水稻根特異啟動子Os02g37190及其應用的製作方法

2023-05-13 04:32:21 1

專利名稱：水稻根特異啟動子Os02g37190及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因工程領域，具體地說，本發明涉及水稻0s02g37190基因的啟動子
序列，即從該基因ATG開始上遊-1--3500bp之間的核苷酸序列，該啟動子序列能夠在水
稻轉基因調控體系中驅動目標基因在根中特異表達。發明還涉及該序列在基因工程及遺傳改良中的應用。
背景技術：
植物基因工程技術的成功應用不僅需要大量調控不同水平的啟動子，而且需要適合於不同植物背景、不同的器官、組織、轉基因類型的啟動子以避免在轉基因過程中的不利影響。一直以來，非植物內源的組成型啟動子，來自於花椰菜花葉病毒(cauliflower mosaic virus)CaMV 35S(0dell et al.，1985)有著重要的利用價值，能驅動目的基因在單、雙子葉轉基因植物的所有組織中高效表達(Battraw and Hall, 1990 ；Benfey et al.， 1990a)。植物內源的組成型的啟動子ZmUbil是另一個在植物轉基因中被廣泛使用的啟動子，它來自於玉米泛素，是植物內源啟動子。研究還發現，ZmUbil啟動子在單子葉植物許多的細胞中都有很高的活性，能夠調控目的基因在根、葉中強烈表達，但表達水平隨著器官的成熟顯著下降(Cornejo et al.，1993)。但是，由於組成型啟動子驅動的基因在植物的不同組織、不同生長階段均有高水平的表達，在應用中逐漸暴露出一些問題(Napoli et al.，1990)。外源基因在植物體內大量表達產生許多的異源蛋白或者產生有害物質在植物體內積累，打破了植物體內原有的代謝平衡，影響了植物正常的生長發育，例如生長延緩、開花延遲、甚至造成植物不育或死亡(Pino et al.，2007)。另外，在同一個載體中同時驅動幾個不同的基因表達而重複使用同一個組成型啟動子容易造成同源基因的沉默與失活或者共抑制現象(Lessard et al., 2002 ；Potenza et al.，2004)。因此，尋找一些能在細胞、組織、器官以及發育各階段上更為專一地調控基因表達的啟動子進行遺傳載體的構建，在可控的條件下為基礎研究和作物改良創造所需性狀顯得尤為必要。組織特異性啟動子調控基因只在特定的器官、組織、細胞及不同的發育階段表達，因而可以用於以莖葉為主要收穫產物的作物，使蛋白質產物富集於莖葉中，減少宿主植物無謂的物質能量消耗，改善光合作用特性；也可以用於以種子、果實為主要收穫產物的作物，讓抗蟲、抗除草劑等外源基因只在莖葉部分而不在種子果實等器官中表達，以提高轉基因作物的生物安全性(Dale et al.，2002)，在植物基因工程研究中具有廣泛的應用前景。目前，大多數組織特異啟動子的研究主要集中在植物的地上部分，根特異啟動子的研究及應用還很少(Potenza et al.，2004)。然而，根與土壤的廣泛接觸，是植物進行營養、運輸、儲存等生理功能的重要器官，因此根特異啟動子的研究具有廣泛的應用價值。利用根特異啟動子可以進行土壤汙染的生物修復，提高植物的抗旱能力和對鹽、鹼的耐受力， 大量和微量元素的高效吸收以及增強對病原微生物的抵抗力等；同時，利用根特異啟動子研究植物根的發育，根系的形態建成和根構型的重建並進行作物的遺傳改良具有重要意義。植物內源的根特異啟動子被開發應用之前，非植物內源的的根特異啟動子rolD 在根特異表達的轉基因研究中發揮著重要作用。髮根農桿菌含有Ri質粒，侵染植物後能誘發植物細胞產生毛髮狀根，即髮根瘤。農杆鹼型Ri質粒的T-DNA是由左、右兩個片段組成， rolD位於TL-DNA上。rolD5'端 _373bp顯示出根特異和高水平的表達。序列分析顯示啟動子區存在一個根特異的基序(RSEs) (Keller and Baumgartner, 1991 ；Elmayan and Tepfer, 1995) 0 rolD啟動子現已用於氮的同化研究，包括根特異的胞質型穀氨醯胺合成酶基因和高親和硝酸鹽轉運體基因的超表達(Fei et al. ,2003 ；Fraisier et al., 2000)。另一個非植物來源的根特異啟動子是CaMV 35S上遊_90bp Domain A(Benfey and Chua, 1989)但表達水平比rolD低5-10倍，主要在根尖表達(Elmayan and Tepfer, 1995)。