生產多肽的細胞的製作方法

2023-05-13 00:31:11

專利名稱：：生產多肽的細胞的製作方法
技術領域：
：本發明屬於多肽生產的領域。其描述了含有選擇性剪接核酸的核酸、包含此核酸的細胞、分離表達異源多肽細胞的方法、以及生產異源多肽的方法，在所述分離表達異源多肽細胞的方法中所利用的核酸包含編碼異源多肽的第一核酸、包含選擇性剪接核酸的第二核酸、以及編碼至少跨膜結構域的片段或GPI-錨定物的信號肽的第三核酸。
背景技術：
：生產重組多肽的表達系統是本領域技術中眾所周知的並且由下述文章描述，例如，Marino，M.H.，Biopharm.2(1989)18-33;Goeddel，D.V.等人，MethodsEnzymol.185(1990)3-7;Wurm,F.和Bernard,A.，Curr.Opin.Biotechnol.10(1999)156-160。製藥應用所用多肽和蛋白的生產優選使用哺乳動物宿主細月包，如CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、Sp2/0細胞、COS細胞、HEK細胞、？虹1^:6@細胞等。編碼多肽的核酸優選包含在核酸，例如表達載體中引入宿主細胞。表達載體的基本元件是原核質粒增殖單位，例如包括複製起點和選擇標記、真核選擇標記、和一個或多個表達感興趣的結構基因的表達盒的大腸桿菌，所述表達盒各自包含啟動子、結構基因、和包含多聚腺苷酸化信號的轉錄終止子。為了在哺乳動物細胞中瞬時表達，可以包含哺乳動物複製起點，如SV40Ori或來自EBV的OriP。啟動子可以選擇組成型或誘導型的啟動子。為了使轉錄最優化可以在5，非翻譯區包含一段Kozak序列。為了mRNA加工，特別是轉錄終止和前體mRNA的剪接，依賴於結構基因的構造(外顯子-內含子結構形式)，可以包括mRNA剪接信號以及多聚腺苷酸化信號。基因的表達表現為瞬時或永久的表達。感興趣的多肽可以是分泌型多肽或者胞質多肽，所述分泌型多肽包含N末端延伸(也稱為信號序列)，此延伸對多肽通過細胞和進入胞外媒介的運輸/分泌是必需的。為了多肽的大規模生產需要建立高生產型細胞株。轉染宿主細胞林如CHO細胞、NS0細胞、Sp2/0細胞、BHK細胞、COS細胞、PER.C6⑧細胞或HEK細胞之後，一般而言大多數具有不同特徵的克隆的獲得是由於例如，從瞬時轉染或穩定整合質粒表達的多肽的廣泛不同。為了選擇的目的，引入細胞的核酸有額外的選擇性標記，例如帶有對另一致死性物質抗性的基因。轉染後通過在適當的選擇性培養液中生長，可以分離高生產型克隆。這個過程是費時的因而需要大筆開支。發展出幾個方法來處理這個問題。這些辦法其一是基因擴增。其中用載體/質粒轉染二氫葉酸還原酶缺陷(DHFR)的細胞，所述載體/質粒包含表達DHFR蛋白的第一表達盒和表達感興趣的異源多肽的第二表達盒。通過利用去除甘氨酸、次黃嘌呤和胸腺嘧啶的培養液建立了選擇性生長條件。加入曱氨喋呤(MTX)以擴增DHFR的抑制物。(Kaufman,R.J.等人，JMol.Biol.159(1982)601-621;US4,656,134)或者可以將才艮告分子融合入異源多肽，如氯黴素-乙醯氨基轉移酶、螢光素酶、綠色螢光蛋白、或p-半乳糖苷酶，因為所述才艮告分子是高生產型細胞株所需要的而且還作為間接的選擇標記。選擇發生在添加的外源物質或輔因子存在的情況下。鑑定高生產型克隆的另一個方法是，經由內部核糖體進入位點(IRES)的選擇性標記基因和編碼異源多肽的結構基因的連鎖轉錄。通過這一設計異源多肽的表達可以與選擇性標記的表達關聯起來。人源免疫球蛋白由特化的淋巴細胞B細胞產生。這些細胞不只分泌免疫球蛋白(slg)它們還使免疫球蛋白作為質膜-結合型免疫球蛋白(mlg)呈現在它們的細胞外膜。這些mlg在免疫應答起始時起重要作用。呈現的質膜-結合型免疫球蛋白具有它們相應抗原的細胞受體的功能。從1980年開始，有關分泌型和質膜-結合型免疫球蛋白的起源的文章發表面世。Early等人(Early，P.等人，Cell20(1980)313-319)報導，在小鼠中有兩種編碼免疫球蛋白重鏈的mRNA，所述mRNA源自單一免疫球蛋白—基因的相同原始轉錄本。分泌形式(slg)和質膜-結合形式(mlg)的形成由重鏈前體mRNA的選擇剪接所產生。對於slg亞型，所有編碼免疫球蛋白結構域的外顯子和編碼C末端結構域外顯子之後的內含子都保留在mRNA中，而位於內含子中終止密碼子下遊的多聚腺苷酸化信號用來剪切和多聚腺苷酸化原始轉錄本。對於mlg亞型，在編碼分泌型形式C末端結構域(即分別為CH3或CH4)之後的選擇剪接5，供體位點連接恆定區與編碼跨膜結構域的下遊外顯子Ml和M2。在這種情況下，分泌型形式的編碼末端胺基酸的序列和終止密碼子、及其鄰近內含子區的slg形式的多聚腺苷酸化信號隨同內含子的剪接一起被移除。例如，編碼分泌型免疫球蛋白重鏈形式的mRNA與編碼質膜-結合型免疫球蛋白重鏈形式的mRNA的比例為10:1到100:1之間。這個比例主要是在前體mRNA剪接過程中確定的。翻譯和翻譯後控制機制只起次要的作用(參見，例如Xiang，S.D.等人，Immun.CellBiol.79(2001)472-481)。酸序列和二級結構。不同的是，slg重鏈C末端的延伸包含跨膜結構域。這個跨膜結構域的長度一般在約40和約75個胺基酸殘基之間。對於鼠和人的免疫球蛋白，所述跨膜結構域能被再分為三個截然不同的結構區13-67個氛基酸殘基的N末端胞外區、25個胺基酸殘基的中心保守的跨膜伸展區、以及3-28個胺基酸殘基的C末端胞質區(Major，J.G.等人，Mol.Immunol.33(1996)179-187)。表達載體包含可擴增的選擇性基因、螢光蛋白基因和編碼所需產物的基因，它們以WO01/04306中已報導方式連接使轉錄和翻譯最優化。在WO01/38557中報導了用於篩選多重轉化/轉染的細胞以鑑定表達至少兩個感興趣的肽或蛋白質的細^^包的方法。這兩個肽/蛋白質通過IRES(內部核糖體進入位點)連接於螢光標記基因。美國專利申請2003/0033616報導了包含成像標記轉基因的轉基因動申請2005/0032127報導了在溫和條件下從細胞混合物或細胞培養物中非侵入的選擇單個活細胞的方法，所述方法與通過焚光顯微鏡檢測法檢測的特異生產性能有關。鑑定和分離生產分泌型蛋白質的細胞的方法在美國專利申請2002/0168702有所報導。在美國專利申請2004/0148647中報導了表達載體，所述載體由功能性連接於倉鼠啟動子的編碼感興趣蛋白質的基因、編碼螢光蛋白的基因、和優選可擴增的選擇基因組成。發明概述本發明包含核酸，所述核酸從5，到3，的方向包含a)編碼異源多肽不具有符合讀碼框的翻譯終止密碼子的第一核酸，b)起始於5'剪接供體位點並且終止於3'剪接受體位點的第二核酸，其包含符合讀碼框的翻譯終止密碼子和多聚腺苷酸化信號，和c)第三核酸其編碼i)至少跨膜結構域的片段，或ii)GPI-錨定物信號肽。本發明另外的方面是適合於真核細胞的包含本發明的核酸的載體，以及包含根據本發明的至少一個核酸的真核細胞。本發明還包括選擇表達異源多肽的真核細胞的方法，藉此該方法包括a)用核酸轉染真核細胞，所述核酸從5，到3，的方向包含i)編碼異源多肽不具有符合讀碼框的翻譯終止密碼子的第一核酸，ii)起始於剪接供體位點並且終止於剪接受體位點的第二核酸，其包含符合讀碼框的翻譯終止密碼子和多聚腺苷酸化信號，iii)第三核酸其編碼iiia)至少跨膜結構域的片段，或iiib)GPI-錨定物信號肽，b)在一定條件下培養所迷轉染後的細胞，所述條件包括適於從所述核酸生產前體mRNA，適於所述前體mRNA加工，以及適於所述加工後mRNA翻譯成多肽，其中所述轉染細胞通過選擇剪接所述前體mRNA，產生可溶性的異源多肽和質膜-結合型異源多肽，和c)選擇具有質膜-結合型異源多肽的細胞作為所述表達異源多肽的細胞。在一個實施方案中發明的方法是選擇表達免疫球蛋白真核細胞的方法，藉此該方法包括a)用核酸轉染真核細胞，所述核酸從5，到3'的方向包含i)編碼免疫球蛋白重鏈不具有符合讀碼框的翻譯終止密碼子的第一核酸，ii)起始於剪接供體位點並且終止於剪接受體位點的第二核酸，其包含符合讀碼框的翻譯終止密碼子和多聚腺苷酸化信號，iii)第三核酸其編碼iiia)至少跨膜結構域的片段，或iiib)GPI-錨定物信號肽，b)在一定條件下培養所述轉染後的細胞，所述條件包括適於從所述核酸生產前體mRNA、適於所述前體mRNA加工、以及適於所述加工後mRNA翻譯成免疫球蛋白重鏈，其中所述轉染細胞通過選擇剪接所述前體mRNA，產生可溶性的免疫球蛋白重鏈和質膜-結合型免疫球蛋白重鏈，和c)選擇具有質膜-結合型免疫球蛋白重鏈的細胞作為所述表達免疫球蛋白的細胞。另外本發明還包含生產由根據本發明的核酸編碼的多肽的方法，通過a)提供真核細胞，b)用4艮據本發明的核酸轉染所述真核細胞，c)在適合所述細胞表達的條件下培養所述轉染後細胞，d)從所述細胞的培養液或胞質中回收所述多肽。另外，本發明還包含核酸，所述核酸從5，到3，的方向包含a)第一多克隆位點，b)起始於5，剪接供體位點並且終止於3，剪接受體位點的核酸，其中i)所述核酸包含翻譯終止密碼子和多聚腺苷酸化信號，和ii)所述核酸在前體mRNA加工過程中不會被組成性移除，c)第二多克隆位點。該發明此外包含未被組成性移除的根據本發明的核酸的栽體。發明詳述本發明包含選擇表達異源多肽或蛋白質的真核細胞的方法，藉此該方法包含a)用核酸轉染真核細胞，所述核酸從5，到3，的方向包含i)編碼異源多肽或蛋白質不具有翻譯終止密碼子的第一核酸，ii)起始於5，剪接供體位點和終止於3，剪接受體位點的第二核酸，其包含符合讀碼框的翻譯終止密碼子和多聚腺苷酸化信號，iii)第三核酸其編碼iiia)至少跨膜結構域的片段，或iiib)GPI-錨定物信號肽，b)在一定條件下培養所述轉染後的細胞，所述條件包括適於從所述核酸生產前體mRNA、適於所述前體mRNA加工、以及適於所述加工後mRNA翻譯成多肽或蛋白質，其中所述轉染後細胞通過選擇剪接所述前體mRNA，產生可溶性的異源多肽或蛋白質以及質膜-結合型異源多肽或蛋白質，和c)選擇具有質膜-結合型異源多肽或蛋白質的細胞作為所述表達異源多肽或蛋白質的細胞。對實施本發明有用的方法和技術在下列文獻中做了描述，例如，Ausubel，F.M.(編專尋)，CurrentProtocolsinMolecularBiology，巻I至!]III(1997);Glover,N.D"和Hames，B.D.編豐尋，DNACloning:APracticalApproach,巻I和II(1985)，牛津大學出版社；Freshney，R.I.(編輯)，AnimalCellCulture-apracticalapproach,IRLPressLimited(1986);Watson,J.D.等人，RecombinantDNA，第二版，CHSLPress(1992);Winnacker，E丄.，FromGenestoClones;N.Y"VCHPublishers(1987);Celis，J.編輯，CellBiology,第二版，AcademicPress(1998);Freshney，R.I.，CultureofAnimalCells:AManualofBasicTechnique,笫二版,AlanR.Liss，Inc.,N.Y.(1987)。重組DNA技術的應用使能夠生產多肽的多種衍生物。舉例來說，能夠在其單個或幾個胺基酸位置通過置換、改造、交換、刪除或插入來修飾這樣的衍生物。例如，可以通過定點誘變來進行修飾或衍生。本領域技術人員可以不費力的做到這種修飾(參見例如，Sambrook，J.等人，分子克隆實驗指南(1999)冷泉港實驗室出版社，紐約，美國；Hames，B.D.，和Higgins,S.G"Nucleicacidhybridization-apracticalapproach(1985)IRL出版社，牛津，英國)。在本發明的範圍內，使用的一些術語定義如下此處所用的"核酸"是指多聚核苷酸分子，例如DNA和/RNA之類。這分子^4是一個或;個天然;在的多聚^普酸分子或i片段與一V或多個合成的多聚核苷酸分子的組合。此定義還包含，天然存在的多聚核苷酸分子中的一個或多個核苷酸被改變(例如通過突變刪除或添加)的情況。可以將核酸分離，或者將其整合入另一個核酸，如在表達載體或真核宿主細胞的染色體中。核酸的特徵也在於其核酸序列由單個核苷酸組成。從對應的的核酸是本領域公知的。因此氨基*列同樣由其核酸表徵。同樣由對應的氨基*列給出核酸。本申請中可互換使用的表達"質粒"或"載體，，包含，例如穿梭和表達質粒還有轉染質粒。通常，質粒也將包含複製起點(例如ColEl和oriP複製起點)和選擇標記(例如氨苄青審素或四環素抗性基因)以分別用於在細菌中複製和選擇質粒。"表達盒"是指這樣的構建體，其包含的必需調控元件在細胞中至少表達所含有結構基因。可選的，也包含能使表達的多肽或蛋白質分泌的附加元件。"基因"是指如在染色體或質粒上的片段，其為多肽或蛋白質表達所必需的。除編碼區外，基因還包含其它功能元件，所述功能元件包含啟動子、一個或多個內含子和/或外顯子，以及一個或多個終止子。本申請中所用的術語"結構基因"是指基因的編碼區，即外顯子，沒有信號序列但是有插入的內含子。"選擇標記"是指在存在或沒有對應的選擇物質時，該基因4吏得帶有這個基因的細胞能被特異的選擇留下或者相反的基因。有用的正選擇標記是抗生素抗性基因。這種選擇標記允許被該基因轉化的宿主細胞在對應抗生素存在時被正選擇留下來；未轉化的宿主細胞在選擇培養條件下(即選擇物質存在時，在選擇培養液中)將不能生長或存活。選擇性標記可以是正向的、負向的或雙功能的。正選擇標記使得帶有標記的細胞選擇留下，而負選擇標記使得帶有標記的細胞被選擇消除。通常，選擇標記會帶有對藥物的抗性或對宿主細胞代謝或分解代謝缺陷的補償性。真核細胞有用的選擇標記包含，例如氨基糖甙磷酸轉移酶(APH)基因，如潮黴素磷酸轉移酶(hyg)、新黴素和G418APH、二氫葉酸還原酶(DHFR)、胸苷激酶(tk)、穀氨醯胺合成酶(GS)、天冬醯胺合成酶、色氨酸合成酶(選擇物質為吲哚)、組氨醇脫氫酶(選擇物質為組氨醇D)以及編碼嘌呤黴素、博來黴素、腐草黴素、氯黴素、Zeocin和黴酚酸抗性的基因。在WO92/08796和WO94/28143中描述了更多的標記基因。此處所用的"調控元件，，是指以順式和/或反式存在的核苷酸序列，其為包含感興趣的結構基因的基因進行轉錄和/或翻譯所必需的。