適於細胞移植的非人哺乳動物胚胎組織細胞、其製備方法和用途的製作方法

2023-05-22 22:28:31 4

專利名稱：適於細胞移植的非人哺乳動物胚胎組織細胞、其製備方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及適於細胞移植以改善個體健康狀況的非人哺乳動物胚胎細胞、其製備方法和用途。
背景技術：
自古以來，人類一直期望能夠有很好的方法用於改善健康狀況、延緩衰老、永葆青春，並因此進行了很多嘗試，取得了很大的進展。器官移植就是其中一種有效的治療方法。
目前，器官移植療法早已成功用於治療多種疾病。但是，由於許多器官疾病不適於採用全器官移植進行治療，例如中樞神經系統的損傷就無法採用全器官移植體來代替受損傷組織。在此基礎上發展出了細胞移植療法。
細胞移植療法就是向哺乳動物機體注射、移植或以其它方式放置細胞以改善個體健康狀況或進行疾病治療的方法。這一技術早在二十世紀三十年代就已發現。在一例急診外科手術中，瑞士Niehans醫生採用取自動物甲狀旁腺的細胞對一位瀕危病人進行注射，成功地延長了病人的生命。細胞療法發展到二十一世紀的今天，已經可以採用從動物母體的子宮中提取的發育過程中的胚胎的細胞。由於這樣的臟器處於發育和形成階段，被提取出來並給予人體後，很容易適應人體環境，為人體所接受。被移植的細胞可能通過幾種方式起作用。一種方式是被移植細胞取代人體細胞，自身合成、釋放天然生物活性化合物，例如生長因子、激素、神經遞質等。但是，不局限於任何特定的理論，推測「活細胞療法」的作用方式並不僅是如此，它還可誘發人體內現有機體的功能和生長。也就是說，動物的活細胞只是一種手段，用來「喚醒」病人體內處於「休眠」的細胞，以補充相應的細胞類型。德國一些大學的研究結果顯示，在將標記了放射性同位素的細胞注射到人體後，這樣的細胞將遷移到人體內與所述動物細胞來源的動物器官相應的器官處。根據疾病的不同，也根據病人本身狀況的不同，療效會有快慢，一般在6至8周之間。通過細胞療法，可以幫助健康人或病人恢復或增強本身臟器的機能，對付各種疾病的入侵。例如，細胞療法可以減緩衰老，包括記憶力減退和性功能障礙，活化機體內特定器官，並治療一些特定的疾病和障礙，包括例如慢性皮膚病如溼疹、過敏、牛皮癬等，關節炎，動脈硬化，肌肉萎縮，狼瘡，癌症，HIV感染，心血管和神經性障礙，各種先天性缺陷，思維和行動障礙，免疫系統疾病，以及帕金森病等。活細胞療法與器官移植相比有很大不同。例如，在活細胞療法中，細胞是以懸浮的形態進入人體，因而可以迅速地融入人體的新陳代謝過程中，而器官移植手術中常常會因失血導致器官移植後的壞死。尤其是，在眾多臟器中，有些不能移植，例如腦或其它內分泌腺，另有一些則很難移植，例如腎、心和肝等。對於這樣的臟器，採用細胞療法則在操作上比較容易。但是，活細胞療法有一個非常不利的缺點，即機體可能會對所注射的動物細胞產生過敏反應。一些現有技術中的「活細胞療法」嘗試採用動物胚胎細胞，因為推測這種細胞更容易為受體所接受，被移植細胞通過天然地釋放生物活性因子、例如生長因子、激素而彌補人的不足，實現抗衰老效果。