長期以來，菸草根特異表達基因TobRB7在根特異表達的植物轉基因研究中起著重要作用，實驗顯示在主根的頂端分生組織、不成熟的維管組織和側根中表達很高，而在成熟的葉、莖、莖尖分生組織中沒有表達(Conkling et al.，1990)。TobRB7轉錄起始位點上遊636bp序列分析顯示其足夠調控目的基因在根中特異表達，而299bp長的區域不能調控目的基因在根裡特異表達，在_813bp -636bp存在一個負調控元件(Yamamoto et al.，1991)。隨著研究的深入，相繼報導了一些植物根特異的啟動子(Xu et al. , 1995 ； Schiinmann et al,2004 ；delCampillo, 2004 ；Koyama et al. , 2005 ；Nitz et al. , 2001 ； Vijaybhaskar et al. ,2008 ；Liu et al. ,2003 ；Winicov et al.，2004)，然而，能夠在基因工程遺傳改良和農業生產中應用的仍然很少。直到最近，編碼擬南芥根特異表達的黑芥子酶(myrosinase)的PIlO啟動子(Nitz et al.，2001)調控CKX3在擬南芥根中特異表達， 與野生型材料相比，轉基因植株形成了龐大的根系，主根伸長，根生物量增加，植株地下部與地下部比率加大，而地上部未受任何影響，提高了作物抗旱及吸引礦物質的能力(Werner et al. ,2010) ο另外，用根特異啟動子RCc3 (Xu et al.，1995)與組成型啟動子G0S2調控 OsNACIO在水稻中過表達研究發現，與G0S2 =OsNACIO相比，RCc3 =OsNACIO使根變大，增強了對乾旱的耐受性，在乾旱條件下顯著提高了作物的產量(Jeong et al.，2010)。綜上所述，在植物中，特別是水稻等禾穀類作物基因工程遺傳載體構建中能夠選用的植物內源的根特異啟動子仍然很少，因此，發展更多的水稻等禾穀類作物的根特異啟動子對基礎研究和生產應用具有重要的意義。關於水稻0s02g37190啟動子調控外源基因根特異表達及應用目前還未見相關報導。文中所用的參考文獻具體如下1, Battraw MJ, Hall TC (1990) Hi s tochemi cal analysis of CaMV 35Spromoter-β -glucuronidase gene expression in transgenic rice plants. 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發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種水稻根特異啟動子0s02g37190及其應用。
7
本發明的目的是提供一種從水稻根中克隆的0s02g27190啟動子序列(ATG上遊-l--3500bp)，如SEQ ID NO :1 (即序列表中第1項序列)所示的啟動子序列，也包括與 SEQ IDNO :1所示的啟動子序列至少有80%同源性的基因序列。另外，也包括在SEQ ID NO: 1中添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸而生成的突變體、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能達到本發明的目的。本發明的另一個目的是提供一種用0s02g37190進行高效的植物轉化的方法，具體地說，本發明提供了具有SEQ ID NO :1所示的序列的基因片段的載體。本發明還提供了一種利用0s02g37190構建遺傳載體達到植物根特異表達外源基因的方法。為了解決上述技術問題，本發明提供一種水稻調控外源基因在根中特異表達的 0s2g37190啟動子，為SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。作為本發明的水稻調控外源基因在根中特異表達的0s02g37190啟動子的改進 還包括在SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一個或多個核苷酸生成的突變體、等位基因和衍生物。