一種酸酐修飾與海藻酸包埋聯用的固定化漆酶及其製備方法和應用的製作方法

2023-05-13 07:50:01

一種酸酐修飾與海藻酸包埋聯用的固定化漆酶及其製備方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種酸酐修飾與海藻酸包埋聯用的固定化漆酶及其製備方法。該固定化漆酶的製備過程包括：首先利用酸酐對漆酶進行修飾，然後用海藻酸對修飾化後的漆酶進行包埋，得到固定化漆酶。本工藝所製備的固定化漆酶可對廢水中2，4-二氯苯酚進行去除。本發明方法拓寬了漆酶的pH、溫度適用範圍，增加了重複使用次數。在廢水處理方面具有廣闊的應用前景。
【專利說明】一種酸酐修飾與海藻酸包埋聯用的固定化漆酶及其製備方 法和應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及酶固定化及環境保護領域。具體涉及一種經酸酐修飾和海藻酸包埋聯 用的固定化漆酶及製備方法和應用。

【背景技術】
[0002] 酶的固定化研究始於20世紀60年代，是指將水溶性的游離酶通過物理或者化學 方法將其連接在一定的固相載體上，使其成為固定化酶。固定化酶在一定程度上彌補了上 述游離酶不容易重複使用、成本高的不足，增加了酶的實際應用性。酶的固定化方法主要 有：吸附法、包埋法、離子交換法、交聯法、共價結合法等。遺憾的是，單一的固定化技術目前 在提高酶的耐用性方面仍然存在很多局限性。例如，包埋法操作簡單、酶活性損失小、酶包 埋量大且固定化效率高，較適用於底物為小分子的酶的固定化。
[0003] 漆酶（Laccase)是一類含多個銅離子的多酚氧化酶。在氧氣存在的條件下，漆酶 可以催化氧化多種底物，如酚類、芳香胺類、留體、金屬有機物等物質，被廣泛應用於環境 修復、造紙工業、能源領域、食品工業、生物檢測等方面。例如，氯酚類物質2,4_二氯苯酚 (DCP)是一種合成多種溶劑、醫藥和農藥的中間體，難降解，易揮發，有較強的腐蝕性。目前 DCP的去除主要有光降解、吸附、氧化還原、生物降解等方法。使用漆酶催化的生物降解DCP 具有操作簡單、條件溫和、無二次汙染等優點，受到了人們的重視。
[0004] 根據漆酶來源的不同以及底物的不同，漆酶活性的最適pH差異較大。另一方面， 不同來源的工業廢水PH差異也很大。由於目前工業上漆酶的主要來源為漆樹漆酶和真菌 漆酶兩大類，這兩類漆酶的最適PH多在3?5,工業廢水達標排放標準pH值在6?9。這 些特性促使研究者開發新技術以拓寬漆酶的PH適用範圍。文獻報導漆酶用丁二酸酐修飾 之後最適pH 向喊性偏移[Chinese Journal ofCatalysis 2011,32(10) :1584-1591];漆酶 經鄰苯二甲酸酐修飾後，pH適用範圍得到拓寬[中國科技論文在線，2007,2:870-874]。然 而，僅通過酸酐化學修飾漆酶仍然存在難以回收利用、不利於節約成本等不足。
[0005] 此外，文獻報導了單一海藻酸包埋來源放線菌的漆酶可以用於苯酚的降解， 重複使用次數可以達到8次，主要用於造紙鹼性廢水的處理[World J Microbiol. Biotechnol. 2008,24 :1215-1222]。然而，由於海藻酸微球本身在鹼性溶液中極易解離溶 解，該方法為了克服這個問題使用了銅離子交聯的海藻酸微球增強海藻酸微球的耐用性， 但也導致了銅的二次汙染。因此，開發穩定性更高（pH和溫度適用範圍更寬）、便於重複利 用的漆酶固定化技術具有重要的現實意義。將化學修飾與物理包埋聯用的固定化技術通過 多重技術的互補結合，有可能彌補單一固定化技術的不足，有效提高酶的穩定性和循環使 用性能。