轉錄調控元件通常包含位於要表達的基因序列上遊的啟動子、轉錄起始和終止的位點、以及多聚腺苷酸化信號序列。術語"轉錄起始位點"指在基因中的核苷酸，對應於將被整合入原始轉錄本(即前體mRNA)的第一核酸；轉錄起始位點可能與啟動子序列重疊。術語"轉錄終止位點"是指通常存在於將要轉錄的感興趣的基因3'端的核苷酸序列，它引起RNA聚合酶終止轉錄。多聚腺苷酸化信號序列，或多聚腺苷酸(poly-A)附加信號為在真核mRNA3'端的特異位點的剪切提供了信號，並且轉錄後在細胞核內為剪切過的3，端加上約100-200個腺苷酸核苷酸(多聚腺苷酸尾)序列。多聚腺苷酸化信號序列可能在剪切位點上遊約10-30個核苷酸的位置含有共有序列AATAAA。翻譯調控元件包含翻譯起始(AUG)和終止密碼子(TAA、TAG或TGA)。在某些構建體中還可以包含內核糖體進入位點(IRES)。"啟動子"是指控制基因或核苷酸序列轉錄的多聚核苷酸序列，其可操縱的連接在所述基因或核苷酸序列上。啟動子含有RNA聚合酶結合和轉錄起始的信號。考慮在其中選擇/可操縱的連接序列的表達，所用的啟動子在宿主細胞的細胞類型中是有功能的。包括各種不同來源的組成型、誘導型和抑制型的大量啟動子是本領域眾所周知的(並在資料庫如基因庫中確定的)，也是可作為或在克隆的多聚核苷酸中得到的(從例如，ATCC等儲藏庫以及其他商業或個人來源)。"啟動子"包含指導結構基因轉錄的核苷酸序列。通常情況下，啟動子位於基因的5'端非編碼或非翻譯區，接近結構基因的轉錄起始站點。啟動子中在啟動轉錄起作用的序列元件，其常常表徵為共有核苷酸序列。這些啟動子元件包含RNA聚合酶結合位點、TATA序列、CAAT序列、分化-特異性元件(DSE;McGehee，R.E.Jr.等人，Mol.Endocrinol.7(1993)551-60)、cAMP響應元件(CRE)、血清相應元件(SRE;Treisman，R.，SeminarsinCancerBiol.1(1990)47-58)、糖皮質激素響應元件(GRE)、以及其他轉錄因子的結合位點如CRE/ATF(O'Reilly,M.A.等人，J.Biol.Chem.267(1992)19938-43)、AP2(Ye，J.等人，J.Biol.Chem.269(1994)25728-34)、SPl、cAMP響應元件結合蛋白(CREB;Loeken，M.R.,GeneExpr.3(1993)253-64)和八聚體因子(總體參見，Watson等人編輯，MolecularBiologyoftheGene,第4版,TheBenjamin/CummingsPublishingCompany,Inc.(1987),和Lemaigre，F.P.和Rousseau,G.G"Biochem.J.303(1994)1-14)。如果啟動子是誘導型啟動子，則轉錄比率將響應誘導物質而升高。相反的，如果啟動子是組成型啟動子，其轉錄比率不受誘導物質調控。抑制型啟動子也廣為人知。例如，c-fos啟動子只在生長激素結合到其細胞表面受體時被特異激活。四環素(Tet)調控的表達可以通過人工雜合啟動子實現，所述人工雜合啟動子由例如，在CMV啟動子後面接著兩個Tet-操縱基因位點所組成。Tet-阻遏蛋白結合到兩個Tet-操縱基因位點上並阻止轉錄。通過加入誘導物四環素，Tet-阻遏蛋白從Tet-操縱基因位點釋放而轉錄得以進行(Gossen，M.和Bujard，H.PNAS89(1992)5547-5551)。對於其它的誘導性啟動子包含金屬疏蛋白和熱休克啟動子，參見例如，Sambrook等人(見上文)和Gossen等人，Curr.Opin.Biotech.5(1994)516-520。在真核啟動子中，已被證明具有高表達水平的強啟動子是SV40早期啟動子、腺病毒主要晚期啟動子、小鼠金屬硫蛋白-I啟動子、肉瘤病毒長末端重複序列、中國倉鼠延伸因子la(CHEF-l，參見如美國5,888,809)，人EF-la、泛素、以及人巨細胞病毒早期啟動子(CMVIE)。"啟動子"可以是組成型的或誘導型的。可能需要增強子(即作用在啟動子上以增強轉錄的順式作用DNA元件)與啟動子結合起作用，以提高啟動子單獨作用獲得的表達水平，而且其可能被包括作為轉錄調控元件。包含啟動子的多聚核苷酸段通常也會包含增強子序列(如CMV或SV40)。"可操縱的連接，，是指兩個或多個組分位置接近，其中如此描述的組分間有一種聯繫，所述聯繫允許它們以之預期的方式起作用。舉例來說，如果啟動子和/或增強子順式控制或調節其所連接的編碼序列轉錄，它就是可操縱的連接到編碼序列上的。通常但非必需的，"可操縱的連接"的DNA序列是連續的，其中需要連續的在讀碼框中向兩個蛋白編碼區加入諸如分泌前導肽和多肽、或多肽和跨膜結構域、或多肽和GPI-錨定物信號肽、或多肽和翻譯終止密碼子。然而，儘管可操縱連接的啟動子一般位於編碼序列上遊，它也不是必須與之相連續。增強子不需要與之相連。如果增強子能提高編碼序列的轉錄，它就是可操縱的連接到編碼序列上的。可搮縱連接的增強子可以在編碼序列的上遊、中間或者下遊，並且與啟動子之間有相當大的距離。如果多聚腺苷酸化位點位於編碼序列末端的下遊，因而轉錄得以通過編碼序列進入多聚腺苷酸化序列進行，那它就是可操縱的連接到編碼序列的。通過本領域周知的重組方法來完成連接，例如使用PCR方法和/或在方便的限制性位點用連接法。如果沒有方便的限制性位點，那就根據常規的操作利用合成的寡核苷酸銜接子或接頭。此處所用的術語"前體mRNA的產生"是指DNA轉錄成為其互補前體mRNA的過程。真核DNA由被稱為外顯子(編碼)和內含子(非編碼)的編碼和非編碼區組成。在DNA轉錄成為其互補前體mRNA的過程中，外顯子和內含子的基因組結構維持不變。此處所用的術語"前體mRNA的加工，，是指轉錄後修飾的過程。在此步驟中，前體mRNA的內含子部分被剪接掉，即從前體mRNA上移除，加工後的mRNA其5'端加帽而其3，端進行了多聚腺苷酸化。在此步驟中，最後得到了核mRNA，即成熟的mRNA。本申請所用的術語"跨膜結構域"是指多肽或蛋白質，所述多肽或蛋白質在DNA水平上由至少一個包含胞外區、跨膜區和胞內區的外顯子編碼。跨膜結構域一般包含三個不同的結構區N末端胞外區、中間保守的跨膜伸展區、以及C末端胞質區。在一個實施方案中，跨膜結構域從N末端到C末端的方向包含胞外區和跨膜區。跨膜結構域可能還包含胞內區或胞質區。本申請所用的術語"跨膜結構域的片段"是指跨膜結構域橫跨細胞膜的部分，即位於細胞膜中的部分，即跨膜伸展區。術語"選擇性剪接核酸，，是指起始於5，剪接供體位點並且終止於3，剪接受體位點的核酸。此核酸含有翻譯終止密碼子和多聚腺苷酸化信號。這個選擇性剪接核酸包含不會從對應前體mRNA被組成性剪接掉的非編碼區，諸如，舉例來說，在編碼免疫球蛋白重鏈CH3或CH4結構域的外顯子之後的內含子。發生在選擇性剪接核酸的5，剪接供體位點的"選擇性剪接事件"是決定性事件，決定選擇性剪接核酸是否從前體mRNA剪接掉或者是否至少留下部分並包含在成熟的(加工後的)mRNA中。此處所用的術語"選擇剪接，，及其語法等同成分是指在真核細胞中，從單一的前體mRNA開始，由於對一個或多個內含子進行不同的加工，可以得到不同的成熟mRNA，從而表達出不同亞型的多肽。在本發明的一個實施方案中，產生的前體mRNA的單個的(即只有一個)內含子可被選擇性剪接。在另一個實施方案裡，第二核酸可以被選擇性剪接。在此外另一個實施方案裡，第二核酸作為選擇性剪接內含子包含其內。不同的加工過程就是"是或不是"的決定，即在選擇性剪接過程中要處理的內含子(即"選擇性剪接核酸")將會或者至少部分保留或者被剪接掉。這不需要被理解為導致不同的外顯子跟隨其後的分支點機制。它實際上是其中選擇性剪接核酸或者被剪接掉或者至少部分存留在成熟的mRNA中的機制。通過這種機制，選擇性剪接核酸以及其中包含的符合讀碼框的翻譯終止密碼子都會或者淨皮保留或者被移除。選擇性剪接是真核細胞的重要調控機制。通過選擇性剪接，可以從相同前體mRNA得到成熟mRNA中外顯子的不同組合，產生由相同DNA編碼的多種不同蛋白質。此處所用的術語"表達"是指在細胞中發生進行的轉錄和/或翻譯。所需產物在細胞中的轉錄水平可以基於細胞內存在的相應mRNA數量來確定。舉例來說，所選序列轉錄來的mRNA可以由PCR或由RNA雜交定量(參見Sambrook等人，分子克隆實驗指南，冷泉港實驗室出版社(1989))。可以通過多種方式定量多肽，如通過ELISA、通過多肽生物活性的測定、或者使用獨立於這類活性之外的測定如免疫印跡、SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳法、核磁共振(NMR)或放射免疫法，例如使用識別並結合多肽的抗體(見Sambrook等人，1989年，見上文)。"宿主細胞，，指編碼多肽或蛋白質的異源核酸引入的細胞。宿主細胞包括用於質粒增殖的原核細胞，和用於表達異源核酸的真核細胞。真核細胞優選是哺乳動物細胞。哺乳動物細胞優選是CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、Sp2/0細胞、COS細胞、HEK細胞、PER,C6⑧細胞。"多肽，，是由肽鍵相連的胺基酸組成的聚合物，無論是天然產生的或人工合成的。少於約20個胺基酸殘基的多肽可稱為"肽"，而由多於100個胺基酸殘基組成的多肽或由兩個或更多多肽鏈組成的多肽可稱為"蛋白質，，。"蛋白質"是大分子，所述大分子包含至少一個長度為ioo個胺基酸或以上的多肽鏈，或包含兩個或更多的多肽鏈。多肽和蛋白質可能還包含非肽的組分，如糖類基團、金屬離子、脂質、羧酸酯或其組合。非肽取代物可能由其中引入該多肽或蛋白質的細胞加入，並可能隨細胞類型變化。多肽和蛋白質在此處是根據其胺基酸的骨架結構而定義的；附加物諸如糖類一般不會詳細說明，但仍然可能存在。"異源DNA"或"異源核酸"指並非天然存在於特定宿主細胞的DNA分子或核酸，或一組DNA分子或一組核酸。特定宿主細胞的異源DNA分子可能含有來自宿主細胞種類的DNA(即內源性DNA)，只要該宿主DNA與非宿主DNA(即異源DNA)組合。例如，DNA分子含有編碼多肽的非宿主DNA部分，其可操縱的連接到包含啟動子的宿主DNA部分，則所述DNA分子被認為是異源DNA分子。反過來說，異源DNA可能包含內源性結構基因可操縱的連接到異源啟動子上。由非宿主(即異源)核酸編碼的肽或多肽是"異源"肽或多肽。此處所用的術語"生物活性多肽，，是指有機分子，如諸如多肽、蛋白質、糖蛋白、核蛋白、粘蛋白、脂蛋白、合成多肽或蛋白質的生物大分子，所述分子在處於或進入人造生物系統控制時會導致生物學效應，例如使用細胞林和病毒、或在動物體內的(包含但不限於鳥類和哺乳動物，也包含人在內)的生物測定。該生物學效應可以是但不局限於，酶抑制或活化、結合到受體或配體的結合位點或周邊、信號觸發或信號調節。在一個實施方案裡，所述生物活性多肽是從包含免疫球蛋白、免疫球蛋白片段、免疫球蛋白綴合物和抗融合肽(antifusogenicpeptide)的一組多肽中選定的。生物活性的分子不限於，例如激素、細胞因子、白細胞介素、免疫球蛋白、抗融合肽、生長因子、受體的配體、其激動劑或拮抗劑、細胞毒性試劑、抗病毒試劑、顯象劑、酶抑制劑、酶的激活劑或酶活性調節劑，如變構物，以及這些的綴合物。本申請所用的術語"胺基酸"是指羧基oc-胺基酸，它可以直接或作為前體被核酸編碼，包含丙氨酸(三字母密碼Ala，單字母密碼A)，精氨酸(Arg，R)、天冬醯胺(Asn，N)、天門冬氨酸(Asp，D)、半胱氨酸(Cys，C)、穀氨醯胺(Gln，Q)、穀氨酸(Glu，E)、甘氨酸(Gly，G)、組氨酸(His，H)、異亮氨酸(Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)、賴氨酸(Lys，K)、蛋氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F)、脯氨酸(Pro,P)、絲氨酸(Ser，S)、蘇氨酸(Thr，T)、色氨酸(Trp，W)、酪氨酸(Tyr，Y)和纈氨酸(Val，V)。"克隆載體"是諸如質粒、粘粒、噬菌粒或細菌人工染色體(BAC)的核酸，其在宿主細^^中有自主複製的能力。克隆載體通常包含一個或少量限制性內切酶識別位點，所述限制性內切酶識別位點允許載體在不喪失基本生物學功能的前提下，用可確定的方式插入核酸，以及編碼選擇標記的核苷酸序列，所述選擇標記適用於鑑別和選擇用克隆載體轉化過的細胞。選擇標記通常包括提供四環素、新黴素、G418或氨爺青黴素抗性的基因。"表達載體"是編碼要在宿主細胞中表達的異源多肽或蛋白質的核酸。通常情況下，表達載體包含原核質粒的增殖單位(如對於大腸桿菌，包含原核複製起點和原核選擇標記)、真核篩選標記、和一個或多個表達感興趣的核酸的表達盒，每個表達盒包含啟動子、核酸、和轉錄終止子(包括多聚腺苷酸化信號)。基因表達通常位於啟動子控制下，而這樣的結構基因就是所述的"可操縱的連接"到啟動子。同樣，如果調控元件調節核心啟動子的活性。調控元件和核心啟動子就是可操縱連接的。"多順反子轉錄單元，，是其中一個以上的結構基因位於相同啟動子的控制下的轉錄單元。"分離的多肽，，或"分離的蛋白，，是基本上沒有細胞成分汙染的多肽或蛋白質，諸如沒有共價連接的糖類、脂類、或其他蛋白質雜質，以及天然狀態下與多肽或蛋白一起的非蛋白質雜質。通常，分離的多肽/蛋白質的製備含有高度純化形式的多肽/蛋白質，即至少約80%的純度、至少約90%的純度、至少約95%的純度、大於95%純度、或大於99%的純度。顯示某個特定的製備含有分離的多肽或蛋白質的方法之一是，通過製備物的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯醯胺凝膠電泳及凝膠的考馬斯亮藍染色之後的單一條帶的外觀來顯示。但是，術語"分離的"並不排除同樣的多肽或蛋白質以另外的物理形式，如二聚體或選擇性糖基化或衍生形式存在。此處所用的術語"免疫球蛋白"是指實質上由免疫球蛋白基因編碼的一個或多個多肽組成的蛋白質。這個定義包含變種，所述變種如突變形式(即替換、刪除和插入一個或多個胺基酸的形式)、截短的形式、以及融合形式。公認的免疫球蛋白基因，包含不同的恆定區基因，以及無數的免疫球蛋白可變區基因。免疫球蛋白可能以多種形式存在，包含例如Fv、Fab、和F(ab)2以及單鏈(scFv)(如Huston，J.S.