本發明還同時提供了上述0s02g37190啟動子的用途用於構建根特異表達的轉基因植物載體。本發明還同時提供了一種轉基因植物細胞，包含SEQ ID NO 1所示的啟動子序列的轉基因植物細胞。本發明的具體內容如下從水稻基因晶片中發現了 7個在水稻根中特異表達的基因，它們是0s09g24370， 0s04g44060, 0s03g01700, 0s02g44080, 0s02g44310, 0s03g01300, 0s02g37190。 根據 TIGRE (http://rice, plantbiology. msu. edu/)注釋，0s02g37190 未知基因，位於 2 號染色體上，519nt，無內含子。RT-PCR及qRT-PCR等實驗顯示，0s02g37190在水稻的葉和小穗中沒有表達，在根中表達量很高，是水稻根特異表達基因。另外，在水稻根中mRNA表達豐度很高，與OsActin 比較，他們的表達水平基本一致。因此，0s02g37190是水稻根特異表達基因，基因的表達水
平很高。通過將0s02g37190啟動子(ATG上遊_3500bp -Ibp)與報告基因⑶SPlus融合進行遺傳受體材料的轉化研究，我們發現0s03g01700啟動子調控下遊報告基因在水稻的主根、側根的表皮、皮層、內皮層、木質部、韌皮部及側根原基發生的細胞中都有表達，但在根冠、根毛、根莖結合部、地上部分的莖、葉、穎殼、種子、雄蕊和雌蕊中沒有表達。進一步說明了 0s02g37190啟動子能夠調控目的基因在根中特異表達。以上結果表明，我們克隆的水稻根特異啟動子0s02g37190具有一定的應用價值。 我們可以通過利用該啟動子對作物品種進行轉基因改造，如通過該啟動子調控外源基因在根中的特異表達進行土壤汙染的生物修復，提高植物的抗旱能力和對鹽、鹼的耐受力，大量和微量元素的高效吸收以及增強對病原微生物的抵抗力等；同時，利用根特異啟動子研究植物根的發育，根系的形態建成和根構型的重建並進行作物的遺傳改良。


下面結合附圖對理解本發明作進一步的詳細描述，但並非對發明作限定。圖1是水稻根特異表達侯選基因在根、葉、花中的表達譜分析(RT-PCR分析)；如圖所示，0s09g24370 (未知基因)，0s04g44060 (水通道PIP2. 3基因)， 0s03g01700 (檸檬酸鹽轉運體)，0s02g44080 (水通道TIP2. 1)，0s02g44310 (皮層細胞表達蛋白)，0s03g01300(皮層細胞表達蛋白)，0s02g37190(未知基因，表達蛋白)。圖上顯示 0s02g37190在水稻的根中表達強烈，但在葉及花中沒有表達。圖2是水稻根特異表達侯選基因在根、葉、花中的qRT-PCR分析；結果顯示0s02g37190為根特異表達基因。圖3是水稻根特異表達侯選基因與OsActin在根、葉、花中表達水平的比較；顯示0s02g37190在根與OsActin的表達水平很接近，為高水平表達，同時 0s02g37190在葉和花中沒有表達，說明這是一個根特異的高水平表達的基因。圖4是水稻根特異表達侯選基因與OsActin水稻根特異表達標準曲線；結果顯示OsActin的標準曲線的R2 = 1 ；0s02g37190的標準曲線的R2 = 0. 9974 ； 說明標準曲線線性較好。圖5是水稻根特異表達侯選基因在根、葉、花中的表達的絕對定量分析；結果顯示與植物中表達水平比較高的看家基因OsActin作為對照，根中 0s03g37190的表達水平約為OsActin的21. 5% ；葉和花中均沒有檢測到0s02g37190的表達水平，這個結果充分說明0s02g37190為水稻根特異表達的基因。圖6是⑶S plus載體示意圖。圖7是水稻根特異表達基因0s02g37190驅動報告基因⑶S載體 0s02g37190promoter :GUS 構建示意圖。圖8是水稻根特異表達基因0s02g37190驅動報告基因⑶S在水稻各組織中的表達分析；顯示0s02g37190 promoter =GUS在水稻的主根、側根(圖a)、根尖(圖b)有強烈的⑶S表達。將⑶S染色的根尖進行樹脂包埋，橫切觀察，在根的表皮(印idermis，Ep)、皮層(cortex，Co)、內皮層(endodermis，En)、木質部(xylem，X)、韌皮部(phloem, Ph)(圖 c) 及側根原基部位(lateral root primordium, LRP)(圖d)均有⑶S強烈表達。