一種用於檢測基因表達的雙重螢光定量pcr試劑盒的製作方法

2023-05-12 23:23:46

專利名稱：一種用於檢測基因表達的雙重螢光定量pcr試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於生化領域，具體涉及基因表達的定量檢測方法。
背景技術：
實時螢光定量PCR技術於1996年由美國A卯lied Biosystems公司推出，由於該 技術不僅實現了 PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，它具有特異性更強、自動 化程度更高、有效解決PCR汙染問題等特點，目前已在醫學和食品檢測領域得到廣泛應用。
螢光定量PCR的反應體系是由一對引物(上遊引物PI和下遊引物P2)和一個探 針T組成(如圖1)，探針上標記有一個螢光基團R和一個淬滅基團Q。反應前，探針上的熒 光信號由於淬滅基團的存在而不發光，當反應開始後，Taq酶水解探針而使得淬滅基團從探 針上脫落，受到雷射照射時可出現螢光信號，檢測到的螢光信號的強弱與PCR反應次數成 正比。"引物+探針"的模式減少了錯誤的發生，可同時提高敏感性和特異性，成為了 PCR 檢測的金標準，可以應用到腫瘤檢測、病毒檢測、轉基因動物篩選等多個方面。歐洲抗癌協 會認為RQ-PCR技術是具有特定融合基因白血病微小殘留白血病臨床檢測的金標準。
螢光定量PCR已廣泛用於基因表達變化的檢測。然而，檢測基因表達變化，要同 時檢測目的基因和內參基因的表達情況，這就需要較大量的標本。舉例來說，國際通行的 bcr-ablP21。檢測實際包括以下3部分①樣本中bcr-ablP21。基因拷貝數的絕對定量，②abl 基因拷貝數的絕對定量，③bcr-ab 1P21。和ab 1基因拷貝數的比值。由於②可作為RT-RQ-PCR 各環節的綜合質控指標，消除各樣本處理過程和實驗批間的誤差，因此，③比①能更可靠地 反應患者體內融合基因陽性細胞含量的變化，亦便於實驗室間比較。但是，現有的RQ-PCR 檢測融合基因(需要一對引物和一個相應的探針)和內參基因(需要另一對引物和另一 個探針)是在不同的反應管中進行的，即是單重RQ-PCR ;同時，為了提高實驗的準確性，每 批實驗需要設置復孔——以設3個復孔計算，因此，每個標本的單次檢測就需要2個待測基 因乂3個復孔=6管標本；而為了精確地比較，常需要將不同時間點的系列標本重複檢測， 標本用量更多。為了保證獲得足夠的標本，需要抽取患者更多的骨髓和血標本。採樣少、高 通量、集約化檢測是現代實驗診斷技術發展的必然方向。 雙重螢光定量PCR檢測是指同一個反應管中進行兩個PCR反應(如圖2)，包括2 組引物(Pl， P2 ;P1'， P2')和探針(T和T')，每組含有螢光信號不同的探針，上遊引物P1 與下遊引物P2，引導1號反應的部位，探針T上的螢光指示1號反應的進程；同樣2號反應 也單獨進行。彼此間不相互影響，結果檢測時螢光信號不會相互幹擾，可同時用不同的波長 檢測2個信號，進行反應結果和各自單獨反應相比較。用雙重螢光定量PCR檢測基因表達 變化，與單重的相比可簡約一半左右的試劑和標本用量。然而雙重螢光定量PCR對反應體 系的要求比單重的高，不僅6條序列(兩對引物和兩種探針)的濃度和PCR體系的酶、dNTP 等應達到最優化配置，並且應儘可能減少兩對引物和兩種探針之間的幹擾。目前用雙重熒 光定量PCR檢測基因表達變化，通常是每檢測一個基因都需要重新選定內參基因並設計內
