一種核酸等溫擴增檢測結核分枝桿菌活菌的方法及試劑盒的製作方法
2023-05-22 15:31:36 3
專利名稱：一種核酸等溫擴增檢測結核分枝桿菌活菌的方法及試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，具體涉及結核分枝桿菌活菌核酸擴增檢測技術。
背景技術：
自1882年Koch發現結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)是結核 病的病原菌以來的100餘年，人類對結核分枝桿菌的生物學特性、致病機制、耐藥機制、診 斷方法、抗結核藥物的研製等方面都取得了巨大的成就。而如今，結核病仍然是影響人類健 康流行性最廣、病死率最高的感染性疾病之一。尋求快速、準確的診斷方法一直是結核病學 首要研究的領域。 近IO年來，隨著分子生物學的發展，對結核分枝桿菌DNA的檢測研究頗多，和培養 方法比較，DNA檢測的高敏感、高特異和快速性給結核病的診斷帶來新的期望。但DNA作為 半衰期較長的穩定核酸分子，據研究報導，在接受標準有效治療的肺結核患者痰標本中，培 養轉陰後180天仍有25%的標本DNA檢測陽性。可能的原因解釋是標本中有死菌和DNA降 解的延滯、L型培養以及持留菌和休眠菌的存在等。可見，以DNA為基礎的檢測，存在平臺 效應，不能用於結核分枝桿菌的活菌診斷。 核糖體RNA(rRNA)是生物細胞核糖體內的遺傳物質，在原核生物中有多個拷貝存 在，每個結核分枝桿菌的rRNA有近5000個拷貝。有學者在觀察分枝桿菌體內外死亡降解 的過程時發現，核糖體是第一個伴隨細菌活力消失而降解的超微結構，因而認為rRNA可作 為結核分枝桿菌的活菌標誌。Van derVliet等通過體外擴增16S rRNA進行分枝桿菌活菌 檢測和藥敏試驗時發現，該方法能在3 7天內獲得藥敏試驗結果，可計算出各種藥物的藥 效學參數。但Hellyer等(J Clin Microbiol, 37 (2) :290-295,1999)的研究結果顯示結 核分枝桿菌的rRNA水平在含藥培養基中72h內無明顯變化。Moore等(J ClinMicrobiol， 34(7) :1745-1749， 1996)通過臨床觀察發現，rRNA也顯示平臺效應。所以，rRNA在用於結 核分枝桿菌藥敏試驗和化療監測時仍存在很大的局限性，也不能用於結核分枝桿菌的活菌 診斷。 原核生物的mRNA分子，半衰期很短(僅有3 5min)，僅存在於活的、有代謝活性 的菌體中，一般認為mRNA是一活性增殖細胞的很好的分子標記物。所以，以mRNA為靶標的 檢測只能是活菌，是監測藥物敏感性和化療反應的很好的分子指標。結核分枝桿菌的85-B mRNA編碼的蛋白85-B，是結核分枝桿菌的主要分泌性蛋白抗原複合物85的組成之一，該抗
原複合物作為結核分枝桿菌的特異性分泌蛋白，在液體培養基和巨噬細胞系統中表達非常 豐富，所以活菌細胞內存在豐富的85-B mRNA分子。Desjardin等(Am J RespirCrit Care Med，160 :203-210,1999)研究了經藥物治療肺結核患者痰液樣本中提取的結核分枝桿菌 85-B mRNA、16S rRNA以及IS110DNA含量和塗片染色、培養結果的關係，顯示塗片培養測得 的活菌數量與85-B mRNA含量相關性最好。因此，選擇85-B mRNA為靶標可準確檢測結核 分枝桿菌的活菌。 在核酸檢測過程中，多數情況下樣本中的核酸含量較低，為了使檢測達到一定的靈敏度和準確度，需要對樣本中的待測核酸片段進行有效擴增，目前聚合酶鏈式反應 (Polymerase Chain Reaction,PCR)和進一步發展的實時螢光PCR技術已經成為核酸擴增 檢測的主流技術手段，用於核酸模板的擴增及定性定量檢測。雖然實時螢光PCR技術檢測 具有靈敏、快速的優點，但檢測時需昂貴的循環變溫設備、操作嚴格分區等因素而限制了其 在基層醫院的推廣使用。目前，採用實時螢光PCR技術檢測結核分枝桿菌，擴增的是樣本中 的總DNA，不能剔除樣本中的死菌，因此不能用於結核分枝桿菌的活菌檢測。
