多已知的操作核酸的技術和方法，如核酸構建體的製備、誘變、序列分析、將DNA引入細胞和基因表達，以及蛋白質分析，在當代分子生物學手冊，Ausubel等，John Wiley和Sons，1992中有詳細的描述。
通過將載體轉化到其中載體有功能的靶細胞中(經轉染或感染)，培養靶細胞使核酸構建體表達產物融合蛋白質得以表達，並在細胞內通過切割融合蛋白質從而產生所述兩種或多種多肽，可使靶細胞表達兩種或多種多肽。
本發明允許在細胞內對多肽進行加工，從而使其正常的生物學活性得以保留或受到修飾。優選地，在該兩種或多種多肽中至少有一種能被細胞以生物學活性形式分泌。
為本領域所熟知，原核和真核細胞都可用於此目的，如大腸桿菌的菌株，酵母和真核細胞，例如COS或CHO細胞。然而，根據本發明，靶細胞可以是不表達某些多肽或者另一些多肽的表達會引起其它生物學過程的細胞。此外，可以選擇靶細胞從而使所表達的兩種或多種多肽中的一種可以被分泌到周圍組織中。這一點可能有更多的分子生物學方面的應用，如腫瘤的免疫基因治療。儘管本發明可適用於任何細胞類型，建議使用的細胞系包括多種類型和起源的成纖維細胞、上皮細胞、肌細胞、神經元、實質細胞、內分泌和骨髓來源的細胞。
基於靶細胞的不同，編碼內切蛋白酶切割位點的接頭序列可能必須被修飾以保證切割位點能夠被該靶細胞類型內常見的內切蛋白酶識別。本領域的技術人員能夠通過應用此處包含的信息和參考資料以及共知的一般性知識做到這一點。優選的內切蛋白酶為在多種組織中廣泛表達並且在真核生物種屬間高度保守的弗林蛋白酶。但是，用組織特異性內切蛋白酶切割位點而不是弗林蛋白酶切割位點將會提供更高程度的特異性，從而在特定的組織中產生所需的生物學活性組分。這樣將引入更高的靶向性水平(不僅僅局限於組織特異性送遞和轉錄)，並為細胞毒化合物和/或藥物轉換酶基因的送遞提供了另外的方法。
用於基因治療的核酸構建體可以在體內或體外引入靶細胞，對此將在下面討論。
核酸構建體編碼的多肽可以是多肽或基因的活性部分、片段或衍生物。多肽或基因的「活性部分」是指比所述全長野生型多肽短的肽，但是其保留了多肽的基本生物學活性。應基於多肽的功能和特定的靶細胞來選擇多肽，例如可以選擇在靶細胞中不能正常表達的多肽或能夠從靶細胞分泌到周圍組織中的多肽。例如該核酸構建體可以編碼細胞毒性化合物或藥物轉換酶。多肽必需的基本生物學活性可以通過多肽的常規測試，如與其它結合蛋白質如抗體間的相互作用來確定。
本領域的技術人員熟知其它的測定生物學活性的方法。這些方法的例子包括將底物轉化成產物(如酶)；生成產物(如激素)和直接或通過它們的生物學活性(如刺激反應細胞的生長)測定產物；與蛋白質或其它靶如DNA或RNA序列的結合或其它相互作用(例如DNA結合蛋白質)；特定RNA或蛋白質生成的水平改變(轉錄因子)；由產物水平降低而引起的比色改變(酶)；蛋白質自身，其結合配體或其活性的其它產物的染色。
編碼兩種或多種具有真正生物學活性多肽的本發明核酸構建體，可以用在基因治療方法之中，以治療不能合成有活性多肽或不能在特定的細胞或組織中合成或不能以需求量，或合適的摩爾比例合成該多肽的患者，從而提供由野生型，修飾後的或新多肽呈現出的效應，或能夠使靶細胞產生和/或分泌多肽至周圍介質之中。