但是，在現有的細胞移植技術中，即使是採用胚胎細胞，其有效期常常仍較短，因而存在不能長期有效的缺點。這種有效期短推測有可能是由於異源細胞在移植到人體內後常常仍會引起較強的免疫排斥反應所致。現有技術中對於降低移植排斥反應進行了諸多嘗試，並已開發出了一些新技術，取得了一些效果。例如，可以對宿主使用免疫抑制劑，但是全身性地施用免疫抑制劑會非特異性地抑制免疫系統，從而給機體帶來嚴重的副作用和併發症。後來發展出了抑制包裹細胞療法，其中採用膜屏障物理性地保護被移植的細胞不受宿主免疫系統的影響。這種包裹細胞療法明顯優於免疫抑制劑療法。WO2004058305中就公開了這樣一種包裹細胞療法。另外，一些大型的生物醫藥公司目前正在開展一種新的降低免疫排斥反應的研究。在這樣的研究中，科學家們嘗試向豬的受精卵注射人體基因，使豬體內出現人體特有基因以及由此表達的蛋白質。因此，在將這種轉基因動物來源的組織細胞移植到人體後有望使移植組織受到的人受體免疫系統排斥作用顯著降低。
但是，現有技術中降低細胞移植療法中的免疫排斥作用的措施均比較麻煩，實施起來需要有複雜的設備，耗時也較長。本發明致力於提供一種簡便的製備移植細胞的方法，以便提供能在受體內較長時間發揮活性的細胞。

發明內容
在本發明中，發明人出乎意料地發現了，通過對懷孕的非人哺乳動物注射來自與待接受細胞移植的受體屬相同物種的動物的組織細胞，然後從該懷孕動物體內取出胚胎，由此製備的胚胎細胞在移植到所述受體動物之後可以延長移植細胞的活性期，並顯著地改善該受體動物的健康、美容狀況。
因此，在一方面，本發明提供了一種獲得適於移植的非人哺乳動物胚胎組織細胞的方法，包括以下步驟(1)將預處理組織細胞注射到懷孕的非人哺乳動物體內；(2)在進一步餵養該懷孕非人哺乳動物後從中取出胚胎；和(3)分離、消化胚胎組織器官，獲得非人哺乳動物胚胎組織細胞。
在另一方面，本發明涉及由上述方法獲得的非人哺乳動物胚胎細胞及其提取物。
本發明進一步涉及改善受試者健康狀況的方法，包括將本發明的非人哺乳動物胚胎細胞或提取物施用於受試者的步驟。
本發明進一步涉及一種美容方法，包括將本發明的非人哺乳動物胚胎細胞或提取物施用於受試者的步驟。
本發明還涉及本發明的非人哺乳動物胚胎細胞或提取物在改善個體健康狀況、美容和/或疾病治療中的用途。
具體實施例方式
術語「培養基」和「細胞培養基」可以互換，指培養過程中哺乳動物細胞生長其中的水性微環境。培養基包含物理化學、營養、和激素微環境。
「已知成分培養基」、「基本細胞維持培養基」、「營養培養基」、和「基本營養培養基」在本文中可以互換，指包含培養過程中細胞存活和/或生長所必需的營養和激素需求且其成分已知的培養基。通常通過加入生長和/或存活所必需的營養物和生長因子來配製已知成分培養基。已知成分培養基通常提供至少一種來自下列一項或多項的成分1)所有必需胺基酸，通常是基本的一套20種胺基酸加胱氨酸；2)能源，通常是碳水化合物的形式，諸如葡萄糖；3)維生素和/或有低濃度需要的其它有機化合物；4)游離脂肪酸；和5)微量元素，其中微量元素定義為通常有很低濃度(通常是微摩爾級範圍)需要的無機化合物或天然存在元素。已知成分培養基還可任選的添加一種或多種來自下列任何項的成分1)一種或多種促有絲分裂劑；2)鹽和緩衝液，例如鈣、鎂、和磷酸；3)核苷和鹼基，諸如腺苷、胸苷、次黃嘌呤；和4)蛋白質和組織水解物。
「標準保溫條件」指在放置細胞的保溫箱中為了組織培養而設計的物理化學條件。標準保溫條件通常是大約37℃和大約5％CO2及增溼。應當在無菌條件下執行所有組織培養技術和設備。
「預處理組織細胞」是指用於對作為被移植胚胎細胞供體的懷孕非人哺乳動物進行注射的組織細胞，其來自與該懷孕動物不同的動物個體，並且該動物個體通常與所述懷孕動物屬不同物種。一般地，預處理組織細胞的來源由待接受細胞移植的受體動物確定，即在細胞移植受體明確的情況下，預處理組織細胞來自與待接受細胞移植的受體動物屬相同物種的動物個體，優選來自該受體動物自身。