3參基因的引物和探針，十分麻煩。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種具有通用內參基因及其探針和引物的雙重 螢光定量PCR試劑盒。 本發明解決上述問題的技術方案是 —種用於檢測基因表達雙重螢光定量PCR試劑盒。該試劑盒包括PCR反應液、DNA 聚合酶、標準品、檢測目的基因的引物和螢光探針以及內參基因的引物和螢光探針，其特徵 在於， 所述的內參基因為abl基因； 所述檢測內參基因的上遊引物的序列為5'-GGG CGG CCT GAA TGA AG-3' (SEQ NO. l)，下遊引物的序列為5' -GCG CTG AAC AAG TTG GTC TTT-3' (SEQ NO. 2)，螢光探針的 序列為5' -TGA GCG CCT TCT CCC CAAAGA-3' (SEQ NO. 3);所述的螢光探針的5'端標記有 螢光基團，如HEX, 3'端標記有淬滅基團，如El ipse 。 本發明試劑盒所述的目的基因即是待檢測基因，可以是哺乳動物的基因，針對檢 測不同的基因應搭配相應的引物。
本發明試劑盒的使用方法是
1.標準曲線的製備 設5個標準品含量梯度，分別是lX107copies、lX106copies、lX105copies， 1 X 104copies和1 X 103copies，每個梯度設3個平行管，共15個標準品反應管；
按上述設定在每個標準品反應管中加入目的基因標準品和內參基因abl標準品、 螢光定量PCR反應液、DNA聚合酶、檢測目的基因的引物和螢光探針以及內參基因abl的 引物和螢光探針，然後加水補足50ii L。最後按以下程序反應5(TC反應3min，95t:反應 10min，然後在94t:下15s，6(rC下lmin，共反應50個循環。反應結束後，通過機器自帶軟體 讀出目的基因和內參照abl基因的Ct值，以Ct值為因變量，標準品的拷貝數為自變量繪製 標準曲線。 2.樣本的檢測 (1)模板cDNA的製備提取待測樣品的RNA，反轉錄為cDNA ;每個樣本設3個平行管。 (2)PCR擴增在樣本反應管中加入cDNA模板、螢光定量PCR反應液、DNA聚合 酶、檢測目的基因的引物和螢光探針以及內參基因abl的引物和螢光探針，然後加水補足 50iiL。最後按以下程序反應50。C反應3min，95。C反應10min，然後在94。C下15s，60。C下 lmin，共反應50個循環。反應結束後，通過機器自帶軟體讀出目的基因和內參照abl基因 的Ct值，代入所得標準曲線得出目的基因和內參照abl基因的拷貝數，並計算二者比值。
本發明試劑盒實現了在同一反應管中，同時對目的基因和內參基因進行PCR檢 測，從其使用方法可以看出，檢測一個樣本僅需15個標準反應管和3個樣本反應管，與現有 技術相比節省了 一半的試劑和樣本用量。 將本發明試劑盒中檢測內參基因abl的引物的擴增DNA片段在genebank (http: 〃 www. ncbi. nlm. nih. gov/)中進行比對檢索，發現該片段與類人猿、猴、狗、馬、小鼠等動物abl基因的匹配率絕大多數達到97. 1%以上，最低也達87. 9%，而與其他基因幾乎沒有 完全匹配的區域。可見本發明試劑盒的應用範圍廣，可用於檢測哺乳動物中各種基因的 表達水平，尤其是致病基因，如腫瘤融合基因BCR-ABL， PML-RARa， AML1-ET0， SIL-TALl， CBFB-MYHll， E2A-PBX1， MLL-AF4， TEL-AML1等。因此，使用本發明試劑盒檢測基因表達時， 只需設計目的基因的引物和探針即可，無需再重新設計內參基因的引物和探針。 圖1是螢光定量PCR的反應原理，其中PI和P2為引物，T為探針，R為螢光發生基 團，Q為螢光淬滅基團。 圖2是雙重螢光定量PCR的反應示意圖，其中Pl、 P2、 PI'和P2'為引物，T禾口 T' 為探針，R為螢光發生基團，Q為螢光淬滅基團。 圖3是標準品質粒濃度為1 X 105copies/2 ii L時bcr_ablp21。融合基因和abl基因 的擴增曲線圖，其中1 3分別為4個平行管的bCr-ablp21。融合基因擴增曲線，4 6分別 為3個平行管的abl基因擴增曲線。 圖4是不同濃度標準品質粒Bcr-ab1P21。T-A的擴增曲線對數曲線圖，其中 1 7分另U是濃度為lX107copies/2ii L、lX106copies/2ii L、lX105copies/2ii L， 1 X 104copies/2 ii L、 1 X 103copies/2 ii L、 1 X 102copies/2 ii L和1 X 10、opies/2 ii L的標準 品質粒的擴增曲線，8是陰性對照，虛橫線為閾值(threshold)。