等人，PNASUSA85(1988)5879-5883;Bird,R.E.等人，Science242(1988)423-426;以及總體來說，Hood等人，Immunology,BenjaminN.Y"第二版(1984)和Hunkapiller,T.和Hood,L.,Nature323(1986)15-16)。每個免疫球蛋白重型和輕型多肽鏈，如果存在，可能包含恆定區(一般在羧基末端部分)。重鏈的恆定區介導了抗體的結合i)結合到有Fc受體的細胞，如吞噬細胞，或ii)結合到有初生Fc受體(FcRn)也稱為Brambell受體的細胞。它也介導了一些因子的結合，包含經典的補體系統因子如Clq組分。此外跨膜結構域可以在免疫球蛋白重鏈C末端恆定域的後面，即CH3或CH4域。這個跨膜結構域允許形成質膜-結合型免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或免疫球蛋白-融合多肽。每個免疫球蛋白重型和輕型多肽鏈，如果出現，可能包含可變結構域(一般在羧基末端部分)。免疫球蛋白的輕或重鏈的可變結構域包含不同部分，即四框架區域(FR)和三超變量區域(CDR)。術語"至少片段"是指完整的核酸或完整的多肽的一小部分，即至少20%、至少40%、至少60%、或至少80。/。完整的核酸、多肽、或域。舉例來說，"核酸編碼免疫球蛋白CH3或CH4結構域的至少片段"是指編碼完整的免疫球蛋白CH3或Ch4結枸域的核酸的一小部分，即至少20%、至少40%、至少60%、或至少80%的編碼完整的免疫球蛋白CH3或CH4域的核酸。在一個實施方案裡，免疫球蛋白重鏈的片段是免疫球蛋白重鏈的C末端片段。術語"符合讀碼框的翻譯終止密碼子，，是指接在閱讀框無移碼的核酸編碼區之後的翻譯終止密碼子(TAA、TAG或TGA)，所述閱讀框是對前面的核酸編碼區而言的，該密碼子即是終止編碼區翻譯過程的。符合讀碼框的翻譯終止密碼子是可操縱的連接到前面的核酸編碼區的。術語"沒有符合讀碼框的翻譯終止密碼子，，是指在指定的核酸裡缺少翻譯終止密碼子(TAA、TAG或TGA)和/或可以在核酸內部或其編碼區末端找到翻譯終止密碼子的存在，但是由於一個或兩個鹼基對的移動，在加工後的mRNA翻譯過程中不能被識別(即不符合讀碼框，不是可操縱的連接)，因此在翻譯過程中不能終止編碼區。本申請中指的"轉錄終止子"是50-750個鹼基對長度的DNA序列，它賦予RNA聚合酶終止mRNA合成的信號。非常有效的(強)終止子在表達盒的3'端能可行的阻止RNA聚合酶從此讀過，尤其是當使用強啟動子的時候。無效的轉錄終止子，可導致形成操縱子樣的mRNA，其可能是不希望的(如質粒編碼)的基因表達的原因。本申請中的"在前體mRNA加工過程中沒有組成性的移除"和"沒有組成性的從(對應)前體mRNA剪接掉，，是指在前體mRNA加工過程中沒有普遍發生的剪接加工，即核酸的特異內含子只是有時在前體mRNA加工過程中被移除。結果是，得到兩個不同的成熟mRNA，其一有這個內含子的至少部份而另一個沒有這個內含子。該申請中所用的術語"GPI-錨定物"是指連接到多肽或蛋白質C末端的翻譯後修飾。"GPI-錨定物，，有核心結構，其包含至少一個磷酸乙醇胺殘基、三甘露糖苷(trimaimoside)、氨基葡萄糖殘基以及肌醇磷脂。儘管這樣核心結構的GPI-錨定物通常擁有某微觀不均一性(microheterogeniety)，因而具有GPI-錨定物的蛋白質通常是帶有相同核心結構不同側鏈修飾的同源GPI-錨定物的蛋白質混合物。術語"GPI-錨定物的信號肽"是指多肽或蛋白質的C末端胺基酸序列，所述多肽或蛋白質由GPI-錨定物連上的胺基酸、可選的間隔肽和疏水肽組成。幾乎所有的這種信號肽(即可選的間隔肽和疏水肽)都是由GPI-轉氨酶在翻譯後移除的，而且在GPI-錨定物的核心磷酸乙醇胺的氨基基團與GPI-錨定物連接的胺基酸之間形成鍵。用異源核酸轉染後，表達異源核酸編碼的異源多肽的細胞被選出。為了選擇使用標記。該標記顯示了總體細胞中已成功轉化的細胞，並有利於選擇和分離這些細胞。可以使用不同的標記，諸如，例如可選擇標記，或如綠色焚光蛋白(GFP)的可檢測標記。細胞的選擇可以單步執行或通過多個步驟進行。在單一/多重步驟的程序中，第一選擇可以基於如選擇標記，例如可檢測標記的閾值水平進行。例如，對於通過流式細胞儀的選擇(如由流式細胞儀-螢光激活細胞分選)，設定螢光闞值水平，而細胞螢光超過這一閾值水平都被選中。或者，可以收集樣品總體細胞中螢光強度前1-15%的細胞(即具有最強檢測標記的15。/。的細胞)、或前1-10%、或前1-5%、或前5-10%、或5-6%的細胞。另一種選擇細胞的方法是免疫結合，例如結合到以蛋白A或特定的免疫球蛋白包被的磁珠。所選欄的細胞可作為基本的總體進行進一步的選擇步驟，例如通過單細胞接種、培養和ELISA分析(酶聯免疫吸附試驗)，或通過有限稀釋克隆，或通過在選擇培養液的選擇性培養條件下培養數天以擴大數量，並進一步用流式細胞儀選擇，或通過另外的具有更高閾值水平的流式細胞儀選擇，這可以例如，基於前述的流式細胞儀選擇中檢測的螢光強度，或通過免疫沉澱法(又見例如，WO2005/020924)。才艮據本發明選擇細胞，可以通過從以下方法集合中選取一種方法來進行，包括流式細胞儀、ELISA法、免疫沉澱、免疫親和柱色譜法、磁珠免疫親和分選、基於顯微鏡的分離方法或免疫結合。在一個實施方案裡，根據本發明選擇細胞，可以通過從以下方法集合中選取一種方法來進行，包括流式細胞儀、ELISA法、免疫沉澱、免疫親和柱色譜法、磁珠免疫親和分選、基於顯微鏡的分離方法或免疫結合，繼之以從以下集合中選取的方法，包括單細胞接種和培養、有限稀釋、或通過培養擴大數量，繼之以從以下集合中選取的方法，包括流式細胞儀、免疫沉澱、免疫親和柱色譜法、磁珠免疫親和分選、基於顯微鏡的分離方法或ELISA。本領域/^知的轉染方法和載體的效率非常高，因此將得到很多轉染後的細胞，標記是優選的，其也允許將轉染後細胞的表達產量與檢測的標記"強度"相關聯。因此，它具有連接感興趣異源多肽的表達和標記的表達的功能。本發明使用剪接(即選擇性剪接)的方法從相同核酸(即從相同表達盒)表達異源多肽和標記，藉此例如沒有使用IRES。本發明的標記是表達的異源多肽的質膜結合的形式。本發明的可選擇標記包含作為異源多肽的N末端部分和作為至少跨膜結構域的片段或GPI-錨定物的C末端部分。因記)是同樣的。本發明包含選擇表達異源多肽的真核細胞的方法，藉此該方法包含a)用核酸轉染真核細胞，所述核酸從5，到3'的方向包含i)編碼異源多肽的笫一核酸，其沒有符合讀碼框的翻譯終止密碼子，ii)起始於剪接供體位點並且終止於剪接受體位點的第二核酸，其包含符合讀碼框的翻譯終止密碼子和多聚腺苷酸化信號，iii)第三核酸，其編碼iiia)至少跨膜結構域的片段，或iiib)GPI-錨定物信號肽，b)在一定條件下培養所述轉染後的細胞，所述條件包含適於從所述核酸生產前體mRNA、適於所述前體mRNA加工、以及適於所述加工後mRNA翻譯成異源多肽，其中所述轉染細胞通過選擇剪接所述前體mRNA產生可溶的異源多肽和質膜-結合型異源多肽，和c)選擇具有質膜-結合型異源多肽的細胞使之成為所述表達異源多肽的細胞。在DNA轉錄過程中，得到了DNA的拷貝，稱之為前信使RNA(前體mRNA)。這個前體mRNA具有與模板DNA相同的構造，即它有基因組的內含子-外顯子結構。只有外顯子包含編碼多肽的胺基酸序列信息。因此，內含子在翻譯之前需要從前體mRNA移除。此過程稱為RNA-剪接。"可剪接的核酸"其特徵在於至少有5'剪接供體位點、3，剪接受體的位點、以及通常位於受體上遊20-50個鹼基所謂的分支點。這種結構影響了RNA剪接過程中，從前體mRNA上的5'剪接供體位點到3'剪接受體位點的識別和切除核酸。在剪接步驟中，產生成熟的mRNA,多肽或蛋白質是從其翻譯的。在本發明的一個實施方案裡，至少有一個核酸，優選第二核酸，是含有附加調控元件的可剪接核酸，所述附加調控元件例如符合讀碼框的終止密碼子和多聚腺苷酸化信號。但是剪接的過程不是唯一的。這是例如，可能內含子在由前體mRNA開始的前體mRNA加工過程中未被移除，並且因此至少部分嵌入了成熟mRNA。如果符合讀碼框的終止密碼子在這個"可選的"包括在內的內含子中存在，翻譯將停止在這個終止密碼子，而且產生編碼多肽的變體。識別和切除內含子往往由附加在前體mRNA的順式作用元件調控。由於他們的功能和位置，這些元件分別^f皮稱為外顯子剪接增強子(ESE)、外顯子剪接沉默子(ESS)、內含子剪接增強子(ISE)或內含子剪接沉默子(Black，D.L,，AnnuRevBiochem72(2003)291-336)。大多數真核基因的基因組DNA有內含子-夕卜顯子結構。舉例來說，編碼分泌形式的免疫球蛋白重鏈C末端結構域的外顯子內部(即分別為CH3或Ch4)是5'剪接供體位點。如果這個剪接供體位點在該重鏈前體mRNA加工過程中無效，在此外顯子之後的、其中包含終止密碼子和多聚腺苷酸化信號的內含子，將至少有部分保留在成熟的mRNA裡。然後mRNA翻譯為以CH3或CH4結構域為末端的免疫球蛋白重鏈，表現為可溶免疫球蛋白。這是免疫球蛋白重鏈的基因在免疫球蛋白分泌細胞的主要加工途徑。如果這個剪接供體位點在該重鏈前體mRNA加工過程中有效，因此相連的內含子和終止密碼子被移除。因而翻譯不會在免疫球蛋白重鏈C末端結構域之後停止。此外，翻譯繼續進行隨後的對編碼跨膜結構域外顯子的剪接。這種對免疫球蛋白重鏈基因次要的加工途徑，產生在免疫球蛋白生產細胞表面出現質膜-結合的免疫球蛋白形式。這一過程被稱為"選擇性剪接"，而在此過程中可選地移除掉的核酸(即內含子)被稱為"選擇性剪接核酸"。如果編碼異源多肽或蛋白質的核酸由/通過可選擇性剪接的核酸連接於編碼至少跨膜結構域的片段的核酸，或連接於編碼GPI-錨定物信號肽的核酸，即可選擇性剪接核酸位於這兩個核酸之間，並且藉此這三個核酸被可操縱連接，則表達異源多肽或蛋白質的兩個變體可溶性變體，即只包含多肽或蛋白質的變體；質膜-結合型變體，即包含多肽或蛋白質以及跨膜結構域或GPI-錨定物的變體。在一個實施方案中，轉染的核酸包含在表達盒內。在一個實施方案裡，第一核酸在其3，末端沒有符合讀碼框的終止密碼子。在另一實施方案中，第一、第二和第三核酸是可操縱連接的。在一個實施方案中，第三核酸編碼至少跨膜結構域的片段。在另一實施方案中，第三核酸編碼GPI-錨定物信號肽。在本發明的一個實施方案裡，第一核酸編碼的多肽選自一組蛋白質，其包含免疫球蛋白重鏈、免疫球蛋白輕鏈、生物活性多肽、它們的片段以及它們的融合多肽。在一個實施方案中，第三核酸編碼至少免疫球蛋白跨膜結構域的片段。更具體而言，本發明包含選擇表達免疫球蛋白重鏈的真核細胞的方法，藉此該方法包含a)用核酸轉染真核細胞，所述核酸從5，到3，的方向包含i)編碼免疫球蛋白重鏈的第一核酸，其沒有符合讀碼框的翻譯終止密碼子，ii)起始於剪接供體位點並且終止於剪接受體位點的笫二核酸，其包含符合讀碼框的翻譯終止密碼子和多聚腺苷酸化信號，iii)第三核酸，其編碼iiia)至少跨膜結構域的片段，或iiib)GPI-錨定物信號肽，b)在一定條件下培養所述轉染後的細胞，所述條件包含適於從所述核酸生產前體mRNA、適於所述前體mRNA加工、以及適於所述加工後mRNA翻譯成免疫球蛋白重鏈，其中所述轉染細胞通過選擇剪接所述前體mRNA，產生可溶性免疫球蛋白重鏈和質膜-結合型免疫球蛋白重鏈，和c)選擇具有質膜-結合型免疫球蛋白重鏈的細胞作為所述表達免疫球蛋白的細胞。在一個實施方案中，本發明包含選擇表達免疫球蛋白真核細胞的方法，藉此該方法包括a)用核酸轉染真核細胞，該核酸包含免疫球蛋白輕鏈的第一表達盒和第二表達盒，所述第二表達盒從5，到3，的方向包含i)編碼免疫球蛋白重鏈的第一核酸，其沒有符合讀碼框的翻譯終止密碼子，ii)起始於剪接供體位點並且終止於剪接受體位點的第二核酸，其包含符合讀碼框的翻譯終止密碼子和多聚腺苷酸化信號，iii)第三核酸其編碼iiia)至少跨膜結構域的片段，或iiib)GPI-錨定物信號肽，b)在一定條件下培養所述轉染後的細胞，所述條件包括適於從所述核酸生產前體mRNA、適於所述前體inRNA加工、以及適於所述加工後mRNA翻譯成免疫球蛋白重鏈,其中所述轉染細胞通過選擇剪接所述前體mRNA，產生可溶性免疫球蛋白和質膜-結合型免疫球蛋白，和c)選擇具有質膜-結合型免疫球蛋白的細胞使之成為所述表達免疫球蛋白的細胞。在一個實施方案中，包含本發明的選擇表達免疫球蛋白真核細胞的方法，藉此該方法包含a)用兩個核酸同時或相繼地轉染真核細胞，藉此一個核酸包含免疫球蛋白輕鏈的表達盒，而另一個核酸含有的表達盒從5，到3'的方向包含i)編碼免疫球蛋白重鏈的第一核酸，其沒有符合讀碼框的翻譯終止密碼子，ii)起始於剪接供體位點並且終止於剪接受體位點的第二核酸，其包含符合讀碼框的翻譯終止密碼子和多聚腺苷酸化信號，iii)第三核酸其編碼iiia)至少跨膜結構域的片段，或iiib)GPI-錨定物信號肽，b)在一定條件下培養所述轉染後的細胞，所述條件包含適於從所述核酸生產前體mRNA、適於所述前體mRNA加工、以及適於所述加工後mRNA翻譯成免疫球蛋白重鏈，其中所述轉染細胞通過選擇剪接所述前體mRNA，產生可溶性免疫球蛋白和質膜-結合型免疫球蛋白，和c)選擇具有質膜-結合型免疫球蛋白的細胞使之成為所述表達免疫球蛋白的細胞。在一個實施方案中，第三核酸編碼的跨膜結構域是免疫球蛋白跨膜結構域。在本發明的一個實施方案裡，第二核酸包含僅一個5，剪接供體位點和僅一個3'剪接受體位點。在本發明的另一實施方案裡，第二核酸是天然存在的免疫球蛋白重鏈內含子，繼之以編碼免疫球蛋白重鏈CH3或CH4域的外顯子，其中在所述內含子中至少有50個連續的核苷酸被缺失。例如，對於在真核細胞中免疫球蛋白重鏈的重組表達，運用了有基因組的內含子-外顯子結構的核酸或僅含有編碼區(即cDNA)的核酸。在兩種情況下，編碼免疫球蛋白重鏈C末端結構域的外顯子後面的核酸末端都有終止密碼子。此後，在基因組結構中包含可選擇性剪接核酸和跨膜結構域的隨後的內含子和外顯子都被省略。因此，這樣的核酸只能得到可溶性免疫球蛋白重鏈。如果為了重組表達免疫球蛋白或其片段，至少部分保留免疫球蛋白重鏈基因的基因組結構，即如果保留編碼C末端結構域的外顯子之後的內含子(即可選擇的可剪接核酸)和隨後的編碼跨膜結構域的外顯子，可能進行選擇性剪接。在選擇性剪接事件中，3'端密碼子和編碼CH3或CH4結構域外顯子的終止密碼子，將分別作為或隨同內含子序列被移除，而替代產生不同的成熟mRNA,其中編碼區(即閱讀框)由附加保留的外顯子在其3，端延伸。