在現有技術中已經用載體如病毒載體將基因引入許多不同的靶細胞。通常，將載體暴露於靶細胞，從而使足夠比率的細胞發生轉染進而提供由目的多肽表達所產生的有益的治療或預防效果。被轉染的核酸在細胞內可能以附加體，或以自主複製的多核苷酸，或通過摻入細胞例如腫瘤細胞的細胞核或線粒體基因組中，瞬時或永久存在，這樣提供瞬時或長期持久的效果。在瞬時表達或瞬時效果的情況下，可以周期性地重複這種治療。
多種載體，包括病毒載體和質粒載體為本領域所熟知，見US專利號5,252,479和WO93/07282。特別是許多病毒已被用作基因轉移的載體，包括乳多空病毒，如SV40，痘苗病毒，皰疹病毒包括單純皰疹病毒和EB病毒以及逆轉錄病毒。現有技術中許多基因治療方案已使用了缺陷的鼠逆轉錄病毒。
除使用病毒載體外，其他向細胞內引入核酸的公知方法包括電穿孔法；磷酸鈣共沉澱法；機械方法如顯微注射，脂質體介導的轉移，高速發射器介導的轉移和直接的DNA攝取以及受體介導的DNA轉移，或甚至原生質體或細胞融合介導的轉移等。
如上所述，應用編碼該兩種或多種多肽或其有活性的部分，或無活性的前體蛋白質或前體蛋白質原的核酸進行基因治療的目的是在野生型多肽缺如或僅以低水平存在的細胞中增加該核酸表達產物的量。可選擇地，該目的可以是修飾靶細胞，使之能夠產生該細胞中通常不能產生的特殊多肽。這種治療可能在例如癌性細胞的治療方面有效，或在已知缺乏特殊多肽的個體的預防性治療方面有效。該治療也可能包含預防性的或治療性的接種(如用如此修飾的腫瘤細胞疫苗)，或者表達活性藥物轉化酶或經這種蛋白水解加工後可以被激活的無活性藥物轉化酶。
因此，本發明提供了用於上述醫學治療中的構建體和構建體在製備腫瘤細胞治療藥劑方面的應用。方法和材料融合載體的克隆構建了兩種hIL2/hB7.1融合載體，其中一個包含全長hIL-2和hB7.1 cDNA，第二種載體包含全長hIL-2和僅編碼hB7.1成熟產物的cDNA。在這兩種載體中，IL-2和B7.1編碼序列都被弗林蛋白酶切割位點隔開，兩側側翼有額外二個甘氨酸殘基以使切割位點在空間上更易接近。該序列(GGC-GGC-AGG-GGT-CGA-CGC-GGC-GGC)含SalI識別位點(以黑體表示)並編碼Gly.Gly.Arg.Gly.Arg.Arg.Gly.Gly。利用適宜的PCR引物可擴增大量的IL-2和B7.1cDNA片段，分別測定其序列，以確定無突變存在。利用pUC來源的質粒骨架，將這些片段連接起來以構建包含莫洛尼鼠類白血病病毒(MoMLV)長末端重複序列(LTR)和通過弗林蛋白酶位點與全長的hB7.1(核苷酸318-1184)或成熟B7.1(核苷酸396-1184)相融合的全長hIL-2(核苷酸48-507)如圖2所描述的逆轉錄病毒載體。應用本領域技術人員熟知的相似策略構建圖2C至2G描述的其他載體。融合基因逆轉錄病毒載體的生成將生成的質粒轉染入親嗜性逆轉錄病毒包裝細胞系(GP+E-86)內，以4-8μg/ml殺稻瘟菌素S篩選後的細胞培養上清液感染雙嗜性包裝細胞系(GP+envAM12)。單個GP+envAM12細胞克隆的培養上清基本按以前描述的方法(Gken等，1997)感染不同的靶細胞。分析細胞因子的產生和B7.1的表達細胞因子的產生利用抗體JES6-1A12和11B11分別捕獲和探測IL-2，或用JES6-5H4和BVD6-24G2(Pharmingen San Diego CA)分別捕獲和探測IL-4，以ELISA測量IL-2和IL-4的水平。這些細胞因子的生物學分析基於CTLL細胞的H3-胸腺嘧啶摻入試驗。