圖5是標準品質粒Bcr-ab1P21。T-A的標準曲線圖。
具體實施方式

例1 —、本發明試劑盒的組成 1.2XTaqMan PCR通用反應液(2XTaqMan universal PCR Mastermix，購自美國 ABI公司)含有聚合酶及PCR反應必需的其它成分，模板、引物和探針除外；
2.標準品為Bcr-ablP210T-A載體，即同時載有bcr-ablP210和內參基因abl待測 片段的對照質粒載體，其製備方法如下 在微量離心管中配製下列DNA溶液，全量為5 ill (表1); 表1 2)加入5 ill (等量)的Solution I ; 3)16。C反應30分鐘。 注①室溫(25°C )也能正常進行連接反應，但反應效率稍微降低。 ②5分鐘也能正常進行連接反應，但反應效率稍微降低。 4)全量(10 ii 1)加入至100 ii 1 JM109感受態細胞中，冰中放置30分鐘； 5) 42t:加熱45秒鐘後，再在冰中放置1分鐘；


p歸DTMW-T Vector" bcr-abb，駿合基園和aW基證 dH20
一 3 |d
6)加入890 ii 1S0C培養基，37。C振蕩培養60分鐘； 7)在含有X-Gal、IPTG、Amp的L_瓊脂平板培養基上培養，形成單菌落。計數白色、 藍色菌落； 8)挑選白色菌落，使用PCR法確認載體中插入片段的長度大小。 3.內參基因abl的引物和螢光探針分別是 上遊引物的序列為SEQ NO. 1，5' -GGG CGG CCT GAA TGAAG-3' 下遊引物的序列為SEQ NO. 2， 5' -GCG CTG AAC AAG TTG GTC TTT-3' 螢光探針的序列為SEQ NO. 3，5'_TGA GCG CCT TCT CCC CAA AGA-3'，該螢光探針
的5'端標記有螢光基團HEX, 3'端標記有淬滅報告基團El ipse 。 4.檢測bcr-ablP210融合基因的引物和螢光探針，其序列分別為 bcr-ablP210融合基因的引物和螢光探針，可以採用如歐洲抗癌協會(EAC)推薦
的序列，分別是 上遊引物為SEQ NO. 4 :5' -TCC GCT GAC CAT CAA TAA GGA-3' 下遊引物為SEQ NO. 5 :5， -CAC TCA GAC CCT GAG GCT CAA-3' 螢光探針的序列為SEQ NO. 6 :5，-CCC TTC AGC GGC CAG TAG CAT CTG A-3，，該熒
光探針的5'端標記有螢光基團FAM，3'端標記有淬滅報告基團，TAMRA。 上述引物和探針在上海英駿生物技術公司和大連寶生物公司合成。 二、待測樣品 2004年5月至2006年12月在南方醫院門診或住院的CML慢性期(CP)患者46 例，男23例，女23例，年齡16 65歲，中位年齡38. 1歲，取患者外周血或者骨髓。
三、樣品的處理 1.分離RNA:取白血病患者骨髓或外周血經Ficoll淋巴細胞分離液分離得到單 個核細胞，以5X106 1X107個細胞/管的濃度加入lmL Trizol Reagent,立即使用 或-8(TC保存，以一步法分離總RNA。 RNA經紫外分光光度計測定A260/A280值，測定RNA濃 度和純度。 2.合成模板cDNA:在25iil體系中，含有1.8iig總RNA，0. 5iig隨機引物，40U
RNA酶抑制劑，lmmol/LdNTPs， 200U M-MLV逆轉錄酶，50mM Tris-HCl (pH8. 3) ， 75mM KC1， 3mM