這種mRNA被翻譯成C末端延長的免疫球蛋白重鏈，其中包含由額外的3'外顯子編碼的額外跨膜結構域或其片段。這種延長的免疫球蛋白重鏈在免疫球蛋白組裝時摻入其中，產生了質膜-結合型免疫球蛋白。令人驚訝的發現是，用根據本發明的這種核酸，可以選擇轉染後產生異源多肽的細胞。這種方法是普遍適用的，而且並不限於免疫球蛋白。為了實踐這種方法，將重組表達異源蛋白質的核酸可操縱的連接到可選擇性剪接核酸，並且這種連接符合讀碼框，所述核酸沒有符合讀碼框的終止密碼子，化位點的免疫球蛋白。隨後的第三核酸也是可變的，並且可以從編碼跨膜結構域或其片段的任何核酸以及編碼GPI-錨定物信號肽的任何核酸中選擇。這些元件(即編碼多肽的核酸、可選擇性剪接核酸、核酸編碼跨膜結構域或GPI-錨定物信號肽的核酸)可以從不同的基因以及不同的生物體來選擇和組合。唯一的前提是，這三個核酸以這樣的方式相結合，使可選擇性可以被核糖體識別並且終止翻譯。一般而言，通過選擇性剪接，可選的，異源多肽可溶性形式C末端的小部分將或可能會^皮作為內含子的部分由前體mRNA上移除。這個部分可選的包含了3，端密碼子、3，非編碼區、終止密碼子和分泌形式的多聚腺苷酸化信號。因此，起始於5，剪接供體位點和終止於3'剪接受體位點(其任選的被移除)的核酸與非選擇性加工變體的C末端重疊或可能重疊。因此，使用免疫球蛋白重鏈基因的基因組結構至少部分保留的根據本發明的核酸，可以得到異源多肽的兩個變體，短的可溶性變體和長的質膜-結合型變體。在一個實施方案裡，其中第一核酸編碼免疫球蛋白重鏈，包含第一核酸的所有外顯子、以及除一個之外全部的基因組結構的免疫球蛋白重鏈基因的內含子。在一個實施方案中，第三核酸編碼跨膜結構域的片段或GPI-錨定物信號肽，藉此跨膜結構域的片段是由單一的外顯子編碼。在另一個實施方案裡，該跨膜結構域是免疫球蛋白的跨膜結構域，由Ml-M2-外顯子融合編碼，即由沒有基因組的間隔內含子的單一外顯子編碼。在一個實施方案中，免疫球蛋白跨膜結構域由cDNA所編碼。通過往宿主細胞中引入免疫球蛋白重鏈基因的整體基因組結構至少部分保留的核酸，得到一方面表達可溶性異源多肽，另一方面表達質膜-結合型異源多肽的細胞。例如，為了取得兩種免疫球蛋白的變體，即實現選擇性剪接，不需要保留免疫球蛋白重鏈基因的整個基因組結構，即所有外顯子和內含子。這只需要保持選擇剪接位點以功能性形式存在。"功能性剪接位點"是包含5'剪接供體位點和3'剪接受體位點的核酸序列，從而使居中的核酸序列由前體mRNA上切除。內含子的識別和切除往往是由附加的順式作用元件在前體mRNA進行調控的。由於功能和位置，這些元件分別被稱為外顯子剪接增強子(ESE)、外顯子剪接沉默子(ESS)、內含子剪接增強子(ISE)或內含子剪接沉默子(Black，D.L.，AnnuRevBiochem72(2003)291-336，併入以供參考)。為了選擇轉染後表達異源多肽的細胞可以使用不同的方法，例如但不限於，通過檢測生物學活性的光譜方法如，螢光、ELISA法和其衍生的方法，或通過使用獨立於這些活性的測定如，免疫印跡、SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳、或放射免疫法(使用識別並結合到異源多肽的抗體)。由於質膜-結合型異源多肽除其C末端外，具有與可溶性異源多肽相同的氨基#列和二級結構，因此它可以用例如，與可溶性變體相同的抗體來測定。多肽的質膜-結合型變體牢固的連接到表達它的細胞上。因此，質膜-結合型變體可被作為標記來分離已成功轉染表達異源多肽或蛋白質(如免疫球蛋白)的核酸的細胞。在一個實施方案中，多肽是免疫球蛋白。在一個實施方案中，免疫球蛋白選自IgG、IgE和IgA組成的組。異源多肽的可溶性變體和異源多肽的質膜-結合型變體的分子比例是從高於50:50至低於100:0，優選從高於75:25至低於100:0。例如，如果真核細胞由根據本發明編碼免疫球蛋白的核酸轉染，成功轉染的細胞可以通過外表出現質膜-結合型免疫球蛋白來選擇。根據該發明的核酸是從5，到3，的方向包含異源多肽編碼區、選擇性剪接核酸和跨膜結構域或其片段的編碼區或GPI-錨定物信號肽編碼區的核酸。更具體而言，本發明包含的核酸包含a)編碼異源多肽的第一核酸，其沒有符合讀碼框的翻譯終止密碼子，b)起始於5，剪接供體位點並且終止於3，剪接受體位點的第二核酸，其包含符合讀碼框的翻譯終止密碼子和多聚腺苷酸化信號，和c)第三核酸，其編碼i)至少跨膜結構域的片段，或ii)GPI-錨定物信號肽。在另外的實施方案中，i)選擇性剪接內含子的5'剪接位點的是位於編碼異源多肽的核酸正常終止密碼子的5，端，ii)第二核酸是選擇性剪接核酸，和iii)5'剪接位點並不是組成型的而只是在有時候使用，產生的正常加工後的異源多肽的分子比例，即可溶性多肽相對於選擇性加工的異源多肽(即質膜-結合型多肽)的比例，從高於50:50至低於100:0。在一個實施方案裡，第一核酸和第二核酸是可操縱的連接的，即第二核酸的翻譯終止密碼子與編碼多肽或其片段的第一核酸的閱讀框是在相同讀碼框的。可以通過選擇性剪接移除掉的核酸，是在編碼多肽至少一個片段的核酸之後，在編碼跨膜結構域至少一個片段或編碼GPI-錨定物信號肽的核酸之前。在一個實施方案中，異源多肽是融合多肽，其包含感興趣多肽的N末端和免疫球蛋白重鏈的CH3或CH4域或其變種的至少一個片段的C-末端。在一個實施方案裡，核酸包含位於第一核酸和第二核酸和/或第二核酸和第三核酸之間的笫四核酸。就是說，第四核酸是位於例如笫二核酸之後(即3，剪接受體位點後)和第三核酸5，端之前。具有位於編碼異源多肽的核酸和編碼跨膜結構域或編碼GPI-錨定物信號肽的核酸之間的選擇性剪接核酸，能夠表達異源多肽的兩種變體沒有跨膜結構域或GPI-錨定物的異源多肽和有跨膜結構域或GPI-錨定物的異源多肽。此異源多肽可以選自而不限於，例如激素、細胞因子、生長因子、受體配體、受體的配體、其激動劑或拮抗劑、細胞毒性試劑、抗病毒試劑、顯象劑、酶抑制劑、酶的激活劑或酶活性調節劑，如變構物、免疫球蛋白、或其融合物或片段。在一個實施方案中，多肽是免疫球蛋白、免疫球蛋白重鏈多肽、或免疫球蛋白融合物。本發明可實踐於任何多肽、任何跨膜結構域和任何GPI-錨定物信號肽，只要藉此嵌入了可選擇性剪接的核酸。更具體而言，起始於5'剪接供體位點和終止於3'剪接受體位點的核酸片段需要被適當選擇。前面的多肽和隨後的跨膜結構域或GPI-錨定物則可以自由選擇。本發明還包含核酸，該核酸包含a)第一多克隆位點，b)起始於5，剪接供體位點並且終止於3，剪接受體位點的可剪接核酸，其中i)所述可剪接核酸包含翻譯終止密碼子和多聚腺苷酸化信號，和ii)所述可剪接核酸在前體mRNA加工過程中不會被組成性的移除，c)第二多克隆位點。能夠實踐本發明，例如，但不限於，使用的第二核酸(即選擇性剪接核酸)，來自編碼以下基因的核酸C3b/C4b受體(l型補體受體)(Hourcade，D.等人，J.Exp.Med.168(1988)1255-1270)、人、雞、大鼠表皮生長因子受體(EGFR)(Callaghan，T.等人，Oncogene8(1993)2939-2948;Reiter，J,L.和Maihle，N.J.，Nuc.AcidsRes.24(1996)4050-4056;Petch，L.等人，Mol.CellBiol.10(1990)2973-2982)、免疫球蛋白(Ig)ous、y、ji重鏈(Zhang，K.等人，J.Exp.Med.176(1992)233-243;Rogers,J.E.等人，Cell20(1980)303-312;Milcarek,C.和Hall,B.，Mol.CellBiol.5(1985)2514-2520;Kobrin，B.J.等人，Mol.CellBiol.6(1986)1687-1697;Cushley,W.等人，Nature298(1982)77;Alt,F.W.等人，Cell20(1980)293-301;Peterson,M丄"GeneExp.2(1992)319-327)、人PLA2受體(Ancian，P.等人，J.Biol.Chem.270(1995)8963-8970)、雞Cek5(Con證，R.J.和Pasquale，E.B"Oncogene11(1995)2429-2438)、人FGFR(Johnson,D.E.等人，Mol.CellBiol.11(1991)4627-4634)。在一個實施方案中，第二核酸是免疫球蛋白的內含子，其位於編碼CH3/CH4結構域的外顯子和編碼至少跨膜結構域片段的外顯子之間。在一個實施方案中，第二核酸是來自編碼以下基因的核酸人(hu)免疫球蛋白(Ig)a(alpha)重鏈、人免疫球蛋白3(delta)重鏈、人免疫球蛋白s(epsilon)重鏈、人免疫球蛋白yl、y2、和y4(gamma)重鏈、人免疫球蛋白n(miu)重鏈、小鼠免疫球蛋白重鏈a型、小鼠免疫球蛋白重鏈S型、小鼠免疫球蛋白重鏈s型、小鼠免疫球蛋白重鏈Yl型、小鼠免疫球蛋白重鏈y2A型、小鼠免疫球蛋白重鏈y2B型、小鼠免疫球蛋白重鏈y3型、和小鼠免疫球蛋白重鏈H型。在一個實施方案中，第二核酸選自編碼以下基因的核酸組成的組人免疫球蛋白yl重鏈、人免疫球蛋白y2重鏈、人免疫球蛋白y3重鏈、人免疫球蛋白y4重鏈、人免疫球蛋白s重鏈(l)和人免疫球蛋白s重鏈(2)。在一個實施方案中，第二核酸來自/選自編碼以下基因的核酸人免疫球蛋白5重鏈、人免疫球蛋白yl重鏈、人免疫球蛋白y2重鏈、人免疫球蛋白n重鏈、小鼠重鏈a型、小鼠重鏈yl型、小鼠重鏈丫2B型、小鼠重鏈Y3型以及小鼠重鏈H型。可以實踐本發明，例如但不限於，在編碼至少跨膜結構域片段的情形下，使用的第三核酸來自編碼以下基因的核酸C3b/C4b受體(l型補體受體)(Hourcade，D.等人，J.Exp.Med.168(1988)1255-1270)、人、雞、大鼠EGFR(Callaghan，T.等人，Oncogene8(1993)2939-2948;Reiter，J.L.和Maihle，N.J.，Nuc.AcidsRes.24(1996)4050-4056;Petch，L.等人，Mol.CellBiol.10(1990)2973-2982)、免疫球蛋白(Ig)a、￡、y、ji重鏈(Zhang，K.等人，J.Exp.Med.176(1992)233-243;Rogers,J.E.等人，Cell20(1980)303-312;Milcarek,C.和Hall，B.，Mol.CellBiol.5(1985)2514-2520;KobrinB.J.等人，Mol.CellBiol.6(1986)1687-1697;Cushley，W.等人，Nature298(1982)77;Alt,F.W.等人，Cell20(1980)293-301;Peterson,M丄"GeneExp.2(1992)319-327)、人PLA2受體(Ancian，P.等人，J.Biol,Chem.270(1995)8963-8970)、雞Cek5(Connor,R.J.和Pasquale，E.B"Oncogene11(1995)2429-2438)、人FGFR(Johnson,D.E.等人，Mol.CellBiol.11(1991)4627-4634)。在一個實施方案中，第三核酸選自編碼以下基因的核酸人(hu)免疫球蛋白(Ig)a(alpha)重鏈、人免疫球蛋白8(delta)重鏈、人免疫球蛋白s(epsilon)重鏈、人免疫J求蛋白yl、y2、和y4(gamma)重鏈、人免疫球蛋白n(miu)重鏈、小鼠免疫球蛋白重鏈a型、小鼠免疫球蛋白重鏈3型、小鼠免疫球蛋白重鏈s型、小鼠免疫球蛋白重鏈Yl型、小鼠免疫球蛋白重鏈Y2A型、小鼠免疫球蛋白重鏈y2B型、小鼠免疫球蛋白重鏈^型、和小鼠免疫球蛋白重鏈H型。在一個實施方案中，第三核酸選自編碼以下基因的核酸人免疫球蛋白yl重鏈、人免疫球蛋白y2重鏈、人免疫球蛋白y3重鏈、人免疫球蛋白y4重鏈、人免疫球蛋白s重鏈(l)和人免疫球蛋白s重鏈(2)。在一個實施方案中，第三核酸選自編碼以下基因的核酸人免疫球蛋白5重鏈、人免疫球蛋白yl重鏈、人免疫球蛋白丫2重鏈、人免疫球蛋白p重鏈、小鼠重鏈a型、小鼠重鏈Yl型、小鼠重鏈y2B型、小鼠重鏈y3型以及小鼠重鏈p型。第三核酸除了可以選自編碼至少跨膜結構域片段的核酸組，還可以選自編碼GPI-錨定物信號肽的核酸組。編碼GPI-錨定物信號肽的核酸組包含來自以下基因的編碼GPI-錨定物信號肽的核酸組人鹼性二酯酶、乙醯膽鹼酯酶、鹼性磷酸酶(腸道、肝及胎盤的)、CAMPATH-1抗原、癌胚抗原、CD55、CD59、CD90、接觸蛋白-1、E48抗原、葉酸受體A和B、GPI-錨定的蛋白p137、淋巴細胞功能相關抗原-3、mDIA相互作用蛋白、5'-核苦酸酶、尿激酶纖維蛋白溶酶原激活因子；鼠的LY-6C抗原、LY-6抗原、5'-核苷酸酶、OX45抗原、幹細胞抗原-2、血管細胞粘附分子-1、Qa淋巴細胞抗原2(Qa2);兔的海藻糖酶；大鼠來源的短蛋白聚糖蛋白、CD卯、磷脂醯肌醇蛋白聚糖蛋白、硫酸肝素蛋白多糖、MRCOX-45抗原、5，-核普酸酶、胰腺分泌顆粒膜主要糖蛋白(pancreaticsecretorygranulemembranemajorglycoprotein)、T細胞表面蛋白RT6.2;酵母的DNA修復蛋白PHR1、糖磷脂錨定表面蛋白1;豬的澱粉樣前體蛋白、二肽酶；布氏錐蟲(ro;/w"仍o附"6mce/)不同的變體的表面蛋白質、多環酸性重複蛋白(polycyclicacidicrepetitiveprotein);岡'J果錐蟲(7Vj^fl"os0/wflcowgo/ewse)變體來源的表面蛋白YNat1.1;雞來源的黑素轉鐵蛋白(melanotransferrin)、中性細胞粘附分子；來自石紋電鰩(7br/^^w"r附omto)的乙醯膽鹼酯酶；倉鼠來源的朊蛋白；牛來源的5，-核苷酸酶；粘液菌來源的膜蛋白GP64、前孢子特異性抗原；和魷魚來源的Sgpl、Sgp2。在表l中給出了根據本發明第二核酸的核酸序列的實例。在表2中給出的實例是，根據本發明第三核酸的核酸序列和根據本發明第三核酸核酸序列相應的胺基酸序列的實例。在表3中列出的實例是，可選的第四核酸的核酸序列和根據本發明的第四可選核酸對應的胺基酸序列。表1列出了5'剪接供體位點、第二(可選擇性剪接)核酸和3'剪接受體位點。