1991年Compton提出了基於核酸序列的擴增技術(Nucleic Acid SequenceBased Amplification, NASBA) (Nature, 350 (6313) :91 92， 1991)，為基因擴增技術提出了新的 概念。該技術是以RNA分子的逆轉錄-轉錄為技術主線，通過單向恆溫擴增，短時間內形 成相當於原RNA拷貝數近百萬倍的RNA擴增子，最後擴增產物通過電化學發光儀器檢測。 1997年，Gen-Probe公司也開發了與NASBA原理類似的轉錄介導擴增技術(Transcription MediatedAmplification， TMA)(Journal of Clinical Microbiology,35 (3) :676-678， 1997)，其與NASBA的核酸擴增方法原理相同，而TMA的擴增結果是通過雜交保護測定 (Hybridization Protection Assay,HPA)技術進行定性檢測。NASBA和TMA等核酸恆溫擴 增檢測技術無需進行類似於PCR過程的溫度循環，因此擴增不需要複雜昂貴的螢光PCR儀 器；同時由於擴增模板是RNA，即使在有DNA汙染或存在的情況下，同樣具有較高的特異性 和靈敏度。 納米金探針檢測技術是一種新型的核酸檢測方法，它利用納米金顆粒標記的寡核 苷酸探針與核酸靶序列雜交，形成伸展的納米金顆粒一多核苷酸的多聚網絡結構，由此引 發納米金粒子光學性質的變化，產生雜交信號以雜交液/板/試紙顏色變化顯示，存在相互 作用的雜交液/板/試紙顯示為藍色或藍紫色，沒有作用的顯示為紅色，微量核酸通過雜交 信號的放大從而被檢測。如果納米金探針檢測技術結合NASBA或TMA等類似RNA等溫擴增 技術，微量模板可通過擴增的模板拷貝數和納米金探針檢測的顯色信號兩級放大而得到檢 測。基於這種RNA核酸等溫轉錄擴增和納米金探針檢測方法(Nucleic Acidlsothermal and Transcriptional Amplification with Gold Nano—particle Probes,NITAG)，擴增檢領lj結 核分枝桿菌的85-B mRNA模板，就能實現結核分枝桿菌的活菌檢測，該技術具有無需特殊昂 貴設備、檢測靈敏快速、結果直觀可見等優點，適合於基層醫療機構的推廣應用，目前NITAG 技術在活菌檢測中應用尚無報導。
發明內容
所要解決的技術問題 本發明所要解決的技術問題是提供一種基於NATAG技術的結核分枝桿菌活菌檢 測方法和試劑盒，為結核分枝桿菌活菌的檢測、治療藥物療效觀察、抗結核藥物篩選和藥敏 實驗等研究的提供輔助實驗手段。結核分枝桿菌的藥物敏感性試驗，特別是治療療效的評 價對活菌的存在有嚴格的依賴性，因此，結核分枝桿菌活菌的檢測具有重要的臨床意義及 廣泛的應用價值。
技術方案 本發明提供一種基於NITAG技術擴增結核分枝桿菌活菌靶基因85-BmRNA的寡聚 核苷酸引物對和探針，其中引物對具有SEQ ID N0:1和SEQID N0:2的序列(SEQ ID NO :25，端含有能被T7RNA聚合酶識別的啟動子序列)；檢測探針具有SEQ ID NO :3和SEQ ID NO : 4的序列(前者5'端和後者3'端分別經過己烷巰基化處理)，捕獲探針具有SEQ ID NO :5 的序列(5'端生物素Biotin標記)。