MgC12， 10mM DTT。以上均為Promega公司產品。將總RNA與隨機引物混合，在65。C放置5
分鐘，然後加入RNA酶抑制劑、dNTPs、逆轉錄酶和Buffer，在37t:放置45分鐘。 四、樣品的檢測 1.用本發明試劑盒檢測 儀器Biorad公司螢光定量PCR擴增儀和分析系統
(1)標準曲線的製備 取Bcr-ablP210T-A載體，用水稀釋成以下濃度1 X 107copies/2 ii L、 IX 106copies/2 ii L、 1 X 105copies/2 ii U X 104copies/2 ii L、l X 103copies/2 ii L、 1 X 102copies/2 ii L禾口 1 X 101copies/2 ii L ; 按上述設定在每個標準品反應管中加入Bcr-ablP210T-A載體2 ii L、2XTaqMan PCR通用反應液25iiL，加入檢測bcr-abl融合基因的引物和檢測內參基因abl的引物至 各引物濃度為0. 3 ii /L，檢測bcr-abl融合基因的探針和檢測內參基因abl的探針至各探針濃度為0. 2 ii moL/L，加入然後加水補足50 y L。最後按以下程序反應5(TC反應3min， 95°C反應10min，然後在94°C下15s， 60°C下lmin共反應50個循環。反應結束後，通過機器 自帶軟體讀出bcr-abl基因和內參照abl基因的Ct值，以Ct值為因變量，標準品的拷貝數 為自變量繪製標準曲線；每個Bcr-ablP210T-A載體濃度設3個平行管，共15個標準品反應管。 (2)樣品的檢測 在樣品檢測管中加入模板cDNA2iiL， bcr-ablP210基因和abl內參基因的引 物(即SEQ NO. 4、 SEQ NO. 5、 SEQ NO. 1和SEQ NO. 2)各至0. 3 ii moL/L， bcr_ablP210基 因的探針(SEQ NO. 6)和abl基因的探針(SEQNO. 3)各至0. 2 ii moL/L， 2 X TaqMan PCR 通用反應液25iiL，每管的反應總體系50iiL，不足部分以無菌雙蒸水補充。反應程序 50°C X3min+95。C X 10min，然後94°C X15s、60。C Xlmin共50個循環。反應結束後，通過 機器自帶軟體讀出bcr-ablP210目的基因和abl內參照的拷貝數，計算二者的比值。每一 標本均做3個平行管，以保證結果的準確性。
2.對比實驗1——用螢光原位雜交(FISH)進行檢測 按試劑盒提供的間期螢光原位雜交操作說明進行標本處理、變性、雜交、雜交後洗 脫等操作。 3.對比實驗2——用單重螢光定量PCR檢測 (1)試劑標準品質粒為含有bcr-ablP210基因的質粒Bcr-ablP210質粒和含有 abl內參基因的T-A載體，其餘試劑均和本發明試劑盒相同。
(2)方法 ①Bcr-ablP210基因標準曲線的繪製 取Bcr-ablP210質粒載體進行10倍梯度稀釋至每2 ii L分別含有1 X 106copies， 1 X 105copies， 1 X 104copies， 1 X 103copies， 1 X 102copies， 1 X 101copies質粒，每個梯度 均做3個平行管，以保證結果的準確性。反應體系每管中加入2ii L陽性模板，bcr-ablP210 基因的上、下遊引物(即SEQ NO. 4和SEQ NO. 5)各至0. 3 ii moL/L，bcr-ablP210基因FAM標 記的TaqMan探針(即SEQ NO. 6)至0. 2 ii moL/L ;2 X TaqMan PCR通用共同組分(2 X TaqMan universal PCR Mastermix，美國ABI公司)25 y L，每管的反應總體系50 y L，不足部分以無 菌雙蒸水補充。 ②abl基因標準曲線的繪製 取帶有內參基因abl待測片段的T-A載體進行10倍梯度稀釋至每2 y L分別含有 1X106copies，1X105copies，1X104copies，1X103copies，1X102copies，1X101copies 質粒，每個梯度均做3個平行管，以保證結果的準確性。反應體系每管中加入2iiL陽性模