由於第二核酸的序列通常超過lkb，列在表l的序列被縮短，顯示第二核酸的約前100個和後100個核苷酸，其間由表示完整第二核酸總體大小的數字來分開。第二核酸的完全序列包含於序列列表給出的SEQIDNO。終止密碼子有下劃線。以包含前面的剪接供體位點的共有序列和由垂直線分開的第二核酸的最前6個核苷酸的格式給出剪接供體位點(又見例如，Zhang,M.Q.，HumanMol.Gen.7(1998)919-932)。同樣地，通過列出第二核酸的最後6個核苷酸和隨後的由垂直線分開的剪接受體位點共有序列給出剪接受體位點。緊隨垂直線之後(5，剪接供體位點)和正好在垂直線之前(3，剪接受體位點)的核苷酸是第二(可剪接)核酸的第一個和最後一個核苷酸。第二核酸的終止密碼子在表l中有下劃線。第二核酸可以是直接連接到編碼異源多肽的核酸，即第一核酸，或是有可選的小(9到21個鹼基)間隔核酸序列。在一實施方案中，可選的間隔(第五)核酸是來自第二核酸在基因組上靠前的核酸，由此得到所述第二核酸。在表2中列出了編碼跨膜結構域片段的核酸序列和GPI-錨定物信號肽的胺基酸序列的實例。這個序列可以直接在3'剪接受體位點之後或在其間有可選的間隔序列，即第四核酸。在表3中列出了第四核酸序列和第四核酸相應的氨基*列的實例。在一個實施方案中，根據本發明的核酸包含在所述第二核酸和所述第三核酸之間的第四核酸。在一個實施方案中，根據本發明的核酸包含在所述第一核酸和所述第二核酸之間的第五核酸。在本發明的一個實施方案中，所述第三核酸得自與第二核酸i)相同的，或ii)不同的基因或生物體，即所述第三核酸不必要與所述第二核酸編組在同一基因組之中。序列是來自公開可獲得的基因組或資料庫(如人類基因組計劃，http:〃www.gdb.org/;小鼠基因糹且資料庫，http:〃www.informatics.jax.org/;SwissProt(http:〃www.expasy.org/sprot/)。其中沒有可獲得的註解，序列已由軟體ALOM預測或完成(見例如，Klein，P.等人，Biochim.Biophys.Acta787(1984)221-226)。在完整的跨膜結構域的情況下，除了SwissProt給出的序列，括號內的序列是通過ALOM預測的。在一個實施方案裡，第二核酸是選自包含SEQIDNO:001、002、003、004、005、006、007、008、009、151、152、153、154、155、156、157、158、159、169、170、171、172、173的核酸組。在一個實施方案中，根據本發明的核酸的笫二核酸是選自從SEQIDNO:001到SEQIDNO:009的核酸序列組。在一個實施方案中，第二核酸選自包含SEQIDNO:002、003、156、157、170、171的核酸組。在一個實施方案中，根據本發明的核酸的第三核酸或者該核酸的片段選自SEQIDNO:OIO到SEQIDNO:018的核酸序列組，和其編碼胺基酸序列是SEQIDNO:019到SEQIDNO:069的核酸序列的核酸序列組。在一個實施方案中，根據本發明的核酸的第三核酸或者其核酸片段選自SEQIDNO:010、011、012、013、014、015、016、017、018、160、161、163、164、165、166、167、168、174、175、176的核酸序列組，和其編碼胺基酸序列是SEQIDNO:019到SEQIDNO:069和162的核酸序列的核酸序列組。在一個實施方案中，根據本發明的核酸的第三核酸選自，或者其核酸片段選自SEQIDNO:011、012、165、166、175的核酸序列組，和其編碼胺基酸序列是SEQIDNO:019到SEQIDNO:036的核酸序列的核酸序列組。在另一實施方案中，根據本發明的核酸的第三核酸選自，或者其核酸片段選自SEQIDNO:011、012、165、166、175的核酸序列組。在一個實施方案中，根據本發明的核酸的第四核酸選自SEQIDNO:070到SEQIDNO:078的核^列組和其編碼胺基酸序列是SEQIDNO:079到129的核酸序列的核酸序列組，或所述第四核酸包含選自所述核酸序列組的核酸。蛋白質剪接供體位點第二核酸(^T剪接核酸)'剪接受體位點人免疫球蛋白S重鏈tableseeoriginaldocumentpage0formulaseeoriginaldocumentpage36tableseeoriginaldocumentpage37tableseeoriginaldocumentpage38表2:第三核酸和對應第三核酸的胺基酸的實例tableseeoriginaldocumentpage39tableseeoriginaldocumentpage40tableseeoriginaldocumentpage41表3:第四核酸和對應第四核酸的胺基酸的實例tableseeoriginaldocumentpage42tableseeoriginaldocumentpage43在一個實施方案中，多肽是免疫球蛋白重鏈而跨膜結構域是免疫球蛋白重鏈的跨膜結構域。為了表達免疫球蛋白，本發明的核酸與編碼免疫球蛋白輕鏈的核酸一起被引入真核宿主細胞。這些核酸可以位於同一核酸或不同的核酸。本發明涵蓋包含本發明的核酸的載體以及包含本發明載體的真核細胞。#>據本發明的核酸所編碼的異源多肽的可溶性變體，可以由以下步驟來生產，包含用本發明的核酸轉染真核細胞、在適合表達所述核酸所編碼多肽的條件下培養細胞、以及從細胞的細胞質或培養液中回收多肽。提供試劑盒用於根據本發明的真核細胞的製備。該試劑盒包含含有至少兩個多克隆位點和起始於5'剪接供體位點並終止於3'剪接受體位點的可剪接核酸的載體，其中i)所述核酸包含翻譯終止密碼子和多聚腺苷酸化信號，和ii)所述核酸在前體mRNA加工過程中不會被組成性移除。在一個實施方案中，本發明的真核細胞是哺乳動物細胞。在一個實施方案中，哺乳動物細胞是選自下面組成的組的細胞，包含CHO細胞、NS0細胞、Sp2/0細胞、COS細胞、K652細胞、BHK細胞、PER.C6細胞和HEK細胞。接下來提供實例、序列表和圖以幫助對本發明的理解，其真正的範圍在所附權利要求書中闡明。應當理解的是，可以對提出的過程進行某些修改而不背離本發明的精神。圖1:slgG/mlgG表達載體(A)、slgG/mlgG表達載體pmlgGA-A(B)、和slgG表達載體plgG-A(C)的質粒圖懵。所描繪載體元件在正文中有詳細說明。圖2:y鍊表達盒的外顯子內含子結構的示意圖。A:在表達載體pmlgG-A中yl鏈恆定區的結構。約7.2kb的DNA片段顯示為一條黑線。用空方框和上文指明的名稱代表外顯子。用於IgG分泌形式p(A)sI和膜結合形式[p(A)mI的的多聚腺苷酸化位點的位置用黑色條形顯示。內含子的編號方式和3'UTR在下圖顯示。顯示了內含子6中的I限制性位點和3，UTR內突變的^/iI位點(在括號內)的相對位置。B:如A所描述的表達載體pmlgGA-A中約4.8kb雜合y1~t3~^4鏈恆定區的結構。此外，圖表還顯示來自三個免疫球蛋白重鏈恆定y基因位點(IGHG1、IGHG3和IGHG4)的區域。圖3:在表達mlgG的克隆中，IgG的分泌和細胞表面信號的相關性。轉染了質粒pmlgG-A(左)、pmlgGA-A(中)或作為對照的plgG-A(右)的六個獨立的Sp2/0-Ag14細胞克隆，在限定條件下培養48小時。流式細胞儀螢光強度的中值作為結合到質膜的IgG的數量的測量，通過灰色的條形表示。在相應的細胞培養上清中的分泌型IgG的濃度用黑色菱形代表。圖4:典型的FL1/FSC散點圖用於在FACS優勢流式細胞儀上分選細胞(BD)。通道R1包含描述的在之前已通過FL1/FSC散點圖門控的活細胞群體的5.70/。。在分選過程中收集落入R1的細胞。圖5:比生產率的確定。克隆5B11、9B3和J5-H3在轉瓶裡92個小時培養。A:細胞生長。在開始轉瓶培養後的指定時間點，用CASY細胞計數器測定每個克隆的細胞計數。B:IgG的生產。在指定時間點(如A中的)，通過蛋白A親和層析法在細胞培養上清中測定IgG的濃度。C:比生產率。條形圖表顯示了每個克隆平均的比生產率，這是從前六十九小時內的細胞計數和IgG測定計算出來的(參見表2和參見正文以了解更多詳情)。標準偏差用誤差棒指示。圖6:免疫螢光顯微鏡。表達分泌型slgG和膜結合型mlgG的克隆5B11(圖像l、4)、僅表達分泌型slgG的克隆J5-H3(圖像2、5)或未轉染的Sp2/0-Ag14細胞(圖像3、6)用細胞表面的IgG(圖像l-3)或胞內IgG(圖像4-6)標記，並且圖像記錄在Axiophot螢光顯微鏡。圖7:RNA印跡分析mRNA。A:用[a-"PI標記的探針A(泳道l-3)或探針B(泳道4-6)雜交的RNA印跡的放射自顯影。在每個泳道裡有分離自克隆5B11(泳道1、4)、克隆J5-H3(泳道2、5)或未轉染的Sp2/0-Ag14細胞(泳道3、6)的10pg總RNA，所述總RNA通過變性瓊脂糖凝膠電泳分離開並且轉移至尼龍膜。B:編碼膜結合型mlgG或分泌型slgG的重鏈的兩個mRNA亞型的示意圖。外顯子用方框表示。與探針A和B互補的區域用黑色條塊標記。圖8:IgG的重鏈亞型的免疫印跡分析。克隆5B11(泳道1、4)、克隆J5-H3(泳道2、5)或未轉染的Sp2/0-Ag14細胞(泳道3、6)是根據鹼性碳酸鹽提取法分別提取的(見正文)。免疫球蛋白來自包含膜整合蛋白的膜組分(泳道l-3)、或來自主要包含細胞可溶性內容物的SN級份(泳道4-6)，所述免疫球蛋白通過蛋白A的下拉測定(pulldownassay)被純化，並且通過變性SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳被分離。在印跡(blotting)和用辣根過氧化物酶二抗標記之後，重鏈可以由化學發光反應顯現出來。從而顯示出分泌型slgG重鏈(sIgGHC)和膜結合型mlgG重鏈(mlgGHC)。較低的欄顯示了上欄的印跡部分短膝光的情形。圖9:RNA印跡法印跡法分析mRNA。如圖7B所示的，[a-32P標記的探針A(左欄)或探針B(右欄)雜交的RNA印跡法印跡的放射自顯影。在每個泳道裡有分離自克隆1A1、1B6、1C5或1D1(泳道l-4)和克隆1D6、2D6、K02或K06(泳道6-9)的10ng總RNA，所述總RNA通過變性瓊脂糖凝膠電泳分離開來並且轉移至尼龍膜。克隆"27，，只表達slgG從而加入作為對照(泳道5、10)。可顯示mlgG和sIgG亞型的重鏈mRNA。圖10:slgG/IgG-GPI表達載體plgG-GPI-B的質粒圖i普。表格說明表l第二核酸的實例。表2第三核酸和對應於第三核酸的胺基酸的實例。表3第四核酸和對應於第四核酸的胺基酸的實例。表4在slgG/mlgG表達載體'pmlgG-A，的構建體中，用於克隆和誘變的寡核苷酸引物表5基於在指數增長階段的幾個時間點計算的四個不同的SPRs所確定的每個選定克隆的平均SPR。表6表4顯示，單細胞培養於96孔板3周後，不同IgG濃度水平的克隆的分布，和通過ELISA對515mlgG-分選克隆和550對照克隆的細胞培養上清的分析。表7表5顯示，在第二輪篩選中，不同IgG濃度水平的克隆的分布。表8用CASYTT細胞計數器(SchSrfeSystems)確定每個克隆在搖瓶振蕩培養O、1、2、3、4和7天的細胞數。表9通過ELISA進行的搖瓶振蕩培養10天的生產力測定。序列說明SEQIDNO:001第二核酸來自人免疫球蛋白5重鏈SEQIDNO:002第二核酸來自人免疫球蛋白重鏈SEQIDNO:003第二核酸來自人免疫球蛋白重鏈SEQIDNO:004第二核酸來自人免疫球蛋白n重鏈SEQIDNO:005第二核酸來自小鼠免疫球蛋白重鏈a型SEQIDNO:006第二核酸來自小鼠免疫球蛋白重鏈型SEQIDNO:007第二核酸來自小鼠免疫球蛋白重鏈丫2B型SEQIDNO:008第二核酸來自小鼠免疫球蛋白重鏈Y3型SEQIDNO:009第二核酸來自小鼠免疫球蛋白重鏈p型SEQIDNO:010第三核酸來自人免疫球蛋白S重鏈SEQIDNO:Oil第三核酸來自人免疫球蛋白<yl重鏈SEQIDNO:012第三核酸來自人免疫球蛋白Y2重鏈SEQIDNO:013第三核酸來自人免疫球蛋白n重鏈SEQIDNO:014第三核酸來自小鼠免疫球蛋白重鏈oc型SEQIDNO:015第三核酸來自小鼠免疫球蛋白重鏈型SEQIDNO:016第三核酸來自小鼠免疫球蛋白重鏈Y2B型SEQIDNO:017第三核酸來自小鼠免疫球蛋白重鏈Y3型SEQIDNO:018第三核酸來自小鼠免疫球蛋白重鏈型SEQIDNO:019第三核酸來自人類的乙醯膽鹼酯酶(AChE)SEQIDNO:020第三核酸來自人體腸道鹼性磷酸酶SEQIDNO:021第三核酸來自人類肝臟鹼性磷酸酶SEQIDNO:022第三核酸來源於人胎盤鹼性磷酸酶SEQIDNO:023笫三核酸來自人CAMPATH-1抗原SEQIDNO:024第三核酸來自人癌胚抗原SEQIDNO:025第三核酸來自人CD55SEQIDNO:026第三核酸來自人CD59SEQIDNO:027第三核酸來自人CD卯SEQIDNO:028第三核酸來自人接觸蛋白-1SEQIDNO:029第三核酸來自人E48抗原SEQIDNO:030第三核酸來自人葉酸受體ASEQIDNO:031第三核酸來自人葉酸受體BSEQIDNO:032第三核酸來自人GPI錨定蛋白pl37SEQIDNO:033第三核酸來自人淋巴細胞功能相關抗原-3SEQIDNO:034第三核酸來自人MDIA作用蛋白SEQIDNO:035第三核酸來自人5'-核苷酸酶SEQIDNO:036第三核酸來自人尿激酶纖維蛋白溶酶原激活因子SEQIDNO:037第三核酸來自小鼠細胞表面蛋白LY-6C抗原SEQIDNO:038第三核酸來自小鼠LY-6抗原ThBSEQIDNO:039第三核酸來自小鼠5'-核苷酸酶SEQIDNO:040第三核酸來自小鼠OX45抗原SEQIDNO:041第三核酸來自小鼠幹細胞抗原2SEQIDNO:042第三核酸來自小鼠血管細胞粘附分子1SEQIDNO:043第三核酸來自大鼠短蛋白聚糖SEQIDNO:044第三核酸來自大鼠CD90抗原SEQIDNO:045第三核酸來自大鼠磷脂醯肌醇蛋白聚糖SEQIDNO:046第三核酸來自大鼠MRCOX45抗原SEQIDNO:047第三核酸來自大鼠5'-核苷酸酶SEQIDNO:048第三核酸來自大鼠胰腺分泌顆粒膜的主要糖蛋白GP2SEQIDNO:049第三核酸來自大鼠T細胞表面蛋白RT6.2SEQIDNO:050第三核酸來自酵母DNA損傷修復蛋白PHR1SEQIDNO:051第三核酸來自酵母糖磷脂錨定表面蛋白-lSEQIDNO:052第三核酸來自豬澱粉樣前體蛋白SEQIDNO:053第三核酸來自豬二肽酶SEQIDNO:054第三核酸來自布氏錐蟲變體表面蛋白ILTat1.1SEQIDNO:055第三核酸來自布氏錐蟲變體表面蛋白MIT117aSEQIDNO:056第三核酸來自布氏錐蟲變體表面蛋白MIT118aSEQIDNO:057第三核酸來自布氏錐蟲變體表面蛋白MIT221SEQIDNO:058第三核酸來自布氏錐蟲變體表面蛋白MITat1.1000BCSEQIDNO:059第三核酸來自布氏錐蟲變體表面蛋白MITat1.5bSEQIDNO:060第三核酸來自布氏錐蟲布氏多環酸性重複蛋白SEQIDNO:061第三核酸來自布氏錐蟲變體表面蛋白TxTat1SEQIDNO:062第三核酸來自剛果錐蟲變體表面蛋白YNat1.1SEQIDNO:063第三核酸來自雞黑素轉鐵蛋白SEQIDNO:064第三核酸來自雞神經細胞粘附分子SEQIDNO:065第三核酸石紋電鰩乙醯膽鹼酯酶SEQIDNO:066第三核酸來自倉鼠朊蛋白SEQIDNO:067第三核酸來自牛5'-核苷酸酶SEQIDNO:068第三核酸來自粘液菌膜蛋白Gp64SEQIDNO:069第三核酸來自粘液菌前孢子特異性抗原SEQIDNO:070第四核酸來自人免疫球蛋白6重鏈SEQIDNO:071第四核酸來自人免疫球蛋白重鏈SEQIDNO:072第四核酸來自人免疫球蛋白重鏈SEQIDNO:073第四核酸來自人免疫球蛋白fi重鏈SEQIDNO:074第四核酸來自小鼠免疫球蛋白重鏈a型SEQIDNO:075第四核酸來自小鼠免疫球蛋白重鏈型SEQIDNO:076第四核酸來自小鼠免疫球蛋白重鏈y2B型SEQIDNO:077第四核酸來自小鼠免疫球蛋白重鏈y3型SEQIDNO:078第四核酸來自小鼠免疫球蛋白重鏈fi型SEQIDNO:079第四核酸來自人AChESEQIDNO:080第四核酸來自人腸道鹼性磷酸酶SEQIDNO:081第四核酸來自人肝臟鹼性磷酸酶SEQIDNO:082第四核酸來自人胎盤鹼性磷酸酶SEQIDNO:083第四核酸來自人CAMPATH-1抗原SEQIDNO:084第四核酸來自人癌胚抗原SEQIDNO:085第四核酸來自人CD55SEQIDNO:086第四核酸來自人CD59SEQIDNO:087第四核酸來自人CD卯SEQIDNO:088第四核酸來自人接觸蛋白-lSEQIDNO:089第四核酸來自人E48抗原SEQIDNO:0卯第四核酸來自人葉酸受體ASEQIDNO:091第四核酸來自人葉酸受體BSEQIDNO:092第四核酸來自人GPI錨定蛋白pl37SEQIDNO:093第四核酸來自人淋巴細胞功能相關抗原-3SEQIDNO:094第四核酸來自人MDIA作用蛋白SEQIDNO:095第四核酸來自人S，-核苷酸酶SEQIDNO:096第四核酸來自人尿激酶纖維蛋白溶酶原激活因子SEQIDNO:097第四核酸來自小鼠細胞表面蛋白LY-6C抗原SEQIDNO:098第四核酸來自小鼠Ly-6抗原ThBSEQIDNO:099第四核酸來自小鼠5'-核苷酸酶SEQIDNO:100第四核酸來自小鼠OX45抗原SEQIDNO:101第四核酸來自小鼠幹細胞抗原2SEQIDNO:102第四核酸來自小鼠血管細胞粘附分子1SEQIDNO:103第四核酸來自大鼠短蛋白聚糖SEQIDNO:104第四核酸來自大鼠CD90抗原SEQIDNO:105第四核酸來自大鼠磷脂醯肌醇蛋白聚糖SEQIDNO:106第四核酸來自大鼠MRCOX45抗原SEQIDNO:107第四核酸來自大鼠5，-核苷酸酶SEQIDNO:108第四核酸來自大鼠胰腺分泌顆粒膜的主要糖蛋白的GP2SEQIDNO:109第四核酸來自大鼠T細胞表面蛋白RT6.2SEQIDNO:110第四核酸來自酵母DNA損傷修復蛋白PHR1SEQIDNO:111第四核酸來自酵母糖磷脂錨定表面蛋白-lSEQIDNO:112第四核酸來自豬澱粉樣前體蛋白SEQIDNO:113第四核酸來自豬二肽酶SEQIDNO:114第四核酸來自布氏錐蟲變體表面蛋白ILTatl.lSEQIDNO:115第四核酸來自布氏錐蟲變體表面蛋白MIT117aSEQIDNO:116第四核酸來自布氏錐蟲變體表面蛋白MIT118aSEQIDNO:117第四核酸來自布氏錐蟲變體表面蛋白MIT221SEQIDNO:118第四核酸來自布氏錐蟲變體表面蛋白MITat1.1000BCSEQIDNO:119第四核酸來自布氏錐蟲變體表面蛋白MITat1.5bSEQIDNO:120第四核酸來自布氏錐蟲多環酸性重複蛋白SEQIDNO:121第四核酸來自布氏錐蟲變體表面蛋白TxTat1SEQIDNO:122第四核酸來自剛果錐蟲變體表面蛋白YNat1.1SEQIDNO:123第四核酸來自雞黑素轉牽失蛋白SEQIDNO:124第四核酸來自雞神經細胞粘附分子SEQIDNO:125第四核酸來自石紋電鰩乙醯膽鹼酯酶SEQIDNO:126第四核酸來自倉鼠朊蛋白SEQIDNO:127第四核酸來自牛5，-核苷酸酶SEQIDNO:128第四核酸來自粘液菌膜蛋白Gp64SEQIDNO:129第四核酸來自煤粘液菌前孢子特異性抗原SEQIDNO:130人免疫球蛋白重鏈恆定yl(IGHGl)基因，包含從CHI到CH3的外顯子，連同所有間隔的內含子和鄰近的3'非編碼區。SEQIDNO:131由質粒plgG-A編碼的恆定區，鏈的胺基酸序列。SEQIDNO:132寡核苷酸引物TM-fwlSEQIDNO:133寡核苷酸引物TM-rvlSEQIDNO:134寡核苷酸引物Ml-rvSEQIDNO:135寡核苷酸引物M2-fwSEQIDNO:136寡核苷酸引物TM-fw2SEQIDNO:137寡核苷酸引物TM-rv2SEQIDNO:138寡核苷酸引物mutSphl-lSEQIDNO:139寡核苷酸引物SphI-2seqIDNO:140人免疫球蛋白重鏈恆定y1(IGHG1)基因，包括帶有所有插入的內含子的從CH1到M2的外顯子、在內含子6中用於IgGl分泌形式的多聚腺苷酸化位點、和含有用於IgGl質膜結合形式的多聚腺苷酸化位點的3'UTR。SEQIDNO:141質粒pmlgG-A編碼的短(sIgG)亞型的胺基酸序列。SEQIDNO:142質粒pmlgG-A編碼的y-鏈恆定區的長(mlgG)亞型的氛基^列SEQIDNO:143人IGHG1基因包括帶有所有插入的內含子的從CH1到CH3的外顯子、內含子6鄰近5'端的部分，所述部分包括用於免疫球蛋白分泌性形式的多聚腺苷酸化位點。SEQIDNO:144質粒pmlgGA-A編碼的？鏈恆定區的短(sIgG)亞型的胺基酸序列。SEQIDNO:145質粒pmlgGA-A編碼的"鏈恆定區的長(mIgG)亞型的氨基i^列。SEQIDNO:146從質粒pmlgGA-B中移除的編碼序列。SEQIDNO:147質粒plgG-GPI-B生成時插入的編碼序歹'J(人胎盤鹼性磷酸酶的羧基端信號肽的胺基酸序列(NCBI登錄號M13077;核苷酸:1542—1643))。SEQIDNO:148，鍊表達盒恆定區的DNA序列，表達質粒plgG-GPIB從CHI到3'UTR。SEQIDNO:149質粒plgG-GPI-B編碼的，鏈恆定區slgG亞型的胺基酸序列。SEQIDNO:150，鏈恆定區的長亞型的胺基酸序列，所述恆定區包含由質粒plgG-GPI-B編碼的人胎盤鹼性磷酸酶的羧基端信號肽。SEQIDNO:151第二核酸來自人成纖維細胞生長因子受體1SEQIDNO:152第二核酸來自小鼠表皮生長因子受體SEQIDNO:153第二核酸來自人補體受體l(C3b/C4b)SEQIDNO:154第二核酸來自小鼠白細胞介素4受體SEQIDNO:155第二核酸來自人免疫球蛋白ot重鏈SEQIDNO:156第二核酸來自人免疫球蛋白￡重鏈(l)SEQIDNO:157第二核酸來自人免疫球蛋白Y3重鏈SEQIDNO:158第二核酸來自小鼠免疫球蛋白重鏈s型SEQIDNO:159第二核酸來自小鼠免疫球蛋白重鏈y2A型SEQIDNO:160第三核酸來自人成纖維細胞生長因子受體1SEQIDNO:161第三核酸來自小鼠表皮生長因子受體SEQIDNO:162第三核酸來自人補體受體l(C3b/C4b)SEQIDNO:163第三核酸來自小鼠白細胞介素4受體SEQIDNO:164第三核酸來自人免疫球蛋白ot重鏈SEQIDNO:165第三核酸來自人免疫球蛋白e重鏈SEQIDNO:166第三核酸來自人免疫球蛋白重鏈SEQIDNO:167第三核酸來自小鼠免疫球蛋白重鏈s型SEQIDNO:168笫三核酸來自小鼠免疫球蛋白重鏈Y2A型SEQIDNO:169第二核酸來自人白細胞介素4受體SEQIDNO:170第二核酸來自人免疫球蛋白s重鏈(2)SEQIDNO:m第二核酸來自人免疫球蛋白Y4重鏈SEQIDNO:172第二核酸來自鼠免疫球蛋白S重鏈SEQIDNO:m第.二核酸來自人免疫球蛋白￡重鏈(2)SEQIDNO:174第三核酸來自人白細胞介素4受體SEQIDNO:175第三核酸來自人免疫球蛋白y4重鏈SEQIDNO:176第三核酸來自小鼠免疫球蛋白重鏈S型實施例實施例1基因片段的克隆和真核slgG/mlgG表達載體的構建a)slgG表達載體'pIgG-A，的構建為表達對蛋白"A"有特異性的免疫球蛋白，構建'pIgG-A，載體。其編碼免疫球蛋白的分泌形式並包含下列元件(見圖1C):1.人yl重鏈的轉錄單元，包含陽來自人巨細胞病毒(HCMV)的即刻早期增強子和啟動子，畫合成的5'端非翻譯區，包含Kozak共有序歹ij(Kozak，M.，NucleicAcidsRes.15(1987)8125-48)，-包含信號序列內含子的鼠免疫球蛋白重鏈信號序列，-對蛋白"A"有特異性的抗體的可變的重鏈的cDNA，-小鼠/人重鏈雜交內含子2，包括小鼠Ign增強子(JH3-JH4切換區)與人免疫球蛋白重鏈恆定yl(IGHG1)基因相連，所述IGHG1基因包含從CH1到CH3帶有所有插入內含子的外顯子、和含有IgGl分泌形式重鏈的多聚腺普酸化位點的毗鄰的3'非編碼區。重鏈恆定區的核苷酸序列報導在SEQIDNO:130裡。由質粒plgG-A編碼的Y-鏈恆定區的胺基酸序列報導在SEQIDNO:131。2.人k輕鏈的轉錄單元，包含-來自人巨細胞病毒(HCMV)的即刻早期增強子和啟動子，-合成的5'端非翻譯區，包含Kozak共有序列，-鼠免疫球蛋白輕鏈信號序列包含信號序列內含子，誦對蛋白"A"有特異性的抗體的可變k鏈的cDNA，-與人免疫球蛋白k恆定(IGKC))基因相連的小鼠內含子2Igk增強子，和-人IGKC基因3'非編碼區，包含多聚腺苷酸化位點。3.作為哺乳動物細胞選擇標記的新黴素磷酸轉移酶的轉錄單元。4.來自載體pUC18的複製起點，用於在大腸桿菌中質粒的複製。5.在大腸桿菌賦予氨節青黴素抗性的p-內醯胺酶基因。b)slgG/mlgG表達載體'pmlgG-A，的構建人免疫球蛋白重鏈恆定yl(IGHG1)位點的5.2kb基因組片段包含外顯子CH3下遊內含子(內含子6)的主要部分、外顯子Ml、外顯子Ml下遊的內含子(內含子7)、外顯子M2、以及鄰近的包含膜結合形式的Yl鏈的多聚腺苷酸化信號的3'非編碼區(3'UTR)，所述片段可以使用PCR從人基因組DNA(羅氏診斷有限公司，Mannheim,德國)擴增，所述PCR使用擴展長模板PCR系統(ExpandLongTemplatePCRSystem)(羅氏診斷有限公司，德國)和表4中指定的寡核苷酸引物。表4:用於克隆和誘變的寡核苷酸引物。tableseeoriginaldocumentpage56*I位點的誘變所改變的核苷酸用小寫字體標出。該擴增片段對應"人14號染色體的基因組重疊群(contig)"(NCBI登錄號NT_026437，反向互補)的87203513-87208691核普酸。亞克隆PCR產物的測序與相應的14號染色體序列比較，顯示了98%的同一性，所有的不同之處都在內含子或3'非編碼區(3，UTR)。通過基於位點定向誘變的PCR、使用表2中指定的寡核苷酸引物，毀壞外顯子M2終止密碼子下遊219bp的I限制性位點。此片段接著通過經由I限制性位點克隆入免疫球蛋白yl鍊表達載體plgG-A，與內含子6的5'側面部分相連接，從而得到完整基因組結構的Yl鏈轉錄單元。通過亞克隆構建真核表達載體'pmlgG-A，，所述載體編碼對蛋白"A"有特異性的抗體的分泌形式(sIgG)和膜結合形式(mlgG)。該質粒包含以下組分(又見圖1A):1.前述提到的人y1重鏈的轉錄單元，組成為畫來自人巨細胞病毒(HCMV)的即刻早期增強子和啟動子，-合成的5'端非翻譯區，包含Kozak共有序列，-包含信號序列內含子的鼠免疫球蛋白重鏈信號序列，-對蛋白"A"有特異性的抗體的可變重鏈的cDNA，-小鼠/人重鏈雜交內含子2,其包含來自JH3-JH4切換區的小鼠Ign增強子(Banerji，J.等人，Cell33(1983)729-740;Gillies，S.D.等人，Cell,33(1983)717-728)，與人免疫球蛋白重鏈恆定yl(IGHG1)基因相連，所述IGHG1基因包含從CH1到M2的帶有所有插入的內含子的外顯子、在內含子6中用於IgGl分泌形式的多聚腺苷酸化位點、和包含用於IgGl膜結合形式的多聚腺苷酸化位點的3'UTR。重鏈恆定區的基因組結構在圖2A中有描繪，核苷酸序列報導在SEQIDNO:140中。由質粒pmlgG-A編碼的，鏈恆定區的短(sIgG)亞型或長(mlgG)亞型的胺基酸序列分別報導在SEQIDNO:141或SEQIDNO:142。2.人k輕鏈的轉錄單元，包含-來自人巨細胞病毒(HCMV)的即刻早期增強子和啟動子，國合成的5'端非翻譯區，包含Kozak共有序列，-包含信號序列內含子的鼠免疫球蛋白輕鏈信號序列，-對蛋白"A"有特異性的抗體的可變的k鏈的cDNA，-與人免疫球蛋白包含信號序列內含子恆定(IGKC))基因相連的小鼠內含子2Igk增強子(Emorine,L.等人，Nature304(1983)447-449;Picard，D.和Schaffner，W"Nature(1984)307，80-82)，和-人IGKC基因3'非編碼區，包含多聚腺苷酸化位點。3.新黴素磷酸轉移酶的轉錄單元作為哺乳動物細胞可選擇標記。4.來自載體pUC18的複製起點，用於在大腸桿菌中質粒的複製。5.