SEQ ID NO 1 :5， -ggCTgCCAgACTTACAAgTg-3， SEQ ID N02 :5' AATTCTAATACgACTCACTATAggg gTAggCggCCAAgATCATTg-3， SEQ ID N03 :5， HS_(CH2)6_[TTgTCCgCCAACAgggCC] SEQ ID N04:5， [CgCTgCAATCggCTTgTCg]-(CH2)6_SH3， SEQ ID N05 :5， BI0TIN-CCTTCCTgACCAgCgAgCTg-3， 或者包含有上述序列的向5'端或/和3'端延長的序列； 或者與上述序列同源性大於85 %的序列； 或者上述序列的鹼基互補序列； 或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。 在實施方案中，本發明提供一種基於NITAG技術的85-B基因擴增的檢測樣本中結
核分枝桿菌的方法和試劑盒，所述方法包括步驟
(l)mRNA模板在60 7(TC下解鏈後降溫； (2)加入逆轉錄酶、RNase H和RNA聚合酶，在引物的引導下於37 42。C進行等 溫擴增，獲得RNA擴增子； (3)利用納米金顆粒標記的寡核苷酸檢測探針和生物素標記的寡核苷酸捕獲探針 檢測RNA擴增子，通過在層析膜的顯色反應獲得檢測結果，顯色條帶的存在是樣品中結核 分枝桿菌的指示。 本發明提供一種利用上述檢測方法進行MTB mRNA等溫擴增的檢測試劑盒，其組成 為NITAG反應緩衝液、納米金顆粒標記的寡核苷酸檢測探針、生物素(或地高辛)標記的 寡核苷酸捕獲探針、以及固定有親和素(或抗地高辛抗體)標記的層析膜。組裝形成的試
劑盒在-2(rc下保存。 具體而言，本發明是通過以下方式實現的 本發明的結核分枝桿菌mRNA NITAG檢測技術包括樣本處理、mRNA等溫擴增以及 納米金探針檢測三個步驟。樣本處理步驟是從痰液、活檢組織等樣本或結核分枝桿菌培養 物等待檢樣品中提取mRNA模板的過程，擴增檢測對象是從樣本中提取獲得的mRNA模板。 利用提取獲得的結核分枝桿菌mRNA模板經過逆轉錄酶、核糖核酸酶H(RNase H) 、 RNA聚合 酶(RNA Pol)等溫擴增出的大量RNA擴增子，並結合烷巰基化寡核苷酸標記的納米金探針 檢測，通過層析膜顯色反應實現對RNA模板的檢測。 本發明的等溫擴增體系包括RNA模板、引物及緩衝液等組成，檢測體系包括納米 金探針、捕獲探針及緩衝液等組成，其具體操作為將待測標本提取的RNA置入反應緩衝 液，在60 70 (最優選65) t:和37 42 (最優選41) 。C下先後處理5min，加入混合酶，在 37 42(最優選41)t:下反應90 120min ;然後再將RNA擴增產物與納米金檢測探針以 及生物素標記捕獲探針緩衝液混合檢測，在37 65t:處理5min冷卻後在膜上層析顯色。
本發明的等溫擴增反應緩衝液各組分的終濃度為20 60mM Tris-HCl (pH8. 0 9. 0)、30 90mM KCl、10 20mM MgCl2、0. 5 5mM脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs) 、 1 10mM 核糖核苷三磷酸(NTPs)、4 20mM二硫蘇糖醇(DTT)、10 20% (v/v) 二甲基亞碸(DMSO);所說的兩種引物(包括帶有RNA聚合酶啟動子識別序列的引物I和第二鏈cDNA合成引物 II)終濃度各為0. 1 1 mol/L ;所說的混合酶液各組分在20 P L反應體系中的量為4 75U逆轉錄酶、8 3000U RNA聚合酶(識別特異啟動子序列的T3RNA聚合酶或T7RNA聚 合酶)、0. 05 0. 3U RNase H酶、10 50U RNA酶抑制劑(RNasin Inhibitor)和0. 05 5iig小牛血清白蛋白(BSA)。所說的檢測反應緩衝液各組分的終濃度為0.3mol/L NaCl， lOmM磷酸鹽緩衝液(pH 7.0)， 5 ii mol/L納米金探針、lii mol/L生物素標記捕獲探針。