在1μg/ml不相關抗體(淨化的UPC10克隆的腹水，小鼠IgG2a)或抗IL-2(純化的，5334.2克隆，小鼠IgG2a，RD Systems)或IL-4(11B11)的中和性抗體存在條件下實施該分析hB7.1表達利用反受體CTLA4或FITC偶聯的小鼠單克隆抗體(BB1克隆，IgM，PharMingen)以流式細胞術檢測B7.1的表達。從CTLA4Ig生產細胞J558L(由Christian Dhring博士惠贈，Basel免疫學研究所，Basel，瑞士(Dhring等1994))組織培養上清液中分離CTLA4，並與FITC偶聯的羊抗人IgG(Sigma)一起使用。以CD28介導的T細胞共刺激試驗確定hB7.1的生物學活性。在抗-CD25單克隆抗體(33B.1克隆大鼠IgG2a，Immunotech)存在或不存在的條件下，將hB7.1表達細胞與已在2-4μg/ml PHA-P存在的條件下接受T細胞受體/CD3複合體激活的Jurkat T-細胞共培養後，按如上所述的ELISA法確定IL-2的生成。結果載體構建人IL-2/B7.1.構建克隆了IL-2和B7.1編碼序列，並在這兩種cDNA之間插入了弗林蛋白酶識別位點的兩種逆轉錄病毒載體(圖2)，該載體包含可調控單順反子信使RNA轉錄的莫洛尼鼠類白血病病毒(MoMLV)長末端重複序列(LTR)。這兩種載體中，IL-2編碼序列後是不帶信號肽的成熟B7.1的編碼序列(pWZLIL2/B7M，見圖2a)，或包含信號肽的B7.1全長編碼序列(pWZLIL2/B7F，見圖2b)。IL-2/B7.1序列後接腦心肌炎病毒(ECMV)內部核糖體進入位點(IRES)，它可使得blast基因翻譯從而賦予對殺稻瘟菌素S的抗性。在這兩種載體中，IL-2信號肽負責引導嵌合IL-2/B7.1蛋白質轉運到內質網(ER)。由這些載體編碼的嵌合蛋白質應該被轉運到高爾基體並通過B7.1跨膜結構域將蛋白質錨定在膜上。這樣可使弗林蛋白酶在高爾基體內切割該嵌合蛋白質，從而產生細胞膜結合的B7.1和分泌的IL-2。
在對照載體pWZLB7/IL2M(圖.2C)中，IL-2和B7.1cDNA的相對位置被顛倒。在該載體中以B7.1的信號肽代替IL-2的信號肽用來將融合蛋白轉運入內質網中。在此構型下，B7.1跨膜結構域的存在阻止了融合蛋白質的羧基端部分(包含B7.1胞質區、弗林蛋白酶切割位點和成熟的IL-2)進入內質網腔內。因此，由於弗林蛋白酶的識別位點在高爾基體的外面，不能發生弗林蛋白酶位點的切割。編碼IL-4/IL-2和IL-4/B7.1的載體為檢查本策略的普遍適用性，應用相同的方法構建其它的融合蛋白質。載體pWZLIL4/B7M編碼在B7.1和IL-4之間包含弗蛋白酶位點的嵌合IL-4/B7.1蛋白質(圖2d)。載體pWZLIL4/IL2M編碼由弗林蛋白酶切割位點分隔的嵌合IL-4/IL-2蛋白質(圖2e)。這些載體應該編碼分泌的細胞因子和膜錨著B7.1。
將所描述的每種質粒導入逆轉錄病毒包裝細胞中，接著用blast抗性篩選，分離兼嗜性和親嗜性逆轉錄病毒生產細胞系。用這些載體轉導靶細胞並分析所編碼的融合基因的表達和功能活性。編碼IL-12(p40和p35)和IL-2/IL-12的載體構建另外兩種載體(見圖2F和2G)。載體F包含cDNA間帶弗林蛋白酶識別位點的IL-12p40和p35亞基的cDNA。載體G是一種具有兩個IL-12 cDNA(p35和p40)和IL-2編碼序列的三重載體(triple vector)，三個編碼序列被兩個弗林蛋白酶位點所隔開。