板，abl內參基因的上、下遊引物(即SEQ NO. 1和SEQ NO. 2)各至O. 31 y moL/L，abl基因HEX 標記的TaqMan探針(即SEQ NO. 3)至0. 2 ii moL/L ;2xTaqManPCR通用共同組分(2 X TaqMan universal PCR Mastermix，美國ABI公司)25 y L，每管的反應總體系50 y L，不足部分以無 菌雙蒸水補充。 反應程序50。C X3min+95。C X 10min，然後94°C X15s、60。C X lmin共50個循 環。反應結束後，通過機器自帶軟體讀出bcr-ablP210目的基因和abl內參照的拷貝數，計 算二者的比值，繪製各自的標準曲線。
五、結果 1.本發明試劑盒標準曲線的繪製 圖3顯示當bcr-abl融合基因和abl基因的起始拷貝數相同時，使用各自引物進 行擴增的Ct值是相同的，說明用本發明標準品質粒的標準曲線代替bcr-abl融合基因和 abl基因的標準曲線是可行的。圖4是濃度為1X107copies/2ii L、lX106copies/2ii L、 1X105copies/2iiL，lX104copies/2pL和1 X 103copies/2 ii L的標準品質粒及陰 性對照的擴增曲線。根據圖4結果繪製的標準曲線如圖5所示，標準曲線方程為y =-3. 381X+16. 40， r = 0.995。 1X107至10個拷貝數7個梯度的標本CV值(n = 5)分 別為4. 89%、3. 88%、4. 34%、1. 90%、3. 93%、4. 26%和3. 45%，說明本發明方法的穩定性 好。 2.各組樣品檢測結果 如表2所示，本發明試劑盒的檢測結果和單重螢光定量PCR檢測結果基本一致，說 明本發明試劑盒的準確性和單重螢光定量PCR相當，但樣本和試劑的用量卻節省了一倍。
表2
分組樣品數 (例)本發明試劑盒檢測結果FISH檢測結果單重螢光定量PCR 檢測結果
180. 492±0. 26363. 9% ±16. 1%0. 579±0. 271
260. 023±0. 0333. 8% ±1. 8%0. 031±0. 013
39(4. 33 ±3. 84) X 10—4陰性(3. 99±1. 32) X 10—4 六、典型病例舉例 初發治療的患者，FISH檢測bcr-abl基因陽性率為95% 。 經格列衛治療3個月患者，FISH檢測bcr-abl基因陽性率為5%。 經異基因造血幹細胞移植患者，FISH檢測。bcr-abl基因陽性率為陰性。 上述結果說明FISH的檢測結果和臨床診斷的結果一致，與本發明試劑盒檢測結
果相符。 例2 —、本發明試劑盒的組成 2XTaqMan PCR通用反應液(2XTaqMan universal PCR Mastermix，購自美國ABI
公司)含有聚合酶及PCR反應必需的其它成分，模板、引物和探針除外； 標準品為Bcr-ablP19。T-A載體，即同時載有bcr-ablP19。和內參基因abl的對照質
粒載體，其製備方法如下 1)按表2在微量離心管中配製下列DNA溶液，全量為5 iU。 表3
8
pMDTM〗8-T Vector* 1ber-ablra。融合基S和aW基因dH20 2)加入5 ii 1 (等量)的Solution I 。
3)16。C反應30分鐘。
注)①室溫(25°C )也能正常進行連接反應，但反應效率稍微降低。
②5分鐘也能正常進行連接反應，但反應效率稍微降低。
4)全量(lOiil)加入至100 ill JM109感受態細胞中，冰中放置30分鐘。