層析 膜為固定有親和素的硝酸纖維膜或尼龍膜(保存於乾燥環境)。 本發明所用的納米金顆粒大小為1 lOOnm，按照粒徑不同可以採用檸檬酸三鈉 還原法、白磷還原法或者抗壞血酸還原法。 本發明所述納米金寡核苷酸檢測探針的製備過程為 (1)納米金顆粒的製備在煮沸攪拌HAuCl4溶液(lmM，500mL)回流的情況下，迅速 加入50mL 38. 8mM檸檬酸三鈉溶液，溶液的顏色將由灰黃變為深紅，繼續回流15min，然後 冷卻至室溫，最後用0.45yM的膜進行過濾，即得到約13nm粒徑的金顆粒。這種納米金溶 液具有518 520nm處的特徵表面等離子體吸收峰。納米金顆粒上的寡核苷酸探針長度為 10 100bp，連接前需要先經過巰基化或烷巰基化處理並純化。 (2) 3'或5'烷巰基標記的寡核苷酸在納米金顆粒上的修飾取納米金溶液5mL(約 17nm)2. 50D烷基寡核苷酸探針(由上海生工合成，稀釋終濃度3.61ymol/L)混合併孵育 16小時左右，然後將混合溶液置於0. lmol/L NaCl， lOmM磷酸鹽緩衝液中並保持40小時，接 下來在1400r/min至少離心25min以除去未反應的試劑。除去上清液，剩餘的紅色油狀沉 澱再用緩衝液清洗，離心後保存在O. 3mol/L NaCl，10mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.0)中，探針終 濃度為10iimol/L。通過紅外光譜的測定證明，每個金顆粒表面被修飾了許多探針，因此才 有可能在多核苷酸檢測過程中形成聚合網絡結構。 (3)層析膜的製備將2mg/ml親和素以2iU/cm的量加到纖維膜或尼龍膜上，在 溼度40^、溫度4(TC的環境內自然乾燥3小時；然後將膜貼於撕去不乾膠的硬紙板上，上端 用濾紙覆蓋層析膜、壓緊貼上不乾膠固定，最後用割膜機切割成4mm寬的試紙條狀備用(保 存於乾燥環境)。 本發明檢測過程中的層析膜顯色反應為溶液雜交後層析顯色過程。溶液雜交顯色 法即將等溫擴增產物10 ii L(約lOpmol)加入至含有20 ii L納米金-烷巰基化寡核苷酸檢 測探針、10ii L生物素化捕獲探針的1. 5mL離心管中，室溫孵育15min，然後將混合溶液置於 恆溫水浴槽中並將其加熱到65t:，將混合物平衡5min，最後放入層析膜試紙條、經過5 10min後進行觀察，如果納米金探針與擴增產物靶序列雜交，會在膜上形成藍紫色的條帶， 從而顯示結核分枝桿菌的存在，否則將不會出現條帶。
有益效果 本發明建立了利用NITAG技術檢測結核分枝桿菌活菌的方法，從原理上分析，等 溫擴增和納米金探針均能放大檢測信號，等溫擴增放大的是RNA分子的拷貝數，納米金探 針放大的是顯色信號，加上層析步驟使顯色的雜交複合物聚集為一個窄小條帶，結果觀察 更為簡便和直觀，所以比NASBA、 TMA技術更靈敏，使實際應用於微量RNA檢測成為可能；由 於擴增過程中沒有大量性質穩定的雙鏈DNA產生，因此比PCR檢測能更好地排除擴增片斷 的汙染所帶來的假陽性對檢測結果的影響。
採用本發明技術，結核分枝桿菌活菌的mRNA擴增效率、檢測靈敏度和特異性大大 的提高，並降低了 PCR擴增檢測的假陽性率。本發明的技術方案設計合理，樣本實驗能在分 子水平上證明結核分枝桿菌活菌的存在，表明該方法切實可行。基於NATAG技術的結核分 枝桿菌活菌檢測方法和試劑盒，可以作為結核分枝桿菌活菌檢測、治療藥物療效觀察、抗結 核藥物篩選和藥敏實驗等研究的提供輔助實驗手段，具有重要的臨床意義及廣泛的應用價 值。
圖1為NITAG擴增檢測結核分枝桿菌mRNA技術原理示意圖