在本發明中，待接受細胞移植的受體動物可以是任何哺乳動物，優選靈長類，更優選人類。
本發明涉及一種製備適於細胞移植的非人哺乳動物胚胎細胞的方法，包括以下步驟(1)將預處理組織細胞注射到懷孕的非人哺乳動物體內；(2)在進一步餵養該懷孕動物後從中取出胚胎；和(3)分離胚胎組織器官，獲得非人哺乳動物胚胎細胞。
在本發明中，適用於作為細胞移植供體的懷孕「非人哺乳動物」包括各種大型或小型的哺乳動物，例如豬、牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、兔、豚鼠等。通常處於任何合適孕期、例如懷孕2-12周的非人哺乳動物均可用於本發明中進行預處理組織細胞的注射。正如本領域普通技術人員所熟知的，不同物種的哺乳動物，其整個妊娠期的長短會有所不同。因此，哺乳動物的合適孕期依具體動物物種而定。但是，該動物優選地處於懷孕早期，例如3-10周，更優選處於懷孕4-8周。至於該雌性非人哺乳動物的年齡，則沒有特別的限制，只要其已懷孕即可，但是一般採用年輕動物比較有利，因為胎兒的發育狀況可能會更好。
在本發明中，可以用於注射細胞移植供體動物的組織細胞(在本文中有時簡稱為「預處理細胞」)應理解為可來源於與待接受細胞移植的受體動物屬相同物種的任何動物個體的各種組織或器官細胞，包括例如血液、肌肉細胞、上皮細胞等，優選血液。在採用組織細胞時，通常比較有利的是組織的消化細胞，例如單細胞混懸物，或者可以是各由少數細胞組成的團塊。雖然採用原代細胞比較有利，但是經過組織培養的細胞也可以用於本發明中。這樣的細胞可以一次性注射到懷孕非人哺乳動物的體內，或者可以分成兩份或多份進行注射，或者可以採用輸注的方式。可以採用靜脈內、皮下、腹膜內等注射方式。注射細胞的總數可由本領域普通技術人員很容易地加以確定，一般是102-108，優選103-107，更優選104-2×106，尤其優選104-106，注射體積一般在10ml以內，優選1-8ml，更優選4-8ml。
在注射預處理組織細胞時，優選根據懷孕哺乳動物中胎兒的性別而確定所採用的預處理組織細胞來源，即如果胎兒是雄性的，則對懷孕哺乳動物注射來自雄性動物的預處理組織細胞樣品，如果胎兒是雌性的，則對懷孕哺乳動物注射來自雌性的預處理組織細胞樣品。胎兒的性別可以很容易加以確定，例如藉助超聲波檢測法。最優選地，採用個性化設計的方式製備待移植細胞，即將來自待進行細胞移植的受體動物自身的組織細胞注射到細胞移植供體動物(即懷孕動物)體內。
在對懷孕非人哺乳動物注射預處理細胞後，使該動物繼續其孕期。通常在懷孕8-20周對該哺乳動物解剖而取出胎兒，更優選在懷孕10-18周，最優選在12-15周。也可通過注射預處理組織細胞樣品後繼續懷孕的周數來確定獲取胎兒的時機。優選地，在注射預處理細胞4-10周後獲得胎兒，更優選在注射人細胞6-8周後獲得胎兒。一般地，監測雌性哺乳動物的懷孕狀況，並選擇在其足月生產前取出胎兒。