在載體F和G中唯一的信號肽存在於p40片段之中。去除p35和IL-2的信號肽以克服嵌合融合蛋白質中多信號肽的存在而可能引發的幹擾。弗林蛋白酶識別序列的存在能夠使嵌合融合蛋白被切割成其構成產物。
通過ELISA測量發現，表達含有弗林蛋白酶識別序列的構建體的細胞明顯生產細胞因子(圖7，表1)。當弗林蛋白酶靶序列位於IL4和IL-2之間時，這兩種細胞因子均被分泌到培養基之中。同樣，以FACS分析表明，編碼帶有分隔性弗林蛋白酶位點的嵌合IL-2/B7.1或IL-4/B7.1的載體之中，B7.1有細胞表面表達(圖3)。但是，一小部分嵌合蛋白質沒有被切割。通過檢測細胞表面的細胞因子(圖8，表2)和利用IL-2抗體捕獲和用IL-4抗體檢測或反之(沒有提供數據)的試驗中嵌合IL-2/IL-4的ELISA檢測中，可證實這一點。後面的實驗表明未切割產物的水平依賴於細胞類型，可能反映了細胞內源性弗林蛋白酶的表達水平。有趣地是，如果B7.1部分和IL-2均包含信號肽，則細胞因子的釋放量相當少(差別大於80倍)(表1)。這種細胞因子生成減少的確切機制還不清楚，但可能是由於融合蛋白質插入內質網或隨後在高爾基體內弗林蛋白酶的切割受到幹擾而引起。自這些載體感染的細胞生成膜錨著型B7.1和分泌型的細胞因子依賴於弗林蛋白酶切割位點的存在。在缺乏弗林蛋白酶位點的條件下，則沒有細胞因子被分泌到培養基中(數據未顯示)。同樣，如果弗林蛋白酶切割位點被置於能夠阻止它進入內質網腔內的構象之中，阻斷它靠近高爾基體中的弗林蛋白酶，則沒有細胞因子的釋放。這在轉導了B7.1分子(表1)胞質區連有弗蛋白酶識別位點的pWZLB7/IL2M(見圖2C)的細胞中可明確證明。在該構型中，弗林蛋白酶的切割位點留在胞質中，不進入內質網腔，從而無法接近高爾基體內的弗林蛋白酶。但以FACS分析(圖3)明確地顯示了B7在細胞表面的表達。融合基因產物的生物學活性pWZLIL2/B7M和pWZLIL2/B7F感染細胞系的上清液的CTLL增殖試驗為確定分泌的細胞因子的生物學活性，檢測了它們促進細胞因子依賴性CTLL細胞的增殖效應(3H-胸腺嘧啶摻入)。以pWZLB7/IL2M載體轉導的細胞產生的T細胞生長因子(TCGF)顯著地多於以pWZLB7/IL2F轉導的細胞。這與基於EILSA的細胞因子水平檢測結果相一致，(見表1)。
為確定包裝細胞培養上清液之中的IL-2誘導CTLL細胞的增殖，進行了抗體封閉實驗。中和性IL-2抗體能夠阻斷上清液對CTLL的促增殖，但不相關抗體阻斷效率甚低(圖4)。
同樣，在CTLL細胞(圖5)上檢測pWZLIL4/B7M或pWZLIL4/IL2M轉導的細胞產生的IL-2和IL-4的生物學活性(圖5)。這些細胞對IL-2反應性顯著高於對IL-4的反應性，因此，添加中和性IL-4抗體對CTLL細胞的增殖影響很小。但在中和性IL-2抗體存在的條件下，加入IL-4抗體能夠減少胸腺嘧啶的摻入，表明這些細胞產生的IL-2和IL-4有生物學活性。以pWZLIL2/B7M轉導的GP+E86和GP+envAm12包裝細胞為刺激細胞的Jurkat共刺激試驗為確定轉導細胞表面表達的B7.1分子是有生物學活性的，進行Jurkat共刺激試驗。