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明 而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人 員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定 的範圍。 下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如分子克隆操作 手冊，或按照製造廠商所建議的條件。所有無機化學試劑和有機溶劑購自上海化學試劑廠， Trizol試劑購自Invitrogen公司，限制性內切酶購自上海申能博彩生物公司，逆轉錄AMV 酶、T7RNA聚合酶、RNase H、 RNase Inhibitor和BSA均購自美國Promega公司，引物和探 針均由上海生工公司合成。
實施例1 結核分枝桿菌培養物的NITAG檢測 以下通過介紹結核分枝桿菌培養物提取的mRNA NITAG檢測來舉例說明本發明的 實施。 細菌培養結核分枝桿菌H37Rv株(ATCC 27294)用米氏(Middlebrook) 7H9肉湯 培養7 14天，收穫菌體並用4mm玻璃珠振蕩5 10min打散，生理鹽水稀釋使用。
RNA提取:取250iil生理鹽水稀釋後的結核分枝桿菌培養物，加入500ia Trizol 提取試劑，用移液器反覆吹打混勻，室溫放置5分鐘，加入200 氯仿，用手來回振蕩混勻 15秒，室溫放置5分鐘，4t: 12，000rpm離心15分鐘，將上清移入新的離心管，加入200 異丙醇，旋渦振蕩5秒，冰浴沉澱10分鐘，4°C 12， OOOrpm離心10分鐘，棄上清，加入500 y 1 預冷的DEPC水配製的75%乙醇洗滌，上下顛倒10次，4" 10， 000rpm離心5分鐘，吸乾上 清，沉澱室溫乾燥10-20分鐘，加入10 ii 1 DEPC處理的水稀釋混勻，立即使用或-7(TC保存 (使用前可加入10iU DEPC處理的水稀釋混勻)。然後加入3iillOXDNase I緩衝液、7iU RNase inhibitor, DNaseI 10 ii 1，37。C溫育15分鐘後加入1 P 1 10mM EDTA65。C 15分鐘滅 活DNaseI，短暫離心後直接用於NITAG等溫擴增。 NITAG擴增檢測:取5 y L的提取處理後的RNA模板置入10 y L2x等溫擴增反應體 系緩衝液，在65"和4rC下先後處理5min，加入5 y L混合酶液，在41。C下反應120min ;取 10 ii L等溫擴增產物加入至含有20 ii L納米金-烷巰基化寡核苷酸探針、10 P L生物素化捕 獲探針的1. 5mL離心管中，室溫孵育15min，然後將混合溶液置於恆溫水浴槽中並將其加熱到65t:，將混合物平衡5min，最後放入層析膜試紙條、經過5 10min後進行觀察，層析膜 上形成藍紫色的條帶，說明結核分枝桿菌mRNA檢測陽性(即有活菌存在)。
實施例2 臨床肺結核患者痰液樣本的NITAG檢測 前處理方法:在結核病患者清晨深咳痰標本中加入lml 2. 5%的N-乙醯基_L_半 胱氨酸(NALC)後，轉入含有4mm玻璃珠的試管中振蕩，勻漿後的痰液標本於-7(TC保存待 RNA提取。 RNA提取取500 y 1勻漿後的痰液標本，加入1000 y 1 Trizol提取試劑，用移液 器反覆吹打混勻，室溫放置5分鐘，加入200 ii 1氯仿，用手來回振蕩混勻15秒，室溫放置5 分鐘，4t: 12，000rpm離心15分鐘，將上清移入新的離心管，加入200 iU異丙醇，旋渦振蕩 5秒，冰浴沉澱10分鐘，4°C 12， OOOrpm離心10分鐘，棄上清，加入500 y 1預冷的DEPC水 配製的75%乙醇洗滌，上下顛倒10次，4°C 10， OOOrpm離心5分鐘，吸乾上清，沉澱室溫幹 燥10-20分鐘，加入10 ii 1 DEPC處理的水稀釋混勻。