在將胎兒取出之後，從中取出適用的器官組織。可以通過大體解剖、外觀、和在胎兒中的定位來鑑定感興趣的器官組織，例如卵巢、睪丸、肝臟、腎臟、胰腺等。一旦進行了鑑定，即首先通過合適的洗滌液、例如生理鹽水或基本營養培養基的清洗來清理胎兒器官組織。洗滌液的溫度一般控制在37℃以下，優選25℃以下，更優選10℃以下，最優選4℃以下。當然應控制溫度，使之不會處於冰點以下。在本發明中，合適的器官組織有很多種，包括例如性腺如睪丸和卵巢等，或者可以是肝臟、心臟等。然後進行顯微解剖。顯微解剖的目的是除去與感興趣的器官組織相連的組織，將實體器官組織塊分成完整組織塊的小塊使得基本營養培養基更多的接觸組織塊中的細胞。顯微解剖的非限制性範例包括實施機械剪切強制的裝置(即勻漿器、缽與杵、搗碎機、等)、實施切割或撕裂的裝置(即解剖刀、注射器、鑷子、等)、或超聲裝置。或者，顯微解剖胎兒器官組織的另一種方法是使用酶處理。本領域眾所周知用於顯微解剖組織的多種酶，例如胰蛋白酶、膠原蛋白酶等。一種方法包括在維持由感興趣的器官組織分離的細胞存活的緩衝培養基中使用膠原酶-分散酶消化經部分剪切的器官組織。酶量取決於胎兒的年齡和所取器官組織的大小。在一個實施方案中，使用膠原酶-分散酶的酶處理可能降低總的細胞產量。因此，應降低酶的用量，或者根本不用。在其它實施方案中，酶處理可能增加總的細胞產量。因此，可以單獨使用酶處理，或者聯合顯微解剖方法使用。有很多種基本細胞維持培養基可用於將液體的pH維持在促進細胞存活的範圍內，並提供能夠在其中進行酶促消化的額外體積。非限制性範例包括F12/DMEM、Ham氏F10(Sigma)、CMRL-1066、極限必需培養基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、Dulbecco氏修改Eagle氏培養基(DMEM，Sigma)、和Iscove氏修改Eagle氏培養基(IMEM)。另外，可以使用Ham和Wallace，1979，Meth.Enz.，5844；Barnes和Sato，1980，Anal.Biochem.，102225；或Mather J.P.和Roberts P.E.，1998，《Introduction to Cell and Tissue Culture》即細胞和組織培養導論，Plenum出版社，紐約中描述的任何基本營養培養基。這樣的培養基在市場上有銷售，或者普通技術人員可以根據各種現有技術文件或生產商公開的說明書配製。本發明中並不局限於任何特定的培養基。
然後將分離自感興趣器官組織的細胞或細胞簇置於細胞維持培養基中。可以使用本領域中的多種常規培養基。範例包括但不限於DMEM培養基、MEM培養基、Ham氏F12培養基、RPMI-1640、和CMRL-1066。
為了獲得促進細胞存活和生長的更佳條件，可以向培養基中添加多種營養物。範例包括但不限於生長因子、胎牛血清、和牛血清清蛋白等。
獲得上述細胞懸液之後，可以直接用這些細胞來注射受試者。或者，可以先在合適的培養基中擴大培養這些細胞。細胞的培養可以在不同底層上進行。可以使用的底層的非限制性範例包括纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原、聚賴氨酸、硝酸纖維素、尼龍、和聚四氟乙烯。
細胞的培養依常規方法進行，例如可以在標準條件下進行。「標準保溫條件」指在放置細胞的保溫箱中為了組織培養而設計的物理化學條件。標準保溫條件通常是大約37℃和大約5％CO2及增溼。應當在無菌條件下執行所有組織培養技術和設備。培養時間依具體情況而定，通常2-14天，優選地3-10天，更優選5-8天，尤其優選6-7天。在培養過程中細胞將發生增殖。當細胞達到一定的密度後，可以對細胞進行傳代培養一次或多次，例如1-5次，優選2-4次。細胞的傳代培養技術是本領域普通技術人員所熟知的。