【發明內容】

[0006] 本發明的目的是提供一種化學修飾與物理包埋聯用的固定化漆酶及其製備方法。 具體涉及一種經酸酐修飾和海藻酸包埋聯用的固定化漆酶及製備方法。
[0007] 本發明中，漆酶可以為漆樹漆酶或平菇漆酶，酸酐可以為丁二酸酐、馬來酸酐或鄰 苯二甲酸酐。本發明製備固定化漆酶方法簡單，只需兩步：（1)利用酸酐修飾漆酶，得到羧 基化漆酶；（2)將步驟（1)所得的羧基化漆酶溶液與海藻酸鈉溶液混合，滴入CaCl 2溶液中 進行交聯，獲得固定化漆酶微球。
[0008] 上述方法的步驟（1)中，漆酶分子上的氨基與酸酐發生反應，製得羧基化漆酶。控 制漆酶溶液濃度為〇. 5?50mg/mL，酸酐溶液濃度為5?500mM，反應時間為IOmin?24h。 為了儘量減少反應中的酶活損失，反應體系採用冰浴；為了加快反應速度，採用磁力攪拌； 反應時間優選為lh。反應結束後，利用pH為4. 5的醋酸-醋酸鈉緩衝溶液在4°C下對產物 進行透析，除去未反應的酸酐分子。
[0009] 所述步驟（2)中，用海藻酸對第一步製備的羧基化漆酶進行包埋固定化。羧基化 漆酶與海藻酸鈉混合均勻，所使用海藻酸鈉濃度優選為2. 5%，羧基化漆酶和海藻酸鈉的體 積比為1 : 2,混合液於4°C下靜置2?3h，待到混合液無氣泡後，用注射器將混合液滴入 CaCl2溶液中。所用CaCl2溶液的濃度優選為3%。鈣離子與海藻酸分子上的羧基、漆酶分 子上修飾的羧基具有強的絡合作用，不僅能生成不溶於水的海藻酸鈣微球，還能更大程度 上有效包埋酶。研究發現，丁二酸酐修飾固定化漆酶微球的酶包埋率約為90%，未修飾微球 的包埋率約為85%。鈣離子交聯的海藻酸微球還能保證所製備的固定化漆酶微球有良好的 機械性能，不會出現酶洩露情況。在優化條件下所製備的固定化漆酶微球直徑約為3mm。
[0010] 本發明固定化漆酶的製備原理滿足以下三點：第一，漆酶經酸酐修飾後，漆酶分子 上帶有較多的羧基，由於羧基與鈣離子有較好的絡合作用，從而能夠有較多包埋在鈣離子 交聯的海藻酸微球中；第二，漆酶經酸酐修飾後羧基含量的大大增加，保證漆酶的最適PH 值向鹼性偏移；第三，由於鈣離子能夠同時絡合羧基化漆酶和海藻酸，提高了海藻酸在中性 PH下的穩定性，從而固定化酶的耐用性和重複使用次數得到提高。
[0011] 從上述操作步驟可知，本發明技術條件溫和，不涉及苛刻的反應條件如高溫高壓 等，有利於保持酶的構象，不損失酶的活力。研究發現丁二酸酐修飾後漆酶酶活回收率約為 未修飾游離漆酶的1. 5倍，丁二酸酐修飾固定化漆酶的酶活回收率約為未修飾固定化漆酶 2?3倍。游離漆酶的pH和溫度適用範圍一般為pH 3?5, 30?40°C。利用本發明製備 的固定化漆酶有較寬的pH和溫度適用範圍，在pH 3?7、20?60°C範圍內均有較高的活 性。
[0012] 氯酚類物質是廢水中一類難降解的汙染物。利用本發明的固定化漆酶微球對DCP 進行降解，降解性能主要體現在PH近中性條件下具有較好的循環使用性能。由於pH過高 會使微球溶解，使用此固定化漆酶時將pH控制在6左右。從圖3可以看出，丁二酸酐修飾 的固定化漆酶微球在PH 6進行DCP降解，循環使用12次之後，降解率仍達到30%以上，去 除DCP性能優於其它對照體系。
[0013] 本發明的優點在於：1)製備工藝簡單，條件溫和，不引入二次汙染；2)所製備的固 定化漆酶最適pH由酸性向鹼性方向偏移，pH適用範圍拓寬；3)所製備的固定化漆酶溫度適 用範圍拓寬；4)在pH 6下用於去除DCP，滿足較理想的重複使用次數。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1為實施例1中pH對游離漆樹漆酶、丁二酸酐修飾漆酶、固定化漆酶活性的影 響
[0015] 圖2為實施例1溫度對游離漆樹漆酶、丁二酸酐修飾漆酶、固定化漆酶活性的影響
[0016] 圖3為實施例3中游離平菇漆酶和修飾平菇漆酶經固定化後DCP降解實驗