然後加入3 ii 1 10XDNase I緩衝液、 7ii 1 RNaseinhibitor，DNaseI 10 ii 1，37。C溫育15分鐘後加入1 ii 110mM EDTA 65°C 15分 鍾滅活DNaseI，短暫離心後直接用於NITAG等溫擴增。 NITAG擴增柃測:取5 y L的提取處理後的RNA模板置入10 y L 2x等溫擴增反應 體系緩衝液，在65"和4rC下先後處理5min，加入5ii L混合酶液，在41。C下反應120min ; 取10 ii L等溫擴增產物加入至含有20 ii L納米金-烷巰基化寡核苷酸探針、10 P L生物素化 捕獲探針的1. 5mL離心管中，室溫孵育15min，然後將混合溶液置於恆溫水浴槽中並將其加 熱到65t:，將混合物平衡5min，最後放入層析膜試紙條、經過5 10min後進行觀察，層析 膜上形成藍紫色的條帶，說明結核分枝桿菌mRNA檢測陽性(即有活菌存在)。
核苷酸序列表
SEQUENCE LISTING 〈110〉上海復星醫藥(集團)股份有限公司
上海復星醫學科技發展有限公司
復旦大學附屬華山醫院
吳大治，夏懿，呂元 〈120〉 一種核酸等溫擴增檢測結核分枝桿菌活菌的方法及試劑盒 〈130>MTB viability 〈140>CN 〈141>2008-10-10 〈160>5 〈170>PatentIn version 3. 3
〈210>1
〈211>20
〈212>DNA 〈213>Mycobacterium tuberculosis
〈400〉 1 ggctgccaga cttacaagtg20 〈210>2 〈211>45 〈212>DNA 〈213>Mycobacterium tuberculosis 〈400>2 aattctaata cgactcacta taggggtagg cggccaagat cattg 45 〈210>3 〈211>19 〈212>DNA 〈213>Mycobacterium tuberculosis 〈220〉 〈221〉己烷巰基 〈222>(1). (19) 〈223>y = HS-(CH2)6- 〈400>3 yttgtccgcc aacagggcc
19 〈210>4 〈211>20 〈212>DNA 〈213>Mycobacterium tuberculosis 〈220〉 〈221〉己烷巰基 〈222〉 (1) . (20) 〈223>y = - (CH2)6-SH 〈400>4 cgctgcaatc ggcttgtcgy
20 〈210>5 〈211>21 〈212>DNA 〈213>Mycobacterium tuberculosis 〈220> 〈221〉生物素 〈222〉 (1) (21) 〈223>y = biotin- 〈400>5
yccttcctga ccagcgagct 2權利要求
一種結核分枝桿菌核酸等溫擴增檢測活菌的方法，採用逆轉錄-轉錄和納米金探針檢測層析雜交原理，其擴增對象為從痰液、活檢組織等樣本或結核桿菌培養物中提取獲得的RNA模板；其特徵在於，RNA模板通過採用逆轉錄酶、核糖核酸酶H以及RNA聚合酶等溫擴增，產生的大量RNA擴增子和納米金顆粒標記的檢測探針、生物素(或地高辛)標記的捕獲探針結合形成雜交複合物引起光學性質變化，最後該複合物和固定在層析膜上親和素(或抗地高辛抗體)結合形成顯色檢測條帶。
2. 根據權利要求1所述的檢測方法，採用了擴增結核桿菌靶基因85-B mRNA的寡聚核苷酸引物和探針引物具有SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的序列，其中SEQ ID NO :25，端含有RNA聚合酶識別的啟動子序列；檢測探針具有SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4序列；捕獲探針具有SEQID N0:5序列。這些引物和探針或者是包含有上述序列的向5'端或和3'端延長的序列；或者與上述序列同源性大於85%的序列；或者上述序列的鹼基互補序列；或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。