可以將經過培養或傳代培養所得的細胞培養物直接施用於受試者，優選在施用前通過合適的方法富集細胞，例如酶促消化和離心等方法。或者，可以將細胞培養物分成若干小份凍存，以備以後施用。
細胞凍存的方法是本領域普通技術人員所熟知的，包括例如在培養液中加入DMsO後凍存於-70℃冰箱或者液氮中。在一個實施方案中，將細胞重懸在含1.4mol/L DMSO的Hank′s液(pH7.2)中後分裝在試管中並密封，溫度為0℃-4℃，4℃靜置30-40分鐘，以6-8分鐘的速度降溫至0℃，再按0.4-0.6℃/min速度降溫至-80℃後，再放入-196℃氮液中。如此保存的細胞可完好地保藏一至數年。
使用時，復甦適當量的細胞，直接或經培養後用於受試者。復甦細胞時，可以用37-40℃溫水快速攪動復溫，然後按照上文所述進行培養，例如在CO2培養箱內37℃恆溫培養48-72小時。檢查細胞復活良好，確定無汙染的存在，才可使用。優選地，用含有AB血清的DMEM培養液培養細胞，細胞的初始接種密度為每毫升含細胞個數102-106個，優選103-105個。培養時間依具體情況而定，通常2-14天，優選地3-10天，更優選5-8天，尤其優選6-7天。在培養過程中，也可以對細胞進行傳代培養一次或多次，例如1-5次，優選1-3次。
在將細胞移植到受試者之前或者凍存之前，也可對細胞進行其它操作，包括例如重組導入外源核酸。所述核酸可以編碼各種具有有益效果的蛋白質，例如治療活性化合物，活性因子，或者有助於改善機體一般健康狀況的多肽等等。將核酸導入哺乳動物細胞的方法是本領域普通技術人員所熟知的，包括例如轉染、電穿孔、脂轉染法等。核酸的導入可以在擴增細胞之前或之後進行。
在將細胞移植到受試者之前，還可以可選地採用包裹技術對所述細胞進行包裹。有關包裹細胞療法的技術可參見例如國際專利申請公開WO2004058305。不局限於具體的理論，推測包裹技術中採用的膜能保護被包裹細胞免於宿主免疫系統的影響，同時又足夠通透，可允許細胞存活所需的分子流入，以及機體所需的生物活性化合物和廢產物的分泌。有多種材料可用於細胞包裹，其中最常用的是多糖，例如海藻酸。在本發明中，可以採用本領域中已知的任何合適的膜包裹材料。
在本發明中，可以將來源於一種胚胎器官組織的細胞給予受試者。或者，也可以將來源於幾種不同器官組織的動物胚胎細胞混合給予受試者。另外，本發明的動物胚胎細胞也可以與其它物質、例如細胞因子、治療劑等結合使用。在這方面，已知對人體有益的各種細胞因子、治療劑等都適用於本發明中。
本發明的細胞可以通過多種已知方法施用給受試者。例如，可以使用針或其它投遞裝置將細胞通過肌肉內或靜脈內等途徑施用到期望的位點。或者，可以通過導管來投遞細胞。也可通過外科手術方式、或者在合適的情況下在外科手術期間投遞細胞。如果可能的話，優選非外科手術方法。細胞可以經一種方式施用，或者可結合幾種方式施用。
可以在細胞注射之前濃縮細胞，例如通過緩衝液洗滌和離心等方法。適用的洗滌緩衝液可以是例如Hank′s液、PBS緩衝液、生理鹽水等。細胞的投遞量可以廣泛變化，並以多種因素而定，包括例如細胞類型、導入位點、導入途徑、受試者的年齡、體重、激素水平、一般健康狀況等，這可由醫務工作者容易地加以確定。一般以102-109，優選104-108，更優選105-5×107的量投遞細胞。細胞投遞的體積也可以廣泛變化，通常可以是1-10ml，優選1-8ml，更優選4-8ml。可以通過胃腸外的方式將這些細胞施用給受試者，包括例如靜脈內、皮下、肌肉內、腹膜內等途徑，並可通過注射或輸注方式進行異位注射、優選原位注射。對受試者的接受位點並沒有特別的限制，通常可以在手臂、大腿和臀部等。優選地，可以將細胞植入在大腿內側肌肉中。