在大腸桿菌賦予氨千青黴素抗性的p-內醯胺酶基因。c)slgG/mlgG表達載體'pmlgGA-A，和'pmlgGA-B，的構建人免疫球蛋白重鏈恆定y3(IGHG3)位點的l.lkb基因組片段包含外顯子CH3下遊內含子(內含子6)的主要部分和外顯子Ml,用類似實施例lb)描述的方式，通過PCR擴增所述片段(寡核苷酸見表2)。該擴增片段對應"人14號染色體的基因組重疊群"(NCBI登錄號NT—026437，反向互補)的87235195-87236300核苷酸，序列同一性達到98%。除了外顯子M1裡的一個沉默的單核苷酸變換，所有的不同之處都在內含子中，因此並不改變編碼胺基酸序列。同樣，人免疫球蛋白重鏈恆定"(IGHG4)位點的1.6kb基因組片段可以由PCR擴增出來(寡核普酸見表2),其包含外顯子M2和含有膜結合形式Y4鏈的多聚腺苷酸化信號的毗鄰的3，非翻譯區。該片段對應著"人14號染色體的基因組重疊群"(NCBI登錄號NT—026437，反向互補)的87087786-87089377核苷酸，序列同一性達到98%,並且所有的不同之處都在3，UTR。通過基於位點定向誘變的PCR，損壞外顯子M2終止密碼子下遊212bp的I限制性位點。這兩個片段都通過PCR擴增(寡核苷酸參見表2)加入在Ml和M2之間，並且接著通過在內含子6中的S/;/iI位點克隆進入免疫球蛋白yl鍊表達載體，因而得到具有缺少在Ml和M2之間的內含子(內含子7)的基因組結構的雜合y1-y3-y4鍊表達盒。通過亞克隆構建真核表達載體'pmlgGA-A，，所述載體編碼對蛋白"A"有特異性的抗體的分泌型slgG和膜結合型mlgG。質粒包含以下組分(又見圖1B):1.前述的雜合Yl-y3l4重鏈轉錄單元，包含-來自人巨細胞病毒(HCMV)的即刻早期增強子和啟動子，-合成的5'端非翻譯區，包含Kozak共有序列，-包含信號序列內含子的鼠免疫球蛋白重鏈信號序列，-對蛋白質"A，，有特異性的抗體的可變的重鏈的cDNA，-小鼠/人重鏈雜交內含子2，包含與人IGHG1基因相連的小鼠Igp增強子(Jh3-Jh4切換區)，所述IGHG1包含從CH1到CH3的帶有全部插入的內含子的外顯子、用於IgGl分泌形式的多聚腺苷酸化位點、以及包含免疫球蛋白分泌形式的多聚腺苷酸化位點的毗鄰的內含子6的5'部分，-來自人IGHG3基因的內含子6的3，部分和外顯子M1，和-外顯子M2和含有來自人IGHG4基因的免疫球蛋白膜結合形式的多聚腺苷酸化位點的3，非翻譯區。重鏈恆定區的基因組結構在圖2B中有描繪，在SEQIDNO:143中報導核苷酸序列。由質粒pmlgGA-A編碼的，鏈恆定區的短(sIgG)亞型或長(mlgG)亞型的胺基酸序列分別報導在SEQIDNO:144或SEQIDNO:145。2.人K輕鏈的轉錄單元，包含-來自人巨細胞病毒(HCMV)的即刻早期增強子和啟動子，-合成的5'端非翻譯區，包含Kozak共有序列，-包含信號序列內含子的小鼠免疫球蛋白輕鏈信號序列，-對蛋白"A"有特異性的抗體的可變的k鏈的cDNA，-與人免疫球蛋白k恆定(IGKC))基因相連的小鼠內含子2IgK增強子，和畫人IGKC基因3'非編碼區，包含多聚腺苷酸化位點。3.新黴素磷酸轉移酶的轉錄單元，作為哺乳動物細胞選擇標記。4.來自栽體pUC18的複製起點，用於在大腸桿菌中質粒的複製。5.在大腸桿菌賦予氨千青黴素抗性的p-內醯胺酶基因。通過交換編碼y和K鏈的可變區的cDNA序列，構建出slgG/mlgG表達栽體'pmlgGA-B，。它具有與上面對pmlgGA-B所描述的相同構造，但是加以替代的編碼對蛋白"B，，有特異性的抗體。實施例2Sp2/0-Ag14細l包的轉染和分析a)Sp2/0-Agl4細胞的培養和電穿孔Sp2/0-Ag14雜交瘤細胞(ATCCNo.CRL-1581,Shulman，M.等人，Nature276(1978)269-270)培養在RPMI培養液中(英傑公司(InvitrogenCorp.),美國)，其中補充10。/。超低IgG胎牛血清(FCS)(英傑公司，美國)和2mM穀氨醯胺(英傑公司，美國)，在37。C、5%C02和95%的溼度下培養。在20mM的HEPES緩衝液(N-(2-羥乙基)-哌嚷-N'-2-乙烷磺酸)，pH7.0，包含137mMNaCl、5mMKC1、0.7mMNa2HP04和6mM葡萄糖，4。C的條件下，每106個細胞用IO網質粒DNA電穿孔轉染細胞。電穿孔在220V和960F條件下，用Genepulser電穿孔設備(Bio-RadLaboratories公司，美國)進行。轉染後，將細胞以每孔100jil培養液中5000個細胞的密度被分到96孔板中。為選擇轉染的細胞，在電穿孔一天後往培養液裡添加500ng/ml的G418(羅氏診斷有限公司，德國)。每兩至三天更換一次培養液以維持選擇壓力。轉染後約兩個星期，從96孔板分出轉染瘤(transfectoma)克隆，並且進一步在適當的培養容器裡增殖。在含100/o二甲基亞碸(Sigma-Aldrich公司，德國)的低IgG胎牛血清中(英傑公司，美國)中對一個克隆約凍結106個細胞，並儲存在液氮中。每一組16個細胞，用質粒pmlgG-A、pmlgGA-A和plgG-A轉染分別得到15、19和12個獨立的克隆。從每個轉染中隨機挑選了6個克隆作進一步的分析。b)通過流式細胞儀進行IgG定量和分析實施例2a)的每個克隆接種105個細胞於六孔板的2ml含有G418(如上文所述)的培養液中，並培育48小時。此後，收集上清並且通過按照廠商說明書使用'人Fc檢測試劑盒'(CIS國際生物)，通過均相時間分辨焚光(HTRF)免疫測定對分泌型IgG定量。為了用流式細胞儀分析質膜-結合型抗體，每個克隆取105個細胞，在4。C用PBS(磷酸鹽緩衝液)洗2次，然後重懸在50nlFITC-連接的鼠抗人IgG(Dianova,德國)的F(ab，)2片段，按1:50稀釋在含有1%牛血清白蛋白(羅氏診斷有限公司，德國)的PBS中，並在4。C黑暗條件下孵育一小時。在PBS洗2次後，細胞重懸在PBS中並且用BDFACSCalibur流式細胞儀(BD生物科學，美國)進行分析。對於每個克隆測定螢光強度的中值，作為對結合到細胞表面IgG數量的測量。圖3中，將每個克隆在流式細胞儀中螢光強度的中值，與其在細胞培養上清中的IgG濃度一起顯示。觀察到，對轉染pmlgG-A或pmlgGA-A的克隆(即編碼sIgG和mlgG兩種形式的質粒)分泌型IgG數量的增加與升高的細胞表面信號相對應。這種相關性在轉染pIgG-A(即只編碼sIgG、抗體分泌形式的質粒)的克隆中觀察不到。實施例3用流式細胞儀分選穩定轉染的細胞為了產生穩定表達IgG的克隆，將>106個Sp2/0-Ag14細胞用質粒pmlgG-B由電穿孔轉染。轉染後一天，細胞被轉移到500ng/ml的G418選擇培養液並且作為庫培養約兩個星期。選擇後，結合到轉染後細胞表面的IgG被標記並且通過流式細胞儀分選信號最強的細胞。因此，將來自庫的4xl(^個細胞在4。C用培養液洗2遍，然後與FITC-連接的鼠抗人IgG(Dianova，德國)的F(ab，)2片段共同孵育，在培養液中1:50稀釋，冰上放置20分鐘。經過兩步培養液的洗滌後，將細胞重懸在培養液中並轉移至BDFACSVantage流式細胞儀(BD生物科學，美國)。設定包含著樣本細胞群中焚光強度在前5-6%的細胞的門通道(圖4)，並且收集通過這個通道分選的細胞。在選擇培養液中培養所收集的細胞數天以擴增。用這些細胞進行如上所述的第二和繼而第三分選循環。替代將分選細胞作為庫來收集的是，使用第四和最後一個分選步驟使單個細胞沉積在96孔板內。該過程得到了141個獨立的克隆，從其中選出了21林克隆用於如實施例2b)所述通過HTRF免疫測定進行的IgG抗體表達分析。從這些中選出的兩個克隆5B11和9B3顯示出最高的IgG分泌率和相應最強的細胞表面信號，使該克隆適應於轉瓶無血清生長，以對其生產力進行進一步評估。實施例4克隆的比生產率的測定為確定其比生產率，在確定的條件下培養克隆5B11和9B3，所述條件為在ProCH06k培養液(Cambrex公司，美國)中，補充lx膽固醇/脂類濃縮物(英傑^^司，美國)、4mM穀氨醯胺(英傑^^司，美國)和250ng/ml的G418(羅氏診斷有限公司，德國)、在100ml轉瓶(Belco，美國)培養。細胞在37。C、5%(:02和95%的溼度下生長，直到靜止的生長期。在指數增長階段的數個時間點，用CASY細胞計數器測定每個克隆的細胞數，並且用蛋白A親和層析法測定上清中IgG的濃度(見下文)。作為參考，在同等條件下培養和分析克隆J5-H3。這個克隆也來自Sp2/0-Agl4轉染細胞，和穩定表達與克隆5B11和9B3相同的抗體，雖然只有其分泌形式。克隆J5-H3是通過常規的數次限制稀釋及亞克隆步驟所產生的，並從1000多個克隆篩選出來，以滿足工業製造過程的生產率的要求。細胞培養上清中的IgG濃度是由使用AktaTMexplorer色傳單位(GE健康保健，formerAmersham生物科學，瑞典)的分析親和層析法來測定。將限定體積的細胞培養上清加入蛋白A凝膠柱，以促進IgG結合到親和基質上。所述柱用100mM，pH5.0的檸檬酸清洗兩遍，然後100mM，pH3.0的檸檬酸洗脫結合的抗體。用連續記錄的洗脫液在280nm的紫外吸收光諳監控洗脫過程。在用含有確定抗體濃度的標準樣品系統校準後，從整合的紫外吸光值計算樣本的抗體濃度。通過下列公式從細胞計數和細胞培養上清的IgG濃度計算每一克隆的比生產率(SPR):formulaseeoriginaldocumentpage62崎G)其中-"/^(/^)"是指時間間隔開始和結束之間，在上清中IgG濃度的差異，以pg/ml沐示，-""T^T"是指時間間隔開始和結束時的細胞計數的算術平均數，以[細胞/mll表示，-""是指時間間隔的長度[d，以[天l表示。每個克隆的平均SPR是基於在指數生長階段的幾個時間點計算的四個不同的SPR來確定的(圖5和表5)。表5:比生產率的確定(SPR)。tableseeoriginaldocumentpage63由膜結合型mlgG分選的5B11和9B3這兩個克隆，顯示出平均SPR在15和20pg.細胞".天"之間，這是在適合工業規模製造克隆的範圍內。這些克隆的SPR可以與能夠從通過實驗室常規策略在相同細胞系獲得的和表達相同抗體的克隆(克隆J5-H3)的SPR相比。實施例5用免疫螢光顯微鏡檢測slgG和mlgG通過免疫螢光顯微鏡檢測細胞內和細胞表面結合的抗體。為了進行細胞內染色，將附著於多聚賴氨酸塗層顯微鏡玻片的細胞用溶於PBS的2%(V/V)的甲醛固定10分鐘，用溶於PBS的2%(V/V)的TritonX-100通透IO分鐘，並且用PBS洗兩次。非特異性結合位點用溶於PBS的3。/。(w/V)的BSA(牛血清白蛋白)封閉30分鐘。用洗滌緩沖液(WB:0.2%(w/v)BSA、0.1%(v/v)Tween20溶於PBS)洗細胞兩次，然後與R-藻紅蛋白綴合的山羊抗人IgG(Dianova，德國)的F(ab，)2片段孵育一小時，所述IgG是1:50稀釋在WB中。用WB洗塗四次和用雙重去離子水洗滌兩遍之後，把細胞封固在蓋玻片下，存放在4。C黑暗條件直到顯微鏡觀察。為了對細胞表面結合抗體染色，將105細胞用溶於PBS的冷的1%(w/v)BSA洗一遍，然後非特異性結合位點用溶於PBS的1%(w/V)的BSA冰上封閉30分鐘。為了標記IgG,細胞與R-藻紅蛋白連接的羊抗人IgG(Dianova，德國)的F(ab，)2片段冰上孵育一小時，所述IgG是1:50稀釋在PBS中。在用水PBS洗滌兩次之後，細胞附著於多聚-L-賴氨酸塗層的顯微鏡玻片，並且用溶於PBS的2。/。(V/V)的甲醛室溫固定10分鐘。用PBS清洗兩次後，將細胞封固在蓋玻片下，並且直到顯微鏡觀察之前都存放在4°C黑暗條件。應用Plan-APOCHROMAT40x/1.0物鏡，在Axiophot焚光顯微鏡上分析(CarlZeiss,德國)細胞內和表面標記的細胞。在克隆5B11中，可以在細胞表面(圖6，圖像l)以及細胞內(圖4)檢測到主要是mlgG形式的抗體，這都是表達/分泌途徑的IgG形式。相比之下，在克隆J5-H3中，只可以檢測到細胞內抗體(圖6，圖像2和5)，因為這林克隆不表達mlgG。在沒有轉染的Sp2/0-Ag14細胞系(圖6，圖像3和6)，用這兩種方法都，見察不到染色，因為這些細月包才艮本不表達IgG。實施例6通過RNA印跡檢測，鏈mRNA亞型為了界定通過原始轉錄本的選擇性剪接/多聚腺苷酸化形成的二個重鏈亞型之間的比例，用RNA印跡來分析穩定轉染克隆的RNA。因此，使用RNeasy技術(Qiagen，德國)從細胞提取總RNA。在每個個案中，接著通過變性瓊脂糖凝膠電泳將10照的總RNA分離，並使用RNA印跡法Max系統(Ambion公司，美國)轉移至尼龍膜。為了印跡膜的雜交，使用DECAprimeII試劑盒(Ambion公司，美國)通過隨機引物法用[a-"P標記兩種不同的DNA探針。如同圖7B所述，探針'A'與外顯子CH1和CH3之間的重鏈mRNA互補，因此同時能雜交至兩個亞型。相反，探針的'B，僅結合到長mlgG重鏈mRNA的3'UTR。膜經過雜交和嚴格的清洗之後，通過放射自顯影對其印跡進行分析。圖7A代表用來自克隆5B11、克隆J5-H3和Sp2/0-Ag14細胞系的總RNA的RNA印跡的放射自顯影。用'A'探針的雜交顯示了在兩個抗體表達克隆(泳道1和2)中主要的1.8kb信號，其對應於編碼slgG重鏈的短mRNA亞型的預期大小。在所描述的長時間膝光裡，在2和4kb之間也檢測到一些弱信號。3.3kb條帶僅在克隆5B11(泳道l)可見，代表了編碼mlgG重鏈的長mRNA亞型，因為當用探針'B，(泳道4)雜交印跡時，會檢測到作為單一的信號的具有相同遷移模式的條帶。在泳道l中1.8kb和3,3kb條帶的相對信號強度的比較，說明轉基因抗體重鏈的原始轉錄本主要加工為產生抗體slgG形式的小mRNA亞型。只有較小量(少於5%)完全被剪接成長mRNA亞型，從而得到質膜結合型mlgG。實施例7用鹼性碳酸鹽提取和免疫印跡純化和檢測IgG重鏈亞型為了檢測mlgG重鏈，通過使用Fujiki本發明的鹼性碳酸鹽提取方法從穩定轉染細胞中提取膜蛋白(Fujiki，Y.等人，J.CellBiol.93(1982)97-102)。在每個個案中，用PBS將107細胞洗兩次，然後在水上用0.1MNaCl洗一次。