Jurkat細胞與pWZLIL2/B7M轉導細胞及PHA-P的共培養增加了培養上清液中IL-2的水平(圖6)。如IL-2生成所測定的這種Jurkat細胞的激活是B7.1依賴性的，不能被通過抑制IL-2受體(CD25)阻斷。因此，pWZLIL2/B7M轉導細胞表達有生物學活性的B7.1分子，其能夠共刺激激活PHA-P處理後的Jurkat細胞。IL-12的生物學活性含IL-12的載體轉導的Cos7細胞上清的T細胞激活載體F(見圖2F)轉導的細胞內IL-12的生物學活性，以及載體G轉導的細胞內IL-12和IL-2的生物學活性按如下方法來確定。
通過誘導激活的人T細胞的生長來確定IL-12的生物學活性。這種生長作用通過測量細胞DNA之中放射性胸腺嘧啶的摻入來確定。按Coligan等人，免疫學現代方法，6.16章，「IL-12的淋巴母細胞增殖試驗」進行檢測。以如上所述的標準的CTLL試驗確定IL-2的生物學活性。表4表示分泌到以載體F和G轉導的細胞培養基之中的有生物學活性的IL-12和IL-2水平。靶細胞的轉化為觀察B7.1和IL-2在不同的細胞中的表達，感染一組組織培養細胞並檢測其B7.1和IL-2的表達。以pWZLIL2/B7M融合載體感染下列細胞系，並評估B7.1的細胞表面表達和分泌到培養基中的IL-2NIH/3T3小鼠成纖維細胞，32Dp210鼠髓細胞，K562人類紅白血病細胞和OIB人卵巢腺癌細胞。為確定未切割融合產物的存在，也以FACS試驗分析IL-2在細胞表面的存在(見表2)。IL-2-B7.1載體也用來轉染另外三種細胞系，即A431人子宮內膜腫瘤細胞系和兩個人卵巢細胞系SKOV-3和OVCA-432。總共檢測了40個克隆，所有細胞的B7.1表面表達和分泌到上清中的IL-2均為陽性(見表3)。
以電穿孔法轉導COS7細胞(見Sambrook，Fristsch和Maniatis，「分子克隆實驗指南」，冷泉港實驗室出版，1989)。討論此處描述的載體系統利用了弗林蛋白酶識別位點的存在從一個順反子表達分泌型和膜結合型的有生物學活性的蛋白質。如上描述，這種載體可以是質粒或者基於RNA或DNA病毒的載體。
應用內切蛋白酶切割位點能夠實現單順反子轉錄物的表達，該單順反子轉錄物翻譯成嵌合性融合產物，再被內切蛋白酶切割產生其組成成份。因此，蛋白質產物的摩爾比例由它們在載體之中的出現頻率決定。如果載體包含一個IL-2和一個IL-4編碼序列，則這兩種細胞因子將以等摩爾比例表達；如果包含2個IL-2和1個IL-4編碼序列，則這兩種細胞因子將以相應的2∶1的摩爾比表達。此外，包含不同的基因組合的7種構建體都能夠表達有生物學活性的蛋白質這一事實表明這種策略具有廣泛適用性。
不同細胞系中IL-2產生水平的差異很可能反映了弗林蛋白酶水平的差異和/或基因表達所涉及的不同過程的效率差異，和/或表達產物的穩定性差異。NIH/3T3細胞的IL-2產生水平顯著低於32Dp210、K562和OIB細胞中所觀察到的IL-2水平。這與這些NIH/3T3細胞表面上FACS可檢測到的高水平的IL-2相一致。細胞表面上IL-2的存在不是緣於IL-2非特異性的結合在細胞上，因為當IL-2生產細胞與IL-2非生產細胞混合後，用FACS試驗可檢測到兩種不同的細胞群(結果未提供)。因此，細胞表面上的IL-2可能仍與B7融合，提示這些細胞內內源性弗林蛋白酶未能有效地加工嵌合蛋白質。