因此，本發明在另一方面涉及通過前述方法獲得的非人哺乳動物胚胎細胞，所述的細胞適於移植到哺乳動物內。在一個實施方案中，所述細胞來源於非人哺乳動物胎兒的睪丸。在另一個實施方案中，所述細胞來源於非人哺乳動物胎兒的卵巢。在又一個實施方案中，所述細胞來源於非人哺乳動物胎兒的肝臟。在進一步的實施方案中，所述細胞來源於非人哺乳動物胎兒的腎臟。在更進一步的實施方案中，所述細胞來源於非人哺乳動物胎兒的胰腺。當然，本發明並不局限於來源於上述器官組織類型的細胞，任何合適的器官組織來源均可適用。這些細胞可以單一來源的形式施用，或者可以將多來源的本發明細胞聯合施用。
本發明的細胞內含有活性因子，並且在組織培養時也能夠向培養基中分泌活性因子。這樣的活性因子在機體的美容抗衰老、健康狀況改善或疾病治療中同樣是有用的。因此，本發明還涉及由上述非人哺乳動物胚胎細胞獲得的提取物。
本發明還涉及一種改善受試者的健康狀況的方法，包括有此需要的個體施用有效量的本發明細胞和/或其提取物。如上文所述，普通技術人員可以很容易地依據多種因素確定本發明細胞和/或其提取物用於改善受試者健康狀況的有效量。可以通過途徑將本發明的細胞和/或其提取物施用給受試者，包括例如靜脈內、肌內注射或輸注等，優選通過靜脈內注射的方式將所述細胞施用於受試者。在一個實施方案中，對受試者單獨施用所述細胞或細胞提取物。在又一個實施方案中，對受試者聯合施用所述細胞和細胞提取物。或者，可以將本發明的細胞和/或細胞提取物與其它活性因子、美容組合物和/或藥物聯合施用。適用的活性因子、美容組合物或藥物包括例如細胞因子、幹擾素、表皮生長因子、綿羊胎盤活性因子、雌性激素、雄性激素、膠原蛋白質、牛胚胎激活素、鯊魚胚胎激活素、羊胚胎激活素、荷爾蒙補充液、羊胎盤素，其具體用量可由本領域普通技術人員容易地確定。
在本發明中，可以將細胞和/或其提取物配製在適於投遞到受試者血流或直接投遞到合適的組織器官內的劑型之中。合適的配方可由醫務工作者根據每個受試者、投遞位點等因素確定。現有技術中熟知藥學上可接受的載體及其配方，具體可參閱Remingt0n’sPharmaceutical Science，第16版，A.Osol編，1980。本發明的細胞優選配製在pH值為約6.5-8.5的溶液中。也可加入能夠將溶液調節至等滲的載體，例如4.5％甘露糖醇或者0.9％氯化鈉溶液，其pH以被本領域眾所周知的緩衝溶液如磷酸鈉所緩衝。在所述溶液中，還可加入其它藥學上可接受的藥劑，包括例如葡萄糖、硼酸、酒石酸鈉、丙二醇、多元醇(如甘露糖醇，山梨醇等)或者其它無機或有機溶質。也可在溶液中添加可以提高細胞活力和存活的因子。
本發明還涉及所述的非人哺乳動物胚胎細胞和/或其提取物在製備可用於對哺乳動物進行抗衰老或疾病治療或者健康狀況改善的藥物中的用途。待治療的疾病狀況可包括例如性功能障礙、慢性皮膚病如溼疹、過敏、牛皮癬等，關節炎，動脈硬化，肌肉萎縮，狼瘡，癌症，心血管和神經性障礙，各種先天性缺陷，思維和行動障礙，免疫系統疾病，帕金森病，以及現有技術中已知採用細胞療法可實現治療或者緩解效果的任何其它疾病。