5)42t:加熱45秒鐘後，再在冰中放置1分鐘。
6)加入890iU S0C培養基，37t:振蕩培養60分鐘。 7)在含有X-Gal、IPTG、Amp的L_瓊脂平板培養基上培養，形成單菌落。計數白色、藍色菌落。 8)挑選白色菌落，使用PCR法確認載體中插入片段的長度大小。
內參基因abl的引物和螢光探針分別是 上遊引物的序列為SEQ NO. 1 :5' -GGG CGG CCT GAA TGA AG-3' 下遊引物的序列為SEQ NO. 2 :5' -GCG CTG AAC AAG TTG GTC TTT-3' 螢光探針的序列為SEQ NO. 3 :5'_TGA GCG CCT TCT CCC CAA AGA-3'，該螢光探針
的5'端標記有螢光基團HEX, 3'端標記有淬滅報告基團El ipse 。 bcr-ablP19。融合基因的引物和螢光探針，可以採用如歐洲抗癌協會(EAC)推薦的序列，分別是 上遊引物為SEQ NO. 7 :5' -CTG GCC CAA CGA TGG CGA-3'; 下遊引物為SEQ NO. 5 :5' -CAC TCA GAC CCT GAG GCT CAA-3'; 螢光探針的序列為SEQ NO. 6 :5' -CCC TTC AGC GGC CAG TAG CAT CTG A-3'該熒
光探針的5'端標記有螢光基團FAM，3'端標記有淬滅報告基團TAMRA。 上述引物和探針在上海英俊生物技術公司和大連寶生物公司合成。 二、樣品的處理 1、分離RNA :取白血病患者骨髓或外周血經Ficoll淋巴細胞分離液分離得到單個核細胞，以5X106 lXl7個細胞/管的濃度加入lmL Trizol Reagent,立即使用或-80。C保存，以一步法分離總RNA。 RNA經紫外分光光度計測定A26。/A28。值，測定RNA濃度和純度。
2、合成模板cDNA :在25 iil體系中，含有1. 8 ii g總RNA， 0. 5 ii g隨機引物，40URNA酶抑制劑，lmmol/LdNTPs， 200U M-MLV逆轉錄酶，50mM Tris-HCl (pH8. 3) ， 75mM KC1， 3mMMgCl2， 10mM DTT。以上均為Promega公司產品。將總RNA與隨機引物混合，在65。C放置5分鐘，然後加入RNA酶抑制劑、dNTPs、逆轉錄酶和Buffer，在37t:放置45分鐘。
三、樣品的檢測 儀器Biorad公司螢光定量PCR擴增儀和分析系統
(1)標準曲線的製備 取Bcr-ablP19。T_A載體，用水稀釋至每微升含Bcr-ablP19。T_A載體1 X 106copies，
1 Pi
3 pi
91 X 10 copies, 1 X 10 copies, 1 X 10 copies, 1 X 10 copies, 1 X 10 copies ;
按上述設定在每個標準品反應管中加入Bcr-ab1P19。T_A載體2 ii L、 2 X TaqManPCR通用反應液25iiL，加入檢測bcr-abl融合基因的引物和檢測內參基因abl的引物至各引物濃度為0. 3 ii moL/L，檢測bcr-ab 1融合基因的探針和檢測內參基因ab 1的探針至各探針濃度為0.2iimoL/L，加入然後加水補足50iiL，最後按以下程序反應50°C X3min+95。C X 10min，然後94°C X15s、60。C Xlmin共50個循環。反應結束後，通過機器自帶軟體讀出bcr-abl基因和內參照abl基因的Ct值，以Ct值為因變量，標準品的拷貝數為自變量繪製標準曲線海個Bcr-ab1P19。T-A載體濃度設3個平行管，共15個標準品反應管。 (2)樣品的檢測 在樣品檢測管中加入模板cDNA2iiL， bcr-ablP19。基因和abl內參基因的引物(即SEQ NO. 7、 SEQ NO. 5、 SEQ NO. 1和SEQ NO. 2)各至0. 