【具體實施方式】
[0017] 下面結合實例對本發明作進一步說明，但本發明並不局限於此。
[0018] 本發明中所用漆樹漆酶（來源Rhus vernicifera)購自Sigma-Aldrich ;
[0019] 平燕漆酶（來源 Pleurotus ostreatus)購自 Sigma-Aldrich ;
[0020] 測定漆酶酶活的方法為2, 2-聯氮-二（3-乙基-苯並噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2， 2' -Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6_sulphonate), ABTS)法。
[0021] 下述實施案例中，未修飾漆酶、被丁二酸酐（馬來酸酐或鄰苯二甲酸酐）修飾 的漆酶、未修飾的固定化漆酶、被修飾的固定化漆酶以下分別用Lac、Lac-SA(Lac-MA或 Lac-PA)、LacOALG、Lac-SAOALG (Lac-MAOALG 或 Lac-PAOALG)表示。
[0022] 實施例1
[0023] DLac-SA的製備：取0. Olg漆樹漆酶於IOmL pH 7. 4磷酸鹽緩衝溶液中，4°C下溶 解Ih後，在4°C、9000rpm下離心5min，得到漆酶溶液。取0. Olg 丁二酸酐（SA)溶於50mLpH 7. 4的磷酸鹽緩衝溶液中，得到2mM SA溶液。將漆酶溶液置於冰浴中，磁力攪拌下緩慢加入 IOmL SA溶液，反應lh。將反應後的溶液裝於透析袋（截留分子量為3500)中，4°C下於醋 酸緩衝溶液中透析過夜，得到Lac-SA溶液。修飾率約為50%。
[0024] 2) Lac-SAOALG的製備：稱取3g CaCl2溶於IOOmL水中，得到3% CaCl2溶液。稱取 1.58海藻酸鈉溶於6〇1^蒸餾水中，得到2.5%海藻酸鈉。將1〇1^1^^4與2〇11^2.5%海 藻酸鈉混合均勻，置於4°C冰箱中，當混合液中無氣泡時方可進行下一步包埋。將Lac-SA與 海藻酸鈉的混合液用注射器滴入3% CaCl2溶液中，4°C下交聯2h，得到Lac-SAOALG微球。
[0025] 3) LacOALG的製備：與Lac-SAOALG的製備方法相同，僅將Lac-SA溶液換為Lac溶 液。
[0026] 4)以ABTS為底物測定漆酶活性。以37°C下420nm處每分鐘生成1 μ mol底物作 為一個酶活力單位。
[0027] 效果評價：
[0028] I. pH值適用範圍
[0029] 不同pH下測得相對酶活見圖1，其中相對酶活是指不同pH條件下酶活，相對最適 pH下酶活的百分比。結果表明，游離Lac最適pH為4. 5,隨著pH的增加，活性迅速減小，當 pH增大到7時，相對酶活僅為10%左右；Lac-SA最適pH偏移到6,當pH增大到7時，相對 酶活仍有80 %左右；LacOALG最適pH約為3. 5,隨著pH的增加相對酶活逐漸減小，當pH增 加到7. 0時，相對酶活為60 %左右；Lac-SAOALG最適pH向鹼性方向偏移到了 6. 4,當pH為 7. 0時，相對酶活仍有約87 %。
[0030] 溫度適用範圍
[0031] 不同溫度下測得相對酶活見圖2,其中相對酶活是指以各自條件下的酶活與最適 溫度下酶活的百分比。結果表明，Lac、Lac-SA的最適溫度均為35°C，LacOALG、Lac-SAOALG 的最適溫度為45°C。Lac、Lac-SA隨著溫度的增加，酶活降低明顯，Lac@ALG、Lac-SA@ALG活 性隨溫度改變沒有太大變化。
[0032] 實施例2
[0033] 按照實施方案1的步驟，僅將原料中的丁二酸酐替換成馬來酸酐或鄰苯二甲酸 酐。或將漆樹漆酶替換成平菇漆酶。以ABTS法對漆酶的催化活性進行測定，效果評價總結 為表1。
[0034] 表1酸酐修飾與海藻酸包埋聯用固定化漆酶的性能結果
[0035]

【權利要求】
1. 一種酸酐修飾與海藻酸包埋聯用的固定化漆酶及其製備方法，其特徵在於化學修飾 與物理包埋的聯用，包括以下兩個步驟：（1)化學修飾是指酸酐與漆酶分子上的氨基在緩 衝溶液中反應，製備羧基化漆酶；（2)物理包埋是將羧基化漆酶與海藻酸鈉溶液混合，然後 逐滴滴入CaC12溶液進行交聯得到所述固定化漆酶。
2. 根據權利要求1所述製備方法，其特徵在於：所述步驟（1)中漆酶具體來自漆樹和 平菇，所述酸酐為丁二酸酐、馬來酸酐、鄰苯二甲酸酐中的至少一種。
3. 根據權利要求1所述步驟（1)的方法，其特徵在於：漆酶溶液濃度為0. 5?50mg/ mL，酸酐溶液濃度為5?500mM，反應時間為IOmin?24h，反應溫度為0?40°C ;所述緩衝 溶液的pH為3.0?8.0。
4. 根據權利要求1所述製備方法，其特徵在於步驟（2)中所述物理包埋條件是羧基化 漆酶濃度為〇. 1?5. Omg/mL，海藻酸鈉的濃度為1 %?5 %，CaCl2的濃度為1 %?5 %。
5. 根據權利要求1所述的固定化漆酶形態為水凝膠微球，微球直徑範圍為Imm? 10mnin
6. 根據權利要求1所述，製備的固定化漆酶微球可直接用於廢水中2,4_二氯苯酚的降 解。
7. 根據權利要求6所述，固定化漆酶微球對2,4-二氯苯酚的降解在pH4?6溶液中進 行。
【文檔編號】C12N9/96GK104313006SQ201410594454
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月30日 優先權日:2014年10月30日
【發明者】李娟 , 劉芳, 劉又年, 陳倩, 孫曉毅 申請人:中南大學