應當理解，若在本發明中聯合使用一種或多種本發明的細胞和/或其提取物和/或一種或多種藥物、因子、組合物時，它們中的任何兩種或多種或全部成分可以同時給予受試者(分開地或者在一種組合物中)，或者可以順序給予。其具體的給予順序可依具體情況而定，在本發明中一般對此沒有特別的限制。
在本發明中，「受試者」是指待接受細胞移植的哺乳動物個體，優選靈長類，更優選人類。用於預處理供體動物(即懷孕哺乳動物)的組織細胞來源於與該受試者屬相同物種的哺乳動物個體，最優選來自該受試者自身。
下面通過實施例對本發明作進一步描述。應當理解，這些實施例只是舉例，它們不以任何方式限定本發明的範圍。
實施例實施例1綿羊胚胎睪丸生殖間質細胞的製備1.獲得綿羊胎兒組織取已懷孕4-8周、經B超檢查胎兒為雄性的母綿羊，將從準備接受胚胎細胞激活治療的男性受試者的血液10ml～15ml～20ml(根據接受治療的人的年齡來最後確定，來自40歲～50歲男性的血液注射10ml，來自50歲～60歲男性的血液注射15ml，來自60歲～70歲男性的血液注射20ml)，靜脈內注射到該綿羊體內。維持刺激2-6周後，麻醉母綿羊，通過解剖取出綿羊胎兒。
通過局部常規消毒小切口，將雙側睪丸取出，用生理鹽水衝洗，然後放入裝有70％酒精消毒大口瓶內，並將標本瓶放入冰殼內，冰殼內溫度為0℃-4℃，在冷缺血2小時內送往實驗室。
2.生殖間質細胞培養標本送達實驗室後，立即從瓶內取出標本，用生理鹽水衝掉睪丸鞘膜外殘留酒精，然後剪開並去掉鞘膜，並將睪丸內組織剪成小塊，去掉結締組織，加入適量的膠原消化酶進一步消化。沉降去除大的組織塊後，取含單細胞或小細胞塊的上層懸液離心，向細胞沉澱中加入含有AB血清的DMEM培養液，每個培養瓶中加5-10ml的培養液，每毫升含細胞個數為103-105個，將培養瓶放入5％CO2培養箱中進行培養，溫度為37℃恆溫。培養6-7天後，對細胞進行鏡檢，確定細胞生長良好，無細菌生長。然後收集細胞，用Hank′s液衝洗，離心後將細胞沉澱重懸在PBS緩衝液中備用。
3.確認生殖間質細胞的狀態通過鏡檢確定細胞復活良好，無細菌生長，選擇備用。
4.對人受試者的施用收集睪丸細胞，經細胞計數確認其數量達到2×106～2×107～2×108。在5ml體積內將其注射在受試者的肌肉內，完成男性睪丸活細胞的移植。這些志願者均有處在亞健康狀態、疲勞綜合症、性功能減退、心慌氣短、神經衰弱等症狀。
其中40歲～50歲(注射細胞2×106) 28例 佔28％50歲～60歲(注射細胞2×107)40例 佔40％60歲～70歲(注射細胞2×108)32例 佔32％在移植後48小時～240小時開始，這些志願者的症狀開始緩解。其中80％有明顯效果，疲勞綜合症明顯改善，性功能明顯提高，總有效率85％，無變化15％。這些志願者移植後觀察均在一年以上，效果持續明顯，未發現副反應。
另外，採用放射免疫測定法對注射了本發明的綿羊胚胎睪丸間質細胞的受試者檢測血清睪丸素水平，並以注射了從未經人組織細胞預處理的懷孕母羊的胎兒來源的睪丸間質細胞的人受試者作為對照進行比較，結果見下表中(平均值是以加權平均法計算的)

上述結果顯示，本發明的綿羊胎兒睪丸間質細胞在注射到人體後，可以更高的水平、更長的周期表達活性因子，從而更好地改善受試者的狀況。
實施例2綿羊胚胎卵巢生殖間質細胞的製備1、獲得綿羊胚胎的組織。以類似於實施例1的方式進行，但是採用來自女性受試者的血液注射胎兒為雌性的懷孕母綿羊(根據接受治療的人的年齡來最後確定，來自30歲～40歲女性的血液注射10ml，來自40歲～50歲女性的血液注射15ml，來自50歲～60歲女性的血液注射20ml)，並取胎兒卵巢製備胚胎細胞。