在懸浮於lml冷的0.1MpH11.5的Na2C03之後，通過超聲破碎20秒破壞細胞，在水上孵育30分鐘，然後在4。C以200000xg離心60分鐘。通過這一步，將仍含有整合膜蛋白的細胞膜與可溶性內容物分離開。收集此上清並加入TritonX-100至終濃度為lD/。(w/v)、N-辛基-卩-D-葡萄糖苷至終濃度60mM、pH7.4的TRIS-HC1至終濃度50mM和NaCl至終濃度為300mM("SN組分")。從而，將膜顆粒溶解在1.1ml0.1MpH11'5的Na2C03、1%(w/v)的TritonX-IOO、60mM的N-辛基畫卩-D-葡萄糖苷、50mMpH7.4的TRIS-HC1和300mM的NaCl。在那一步驟之後，通過在15000xg離心10分鐘去除不溶性成分，收集其上清作為"膜組分"。進行蛋白A的下^i實驗以從膜或SN組分中純化抗體亞型。因此，每個組分與30^1床體積的蛋白A凝膠柱(GE健康保健，先前是Amersham生物科學，瑞典)在4。C孵育60分鐘，然後用含有0.02%(v/v)IgepalCA360的PBS洗4次。使結合到蛋白A基質上的蛋白質在70°C下通過還原蛋白質凝膠樣品緩衝液被洗脫，以及通過SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳(NuPAGE-系統，英傑公司，美國)被分離。根據半乾免疫印跡法(Ausubel，F.A.等人(編輯)CurrentProtocolsinMolecularBiology,第2巻,JohnWiley和Sons,Inc.,NewYork(1995))將分離的蛋白質轉移到PVDF(聚偏氟乙烯)膜上。用連以辣根過氧化物酶的多克隆兔抗人IgG抗體(DakoCytomation，DAKOA/S，丹麥)標記固定在膜的IgG重鏈，並且通過在LUMI-成像儀Fl(羅氏診斷有限公司)上的化學發光反應(LUMI-增強發光免疫印跡試劑盒，羅氏診斷有限公司)檢測。在表達抗體的兩個克隆的膜和SN組分裡都可以檢測出slgG重鏈的強信號(克隆5B11和J5-H3，參見圖8，泳道l、2、4和5)。在克隆5B11的個案中，檢測到遷移在slgG重鏈上方的額外蛋白質(圖8，泳道l)。主要在這一克隆的膜組分中發現此條帶，所述組分中整合的膜蛋白被富集。其代表了較大的mlgG重鏈亞型，計算的分子量比slgG重鏈高8kDa。在克隆J5-H3中(圖8泳道2)始終沒有相應的信號，因為此克隆純粹表達抗體的分泌型形式。實施例8CHO-K1細力包的培養和轉染將已預先適應在懸浮培養基中無血清生長的CHO-K1細胞(ATCC號CCL-61;Puck，T.T.等人,J.Exp.Med.108(1958),945-956)培養在ProCH04-CDM培養液中(Cambrex公司，美國)，補充8mML-丙氨醯-L陽穀氨醯胺(英傑^^司，美國)和lx羥色胺(HT)補充物(英傑公司，美國)，在37。C、5%司，美國)，在總體積8ml1。/。(w/v)BSA中在冰上於黑暗中染色細胞30分鐘。通過帶有l%(w/v)BSA的培養液兩步洗滌之後，將細胞重懸於培養液中並且轉移到BDFACSAria細胞分選儀(BD生物科學，美國)。通過前散射/側散射(FSC/SSC)散點圖來門控活的單細胞群，亞群定義為包含門控的活細胞中螢光強度在前5%的細胞，從這個亞群收集了約45,000個細胞(mlgG-分選細胞庫)。不論它們的螢光，隨機從FSC/SSC-選通活細胞群中收集約40,000個細胞作為對照(對照細胞庫)。通過在選擇培養液(參見實施例8)培養兩個星期擴增收集的細胞庫。接著進行第二分選循環。如上文所述，對來自mlgG-分選細胞庫的細胞的細胞表面IgG染色。使用BDFACSAria細胞分選儀(BD生物科學)從活的單細胞群中分選螢光強度前4%的細胞(由FSC/SSC散點圖門控)。將分選的細胞作為單個細胞收集到96孔板內。隨機的從FSC/SSC門控的、未染色細胞群中收集來自對照細胞庫的單個細胞。在選擇培養液(參見實施例8)培養三周擴增單細胞克隆。實施例10通過ELISA測定IgG濃度通過夾心ELISA法測定細胞培養上清中的免疫球蛋白濃度，其中使用連有生物素的抗人IgG的F(ab，)2片段作為捕獲試劑和使用綴合過氧化物酶的抗人IgG的F(ab，)2抗體片段檢測。鏈黴親和素塗層的96孔板(皮爾森Reacti-BindTM鏈黴親和素塗層聚苯乙烯平板，貨號15121)用0.5ng/ml連有生物素的多克隆山羊抗人IgG的F(ab，)2抗體片段(F(ab，)2〈h-FrpBi;Dianova，德國，貨號109-066-098)捕獲抗體(0.1ml/孔)在稀釋緩沖液(稀釋緩衝液含0.5%重量體積比(w/v)的牛血清白蛋白的PBS緩沖液)中在室溫(RT)下搖動孵育一個小時。此後，用多於0.3ml的洗塗緩衝液(洗滌緩沖液含1%(w/v)的吐溫20的PBS)洗板3次。將含有IgG的細胞培養上清(樣本)系列稀釋(兩倍)達到在稀釋緩衝液中0.5-20ng/ml的濃度，加入孔中在室溫(RT)下搖動孵育一小時。稀釋緩衝液中純化的標準抗體(0.5-20ng/ml)用於IgG蛋白質標準曲線的生成。在用0.3ml/孔的洗滌緩衝液洗板3次後，用多克隆山羊抗人F(ab，)2-特異IgG(F(ab，)2POD;Dianova,德國，貨號109-036-098)的過氧化物酶連接的F(ab，)2片段可檢測結合到抗人Fq片段的結合複合物。之後用0.3ml/孔的洗滌緩衝液清洗板子3次，平板通過ABTS⑧(2，2，-連氮基-雙(3畫乙基苯並噻唑-6-磺酸)過氧化物酶底物溶液(羅氏診斷有限公司，德國，貨號168"02)顯影。10-S0分鐘後，以空白試劑(孵育緩衝液+ABTS溶液)為對照，在TecanSpectrafluorplus板閱讀器(TecanDeutschlandGmbH，德國)測量405nm和4卯nm處的吸光度。根據下列公式，用在405nm處的吸光度減去490nm處的吸光度進行背景校正formulaseeoriginaldocumentpage68從標準曲線計算該樣本的IgG成份。實施例11表達mlgG的CHO克隆的篩選和選擇單細胞沉積在96孔板三周後，通過ELISA分析515個mlgG-分選的克隆和550個對照克隆的細胞培養上清(參見實施例10)。表6顯示了不同IgG濃度水平的克隆的分布。表6:通過ELISA篩選96孔平板沉積的克隆tableseeoriginaldocumentpage69觀察到，在對照方法中，所有克隆的百分之九十顯示為1pg/ml和低於ljig/ml的IgG的濃度。相反，沒有mlgG-分選克隆落入這個組。此外在這個方法中，有6個克隆達到高於22pg/ml的IgG濃度，然而在對照方法裡，測出的最高IgG濃度為12.3^g/ml。接著將所有IgG濃度大於10ing/ml的mlgG-分選克隆和所有IgG濃度大於3pg/ml的對照克隆轉移至24孔平板做第二輪篩選。通過在選擇培養液(參見實施例8)培養20天使克隆過度生長，然後用測定其細胞培養上清的IgG濃度。表7顯示了不同IgG濃度水平的克隆的分布。表7:通過ELISA篩選放入24孔板的克隆tableseeoriginaldocumentpage69tableseeoriginaldocumentpage70對照克隆顯示出平均6.1pg/ml的IgG濃度和高達16.8叫/ml的表達水平。對比之下，mlgG-分選克隆平均表達為31.4pg/ml，在這組中觀察到的克隆具有最高IgG濃度為58.9pg/ml。接著將六個IgG濃度大於45pg/ml的mlgG-分選克隆和兩個IgG濃度大於10ng/ml的對照克隆轉移到125ml搖瓶中作進一步評估。實施例12選定的CHO克隆的生產力評估為了適應搖動，將實施例11中選定的克隆轉移到125ml搖瓶，在25ml選擇培養液中(參見實施例8)，在標準條件下，於150rpm轉動搖床上培養一周時間(參見實施例8)。此後，對於每個克隆，以lxl(^細胞/ml接種於25mlProCH05-CDM培養液(Cambrex公司，美國)，補充8mML-丙氨醯-L-穀氨醯胺(英傑公司，美國)、lxHT的補充物(英傑公司，美國)和400pg/ml的G418(羅氏診斷有限公司，德國)，並在125ml搖瓶中進行如前所述的培養。在第0、1、2、3、4、7天，由CASYTT細胞計數器(Sch3rfeSystems,德國)測定每個克隆的細胞計數，表明所有測試克隆的可比增長(參見表8)。表8:搖瓶培養的細胞計數_tableseeoriginaldocumentpage70tableseeoriginaldocumentpage71在第十天收集細胞培養上清和通過ELISA測定IgG濃度。表9:通過ELISA對第IO天搖瓶培養的生產力測定tableseeoriginaldocumentpage71觀察到，六個mlgG-分選克隆裡的三個(即克隆1A1、1B6和1D6)顯示在相當於兩個對照克隆的範圍內的表達水平。其他三個mlgG-分選克隆(即克隆1C5、1D1和2D6)顯示出明顯上升的IgG表達，其達到比對照克隆中觀察到的高3.3倍。實施例13選擇的CHO克隆的RNA雜交分析適應於在搖瓶裡生長(參見實施例12)的六個mlgG分選克隆和兩個對照克隆，通過RNA雜交分析以確定在原始轉錄本的選擇性剪接形成的兩個重鏈亞型之間的比例。為了對比，對克隆，27，進行平行分析。此克隆已由僅有同一抗體的分泌形式的基因組結構的表達栽體穩定轉染CHO-K1細胞而獲得。RNA印跡法如實施例6中詳細描述的進行，並顯示在圖9中。實施例14slgG/IgG-GPI表達載體'pIgG-GPI-B，的構建為了將免疫球蛋白錨定到質膜，原有的由外顯子M1的3'部分編碼的跨膜結構域以及由外顯子M2編碼的胞內區，被介導糖基磷脂醯肌醇(GPI)錨定的人胎盤鹼性磷酸酶的羧基端信號肽替代。因此，在質粒pmlgGA-B(參見實施例lc)中的DNA序列編碼的下列53個胺基酸IRQGA(SEQIDNO:146)被由編碼下列人胎盤鹼性磷酸酶(NCBI登錄號M13077;核苷酸1542-1643)羧基端信號肽的胺基酸序列的DNA序列所替代AGTTDAAHPGRSVVPALLPLLAGTLLLLETATAP(SEQIDNO:147)。在SEQIDNO:148中給出"鍊表達盒恆定區的核酸序列，來自表達質粒plgG-GPI-B的CHI到3'UTR。在SEQIDNO:149中給出質粒plgG-GPI-B編碼的y-鏈恆定區的slgG亞型的相應胺基酸序列。在SEQIDNO:150中給出y-鏈恆定區的長亞型的相應胺基酸序列，包括由質粒plgG-GPI-B編碼的人胎盤鹼性磷酸酶羧基端信號肽。這個質粒允許表達由重鏈前體mRNA選擇性剪接的抗體的分泌形式(slgG)和GPI錨定形式(參見圖10)。權利要求1.核酸，其以5』到3』的方向包含a)編碼異源多肽的第一核酸，其沒有符合讀碼框的終止密碼子，b)起始於5』剪接供體位點和終止於3』剪接受體位點的第二核酸，其包含符合讀碼框的翻譯終止密碼子和多聚腺苷酸化信號，c)第三核酸，其編碼i)至少跨膜結構域的片段，或ii)GPI-錨定物的信號肽。2.包含根據權利要求1的核酸的真核細胞。3.根據權利要求2的真核細胞，其特徵在於所述真核細胞選自由CHO細胞、NS0細胞、Sp2/0細胞、COS細胞、K562細胞、BHK細胞、PER.C6細胞和HEK細胞組成的組。4.核酸，其以5，到3，的方向包含a)第一多克隆位點，b)起始於5，剪接供體位點和終止於3，剪接受體位點的核酸，其中i)所述核酸包含終止密碼子和多聚腺苷酸化信號，和ii)所述核酸在前體mRNA加工過程中不會被組成性移除，c)第二多克隆位點。5.選擇表達異源多肽的真核細胞的方法，由此該方法包含a)用核酸轉染真核細胞，所述核酸以5，到3，的方向包含i)編碼異源多肽的第一核酸，該核酸沒有符合讀碼框的翻譯終止密碼子，ii)起始於剪接供體位點並且終止於剪接受體位點的第二核酸，其包含符合讀碼框的翻譯終止密碼子和多聚腺苷酸化信號，iii)第三核酸，其編碼iiia)至少跨膜結構域的片段，或iiib)GPI-錨定物的信號肽，b)在一定條件下培養所述轉染的細胞，所述條件包括適於從所述核酸產生前體mRNA、適於所述前體mRNA的加工、以及適於所迷加工後mRNA翻譯成多肽，其中所述轉染的細胞通過選擇性剪接所述前體mRNA產生可溶的異源多肽和質膜-結合的異源多肽，和c)選擇具有質膜-結合的異源多肽的細胞作為所迷表達異源多肽的細胞。6.根據權利要求5的方法，其特徵在於所述異源多肽選自的多肽組包含激素；細胞因子；白介素；免疫球蛋白；抗融合肽；生長因子；受體的配體、激動劑或拮抗劑；細胞毒性劑；抗病毒劑；顯象劑；酶抑制劑；酶的激活劑或酶活性調節劑，如變構物；及其片段和融合物。7.根據權利要求5或6的任一項的方法，其特徵在於i)所述第一核酸編碼至少免疫球蛋白重鏈CH3或CH4結構域的片段，ii)所述第二核,始於免疫球蛋白重鏈CH3或CH4結構域外顯子的5，剪接供體位點和終止於繼之的免疫球蛋白重鏈跨膜結構域外顯子Ml的3，剪接受體位點，iii)所述第三核酸至少是免疫球蛋白跨膜結構域的片段。8.根據權利要求5或6的任一項的方法，其特徵在於所述第二核酸通過編碼多肽或蛋白質的核酸獲得，所述多肽或蛋白質選自的組包含C3b/C4b受體；人、雞和大鼠EGFR;FGFR;人和小鼠免疫球蛋白Iga、s、y、n重鏈；人PLAz受體；雞Cek5;和小鼠白血病抑制因子受體a-鏈。9.生產由根據權利要求l的核酸編碼的異源多肽或蛋白質的方法，包括a)提供真核細胞，b)用根據權利要求l的核酸轉染所述真核細胞，c)在適合表達所述核酸的條件下培養所述轉染的細胞，d)從培養液或細胞的胞質中回收所述多肽或蛋白質。10.製備根據權利要求2的細胞的試劑盒，其包含根據權利要求4的載體。全文摘要本發明描述了核酸，該核酸以5』到3』的方向包含a)編碼異源多肽的第一核酸，其沒有符合讀碼框的終止密碼子，b)起始於5』剪接供體位點和終止於3』剪接受體位點的第二核酸，其包含符合讀碼框的翻譯終止密碼子和多聚腺苷酸化信號，和c)核酸，其編碼i)至少跨膜結構域的片段，或ii)GPI-錨定物的信號肽。文檔編號C12N15/82GK101410525SQ200780010828公開日2009年4月15日申請日期2007年5月15日優先權日2006年5月17日發明者E·科佩茨基,G·蒂分塔勒,J·恩德爾,O·普羅特奈爾,U·施瓦茨申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司