3 ii moL/L， bcr_ablP19。基因的探針(SEQ NO. 6)和abl基因的探針(SEQ NO. 3)各至0. 2 ii moL/L， 2 X TaqMan PCR通用反應液25 L，每管的反應總體系50 L，不足部分以無菌雙蒸水補充。反應程序50°C X3min+95。C X 10min，然後94°C X15s、60。C Xlmin共50個循環。反應結束後，通過機器自帶軟體讀出bcr-ablp，目的基因和abl內參照的拷貝數，計算二者的比值。每一標本均做3個平行管，以保證結果的準確性。
0123]序列表
0124]〈110〉南方醫科大學
0125]〈120〉 一種用於檢測基因表達雙重螢光定量PCR試劑盒
0126]〈160>7
0127]〈170>PatentIn version 3. 3
0128]〈210>1
0129]〈211>17
0130]〈212>DNA
0131]〈213〉人工序列
0132]〈400>1
0133]gggCggCCtg ￡l￡ltg￡l￡lg
0134]〈210>2
0135]〈211>21
0136]〈212>DNA
0137]〈213〉人工序列
0138]〈400>2
0139]gcgctgaaca agttggtctt t
0140]〈210>3
0141]〈211>21
0142]〈212>DNA
0143]〈213〉人工序列
0144]〈400>3
tgagcgcctt ctccccaaag〈210>4〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉4tccgctgacc atcaataagg〈210>5〈211>21DNA〈213〉人工序列〈400>5cactcagacc ctgaggctca〈210>6〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>6cccttcagcg gccagtagcatctga〈210>718〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>7ctggcccaac gatggcga
1權利要求
一種用於檢測基因表達雙重螢光定量PCR試劑盒。該試劑盒包括PCR反應液、DNA聚合酶、標準品、檢測目的基因的引物和螢光探針以及內參基因的引物和螢光探針，其特徵在於，所述的內參基因為abl基因；所述檢測內參基因的上遊引物的序列為5』GGG CGG CCT GAA TGA AG-3』，下遊引物的序列為5』-GCG CTGAAC AAG TTG GTC TTT-3』，螢光探針的序列為5』-TGA GCG CCT TCT CCC CAA AGA-3』所述的螢光探針的5』端標記有螢光基團，3』端標記有淬滅基團。
全文摘要
一種用於檢測基因表達雙重螢光定量PCR試劑盒，該試劑盒由PCR反應液、DNA聚合酶、標準品、檢測目的基因的引物和螢光探針以及內參基因的引物和螢光探針組成，其特徵在於所述的內參基因為abl檢測該基因的上遊引物的序列為5』-GGG CGG CCT GAA TGA AG-3』，下遊引物的序列為5』-GCG CTG AAC AAGTTG GTC TTT-3』，螢光探針的序列為5』-TGA GCG CCT TCT CCC CAA AGA-3』；所述的螢光探針的5』端標記有螢光基團，3』端標記有淬滅基團。本發明試劑盒可達到現有單重螢光定量PCR方法檢測的準確度和靈敏度，但所需樣品量和試劑量節省了近一倍。
文檔編號C12Q1/68GK101701253SQ20091022489
公開日2010年5月5日 申請日期2009年11月26日 優先權日2009年11月26日
發明者周紅升, 孟凡義, 常威, 張洋, 徐波兒, 戴敏, 李樂, 李清, 江千裡, 江汕, 鄭瀟瀟, 陰常欣 申請人:南方醫科大學