2、生殖間質細胞培養(同實施例1)3、確認生殖間質細胞的狀態(同實施例1)4、對人體受試者的試用(同實施例1)收集卵巢細胞，經細胞計數確認其數量達到2×106～2×107～2×108。在5ml-10ml體積內將其注射在受試者的肌肉內，完成女性卵巢活細胞的移植。這些志願者均有面色無華、腰酸腿軟、神疲乏力、心悸胸悶、骨質疏鬆、性冷淡、肥胖症等症狀。
其中30歲～40歲(注射細胞2×106)25例佔28％40歲～50歲(注射細胞2×107) 34例佔38％50歲～60歲(注射細胞2×108) 30例佔34％在移植後5-10天開始，這些志願者的症狀開始緩解。其中83％有明顯效果，女性荷爾蒙水平增高，新陳代謝加快，皮膚光滑細膩，富有彈性、性慾明顯提高，並有明顯的減肥效果。總有效率88％，無變化12％。這些志願者移植後觀察半年以上，均持續有效，並且未發現副反應。
儘管為了說明的目的而在本文中描述了本發明的一些具體實施方案，但從上文可知，還可對本發明進行各種修飾和改變而仍不偏離本發明的精神和範圍。這樣的修飾和改變均在本發明的保護範圍之內。在整篇公開書中，引用了多種發表物、專利、和已發表專利說明書作為參考。將這些發表物、專利、和已發表專利的公開書完整收入本公開書作為參考。
權利要求
1.一種製備非人哺乳動物胚胎細胞的方法，其中包括以下步驟(1)將來自哺乳動物個體的預處理組織細胞注射到懷孕的非人哺乳動物體內；(2)在進一步餵養該懷孕動物後從中取出胚胎；和(3)分離胚胎組織器官，獲得非人動物胚胎組織細胞；條件是該預處理組織細胞的來源動物不同於所述懷孕哺乳動物，優選屬不同物種。
2.權利要求1的方法，其中還包括對步驟(3)中獲得的胚胎組織細胞進行增殖的步驟。
3.權利要求1的方法，其中在步驟(1)中使用的預處理組織細胞是血液，優選是全血或者血漿。
4.權利要求1的方法，其中所述胚胎細胞來自胚胎肝臟、胰腺、腎、睪丸或卵巢。
5.權利要求1的方法，其中所述懷孕的非人哺乳動物是豬、綿羊、山羊、兔、豚鼠、牛、馬、狗或貓等哺乳動物，優選綿羊。
6.權利要求1的方法，其中在所述懷孕哺乳動物懷孕4-8周後對其注射於處理組織細胞，並在其繼續懷孕一周至達到生產前時從中獲得胚胎組織器官。
7.權利要求1的方法，其中所述預處理組織細胞來源於人，優選男性或女性。
8.權利要求1的方法，其中步驟(1)中的預處理組織細胞來源於待植入該非人哺乳動物胚胎細胞的受試者，優選人受試者。
9.按照權利要求1-8中任一項的方法製備的非人哺乳動物胚胎組織細胞、由此衍生的組織細胞以及由所述組織細胞得到的提取物。
10.權利要求9的組織細胞或提取物在製備可用於細胞移植的產品中的用途。
11.一種改善受試者的健康狀況或者美容的方法，包括對該受試者施用有效量的權利要求9所述組織細胞或提取物，優選通過肌肉內或靜脈內注射的方式進行施用。
12.權利要求11的方法，其中將所述組織細胞或細胞提取物與其它保健、美容組合物和/或藥物聯合施用。
13.權利要求11的方法，其中所述受試者是人，優選男性或女性個體。
全文摘要
本發明涉及適於細胞移植的非人哺乳動物胚胎組織細胞、其製備方法和用途。
文檔編號A61K35/12GK1966675SQ20051012537
公開日2007年5月23日 申請日期2005年11月16日 優先權日2005年11月16日
發明者張曉鳳 申請人:張曉鳳