根毛(圖 a)、根冠(圖b)、根莖結合部(圖e)、地上部的穎殼(圖f)、雄蕊和雌蕊(圖g)、莖(圖h)、 葉(圖i)、種子(圖j、k)均沒有⑶S表達。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明範圍。實施例1、根特異表達基因的篩選一、樣品製備挑選飽滿的日本晴野生型水稻種子，剝殼用清水衝洗，後換成清水浸泡，於37°C浸種至露白(1-2天)，期間早晚換水。將發芽的種子直播於3L水稻全營養液中( !1值5.5)， 水稻全營養液母液配方見(表1)，水稻全營養液的具體配製如下，即每4L培養液中加I-VI號貯備液各5ml，調節pH值至5. 5。於水稻光溫可控生長室(白天30°C，夜晚22°C，光強 30001UX，光照時間12小時)中生長10天。對地上部和根部分別取樣。另取於正常營養液生長至抽穗開花期水稻的小穗，用液氮凍存。所有樣品均在-70°C保存以備RNA提取。
表1、水稻完全營養液的配方和母液配方(EDTA-Fe)
試劑
每10升母液中的克數
π m W V
VI
{
NH4NO3914CaCl2886MgS04-7H203240K2SO4714NaH2PO4^H2O403Na2EDTA-2H2093.2FeS04-7H2069.7MnCl2-4H2015.0H3BO39.34(NH4)6-Mo7O24^H2O0.74ZnS04-7H200.35CuSO4-5H200.31每4L培養液中加I-VI號貯備液各5ml，調節pH值至5. 5。二、RNA 提取RNA提取採用Gibico公司Trizol試劑抽提方法，操作步驟如下1)研缽和研棒用液氮預冷，取50 IOOmg組織用液氮充分研磨，加Iml Trizol (樣品體積不能超過Trizol的10% )，繼續研磨直至完全成為粉末，待融化成勻漿後轉入離心管，室溫下放置5分鐘；2)加入2001氯仿，劇烈搖蕩15秒，室溫放置2_3分鐘，於4°C，15000g離心10分鐘；3)取上清，再加入等體積的氯仿，重複上述步驟；4)取上清，加0. 5ml (或等體積)異丙醇，顛倒混勻，室溫放置10分鐘，於4°C， 12000g離心10分鐘；5)棄上清液，用200ml槍頭將沉澱塊輕輕打碎，加Iml 75%乙醇(0. DEPC水配製)洗滌，於4°C，12000g離心5分鐘；6)棄上清液，重複步驟5，棄上清，室溫或冷凍乾燥；7)用 20-401DEPC 水或 TE 溶解 RNA，於 _70°C凍存。8)用NanoDrop核酸蛋白測定儀ND-1000測其濃度及質量O60/280蛋白去除指標 1. 8 2. 0 ；260/230鹽分去除指標1. 8 2. 0)。
0. 1% DEPC H2O 取Iml DEPC水加入IL去離子水中混均，放置過夜後高壓滅菌。 75%乙醇50ml DEPC水中加入118. 5g無水乙醇。三、逆轉錄第一鏈cDNA合成採用!Iomega公司的M-MLV逆轉錄酶在進口的0. 5mL離心管內混合下列試劑
權利要求
1.水稻調控外源基因在根中特異表達的說Z/湘啟動子，其特徵是為SEQID NO 1所示的核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的水稻調控外源基因在根中特異表達的0s02g37190啟動子， 其特徵是還包括在SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一個或多個核苷酸生成的突變體、等位基因和衍生物。
3.如權利要求1、2所述的《5化 說77^ 啟動子的用途，其特徵是用於構建根特異表達的轉基因植物載體。
4.一種轉基因植物細胞，其特徵是包含SEQ ID NO :1所示的啟動子序列的轉基因植物細胞。
全文摘要
本發明公開了一種水稻調控外源基因在根中特異表達的Os02g37190啟動子，為SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。本發明的Os02g37190啟動子的用途，用於構建根特異表達的轉基因植物載體。本發明還提供了一種轉基因植物細胞，其為包含本發明所示的啟動子序列的轉基因植物細胞。
文檔編號C12N15/113GK102154298SQ20111007211
公開日2011年8月17日 申請日期2011年3月24日 優先權日2011年3月24日
發明者吳平, 吳運榮, 張帆, 李援亞, 陳明秀 申請人:浙江大學