在COS細胞之中也觀察到這種減低水平的或低效率的弗林蛋白酶介導的加工。這些細胞僅生產小部分的vonWillebrand因子原(Wise等，1990，美國科學院研究進展，87，9378-9382)和大鼠胰島素原I(Smeekens等，1992，美國科學院研究進展，89，8822-8826)，而這兩種蛋白質都可被弗林蛋白酶正常地加工成其有生物學活性的產物。以編碼弗林蛋白酶的載體共轉染COS細胞可以使兩種系統中蛋白質的分泌增加(Wise等，1990，美國科學院研究進展，87，9378-9382；Smeekens等，1992，美國科學院研究進展，89，8822-8826)。因此，在內源性弗林蛋白酶水平低的細胞之中，引入弗林蛋白酶表達載體可能會提高弗林蛋白酶的水平，這樣可增加對插入弗林蛋白酶切割位點的嵌合蛋白質的切割。此外，改變弗林蛋白酶切割位點本身也能夠提高切割效率。在中國倉鼠卵巢細胞中，胺基酸序列Arg-X-Lys-Arg可使50％的蛋白質前體被切割，而序列為Arg-X-Arg-Arg僅使30％的蛋白質前體被切割(Watanabe等，1992，生物化學雜誌，267，8270-8274)。最後，使用組織特異性的內切蛋白酶切割位點，而不是廣泛表達的弗林蛋白酶，將引入更高水平的特異性，從而在特定的組織中生產有生物學活性的目的組分。這樣將達到更高水平的靶向性(不僅僅是組織特異性送遞和轉錄)，可能是許多應用中特別具吸引力的策略，這些應用包括以細胞或組織特異性的方式對先天的或其它方式的組織或器官特異性遺傳病進行基因治療，或送遞有細胞毒性的，抑制細胞的或促分化的蛋白質或多肽，或具有將藥物前體轉化成有活性藥物的催化活性的蛋白質(藥物轉化酶)。利用這種組織特異性內切蛋白酶識別位點以實現組織特異性加工和激活原本無活性的嵌合蛋白質是本發明的另外一個優點。
除描述過的在質粒和逆轉錄病毒為基礎的載體中融合基因的活性，本發明者也獲得了腺病毒載體中有活性的證據。將B7.1/IL-2表達盒克隆入腺病毒載體(E1缺失的Ad5載體)。用該載體感染一個已建立的細胞系(HeLa)和自三個AML病人分離得到的原代急性髓系白血病細胞(AML)。對每一種細胞群體的測試結果表明有高水平的B7.1細胞表面表達，感染細胞的培養上清液中分泌的IL-2的量超過20ng/106細胞/24小時。
權利要求
1.一種用以表達兩種或多種多肽的核酸構建體，其包含編碼第一多肽的第一序列和編碼第二多肽的第二序列，所述的第一和第二序列被編碼內切蛋白酶切割位點的接頭序列所分隔。
2.根據權利要求1的核酸構建體，其更進一步包含位於編碼內切蛋白酶切割位點的接頭序列任何一側的間隔序列。
3.根據權利要求2的核酸構建體，其中間隔序列包含編碼至少兩個胺基酸的核酸。
4.根據上述權利要求中任何一項的核酸構建體，其中接頭序列包含編碼Arg.X.Y.Arg的核酸序列，此處X是任何一種胺基酸殘基，Y是賴氨酸或精氨酸。
5.根據權利要求4的核酸構建體，其中接頭序列包含編碼Arg.Gly.Arg.Arg.，Arg.Pro.Lys.Arg.，或Arg.Tyr.Arg.Arg的核酸序列。
6.根據上述權利要求中任一項的核酸構建體，其中接頭序列包含AGG-GGT-CGA-CGC，CGG-CCT-AAG-AGG，或AGG-TAC-CGC-AGG。