3. 根據權利要求1所述的檢測方法，其步驟依次包括(1) RNA模板在60 7(TC下解鏈後降溫；(2) 加入逆轉錄酶、核糖核酸酶H和RNA聚合酶，在引物的引導下於37 42。C進行等溫擴增，獲得RNA擴增子；(3) 利用納米金顆粒標記的寡核苷酸探針檢測擴增子，並被生物素標記寡核苷酸探針結合捕獲，通過層析膜上的條帶顯色反應獲得檢測結果。
4. 根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，所說的逆轉錄酶為鳥成髓細胞瘤病毒逆轉錄酶或鼠白血病病毒逆轉錄酶；所說的RNA聚合酶為T3RNA聚合酶或T7RNA聚合酶。
5. 根據權利要求1和5所說的檢測方法，其特徵在於，所說的T3 RNA聚合酶所識別特異性啟動子序列為5'AAT TCA ATT AAC CCT CAC TAA AGGG3';所說的T7RNA聚合酶所識別特異性啟動子序列為5' AAT TCT AATACG ACT CAC TAT AGG G3'。
6. 根據權利要求l所述的檢測方法，其特徵在於，所用的納米金顆粒直徑為1 100nm，納米金顆粒上的寡核苷酸探針SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4長度為10 lOObp，且連接前經過巰基化或烷巰基化處理；所用的捕獲探針SEQ ID NO :5長度為10 50bp，其5'端可為生物素或地高辛標記。
7. 根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，所用的固定有親和素或抗地高辛抗體(對應於捕獲探針5'端標記生物素或地高辛)的層析膜為硝酸纖維素膜或尼龍膜。
8. 根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，所說的顯色反應為雜交後在層析膜上出現藍紫色顯色條帶。
9. 一種利用權利要求l所述檢測方法組裝的試劑盒，其組成為包含有引物I和II、逆轉錄酶、核糖核酸酶H、 RNA聚合酶的反應緩衝液、納米金顆粒標記的寡核苷酸檢測探針、生物素(或地高辛)標記的寡核苷酸捕獲探針、帶有親和素(或抗地高辛抗體)標記的層析膜。
10. —種利用權利要求1所述檢測方法組裝的結核分枝桿菌核酸等溫擴增檢測試劑盒，可以用於檢測痰液、活檢組織等樣本或結核桿菌培養物中的結核分枝桿菌活菌。
全文摘要
本發明涉及一種核酸等溫擴增檢測結核分枝桿菌活菌的方法及其試劑盒，檢測步驟依次包括結核分枝桿菌mRNA模板在60～70℃下解鏈後降溫；加入逆轉錄酶、核糖核酸酶H、RNA聚合酶，在引物的引導下於37～42℃進行等溫擴增，獲得RNA擴增子；然後利用納米金探針和捕獲探針檢測擴增子，通過層析雜交顯色反應獲得檢測結果。雜交膜出現顯色條帶為mRNA陽性(有活菌存在)，無條帶為陰性。採用本方法的試劑盒可檢測結核分枝桿菌活菌，具有準確靈敏、簡便快速等優點，能克服已有方法鑑定時間長、操作複雜、特異性低等不足，可作為結核病診斷和預防、治療療效觀察、抗結核藥物篩選和敏感性實驗等相關研究的輔助實驗手段。
文檔編號G01N21/77GK101736078SQ20081020223
公開日2010年6月16日 申請日期2008年11月5日 優先權日2008年11月5日
發明者呂元, 吳大治, 夏懿 申請人:上海復星醫藥(集團)股份有限公司;上海復星醫學科技發展有限公司;復旦大學附屬華山醫院