7.根據權利要求2-6中任一項的核酸構建體，其中接頭序列和間隔序列編碼Gly.Gly.Arg.Gly.Arg.Arg.Gly.Gly.，Gly.Arg.Pro.Lys.Arg.Pro.，或Gly.Gly.Arg.Tyr.Arg.Arg.Gly.Gly。
8.一種載體，其中包含根據上述權利要求中任一項的核酸構建體。
9.一種宿主細胞，其中包含根據權利要求8的載體或根據權利要求1-7中任一項的核酸構建體。
10.在細胞中表達兩種或多種多肽的方法，包括以下步驟a)構建根據權利要求1-7中任一項的核酸構建體；b)以所述的核酸構建體轉染所述細胞，使所述核酸構建體得以表達，從而生成包含由能夠被細胞內的內切蛋白酶切割的內切蛋白酶切割位點連接的第一和第二多肽的融合蛋白質，進而產生單個具有生物學活性的第一和第二多肽。
11.根據權利要求10的方法，其中核酸構建體是核酸載體的一部分。
12.根據權利要求11的方法，其中載體是一種病毒載體。
13.根據權利要求12的方法，其中病毒載體是一種逆轉錄病毒載體或一種基於腺病毒的載體。
14.根據權利要求12或13的方法，其中病毒載體首先轉染入病毒包裝細胞系中以產生病毒，之後用該病毒轉染或感染細胞。
15.產生兩種或多種多肽的方法，包括以下步驟a)構建根據權利要求1-7中任一項的核酸構建體；b)以所述的核酸構建體轉染細胞，使該核酸構建體得以表達，從而生成包含由能夠被細胞內的內切蛋白酶切割的內切蛋白酶切割位點連接的第一和第二多肽的融合蛋白質，進而產生單個具有生物學活性的第一和第二多肽；和c)單獨地或聯合地從細胞中分離所述的兩種或多種多肽。
16.根據權利要求15的方法，其中第一和第二多肽是蛋白質的亞基。
17.根據權利要求16的方法，其中第一和第二多肽是IL-12的亞基。
18.根據權利要求17的方法，其中更進一步包括製備多肽用於工業、診斷或治療用途的一個或多個附加步驟。
19.生產細胞疫苗的方法，包括以下步驟a)構建根據權利要求1-7中任一項的核酸構建體，其中第一和/或第二多肽能夠刺激免疫應答；b)將所述核酸構建體插入核酸載體之中；d)用所述載體轉化細胞，從而使第一和/或第二多肽被分泌或表達，並被展示在細胞表面上。
20.根據權利要求19的方法，其中細胞是腫瘤細胞。
21.根據權利要求19或20的方法，其中第一和第二多肽是IL-12的亞基。
22.根據權利要求1-7中任一項的核酸構建體或根據權利要求8的載體，其用於人體或動物體的治療方法中。
23.根據權利要求1-7中任一項的核酸構建體或根據權利要求8的載體在製備可用於基因治療方法的藥物中的用途。
24.根據權利要求19-21中任一項的方法可以獲得的細胞疫苗，其可用於接種人體或動物體。
全文摘要
本發明涉及與基因表達相關的材料和方法。尤其涉及以一單順反子表達多基因產物。通過構建包含編碼第一多肽(例如蛋白質亞基)的第一序列和編碼第二多肽(例如另一蛋白質亞基)的第二序列的核酸構建體可實現本發明的目的,所述的第一和第二序列被編碼內切蛋白酶切割位點的接頭序列所分隔。一旦被表達成單個融合蛋白質,該蛋白質可以被切割並加工成其組分,即有生物學活性的第一和第二多肽。本發明在有關各亞基需要以等摩爾量表達的多亞基蛋白質(例如IL－12)的表達中特別有用。
文檔編號A61P37/00GK1308679SQ9980829
公開日2001年8月15日 申請日期1999年5月21日 優先權日1998年5月21日
發明者J·A·蓋肯, F·法贊尼, S·J·魯塞爾 申請人:癌症研究風險有限公司