一種生物質材料油脂的提取方法及其應用的製作方法
2023-05-13 02:34:26 2
一種生物質材料油脂的提取方法及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種生物質材料油脂的提取方法及其應用。本發明生物質材料油脂的提取方法採取高滲透性的DMSO-甲醇強極性溶劑在溫和條件下破壞細胞的細胞膜和細胞壁，再用弱極性的正己烷/乙醚溶劑系統對胞內脂肪體中的甘油酯等中性油脂進行提取。本發明生物質材料油脂的提取方法可用於分析生物質材料總脂含量和脂肪酸組成。本發明操作簡單快速，條件溫和，環境壓力小，提取率高，其中細胞破壁率、油脂萃取率均可達99%以上，提取油脂過程無酸敗、脂質氧化發生，提取獲得的總脂能較好地維持其在生物材料中原始組分和結構，可為後續的脂肪組學及脂肪酸組分的解析提供高品質油脂材料。該方法對總脂含量和脂肪酸組分分析的重現性好，可靠性高。
【專利說明】一種生物質材料油脂的提取方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種生物質材料油脂的提取方法及該方法在生物質材料總脂含量和 脂肪酸組成分析中的應用。
【背景技術】
[0002]隨著全球經濟發展和人口增長，油脂與人類的關係越來越密切，無論是作為生物 柴油的原料還是加工成為保健食品，油脂都具有至關重要的作用。目前，油脂的主要生物 材料來源仍然是植物如油菜、棕櫚樹、橄欖、芝麻科、豆科、棉科、花生科等，以及動物脂肪， 但是這種傳統的油脂來源已經遠遠不能滿足人類食用、工業使用等需求因此尋求成本低、 來源廣以及成分好的油脂原料是目前油脂科學相關研究的重要領域之一(孫珊，鄭立，韓笑 天.微藻油脂含量和組分及影響因子的研究[J].海洋科學，2009，33 (12): 15-16)。
[0003]近年來，微藻、真菌等單細胞生物，能在通過光合自養或者光合異養在細胞內大量 合成油脂並以脂肪體和油滴的形式儲存於細胞內。通常合成儲存於細胞內的油脂含量為細 胞乾重的 20%-70% (Li, Y.Zhao, Z.Bai, F.Enzyme Microb.Technol.2007，41:312-317)，其 中，有些生物體如隱甲藻、裂殖壺菌、高山被孢黴菌、菱形藻等生物體合成油脂50%以上由 人體必需多不飽和脂肪酸如DHA (二十二碳六烯酸)、EPA (二十碳五烯酸)、AA (二十碳四烯 酸)等組成。因此，篩選和選育高產油或高產高值活性產物油脂的單細胞生物種源在近年來 受到及其廣泛的關注。尤其是近年來隨著微藻生物能源的快速發展，選育獲得優質高產油 微藻及其它產油微生物已經是亟待攻克的科學和技術難題。
[0004]由於微藻、真菌如酵母、裂殖壺菌等單細胞生物在油脂積累後常形成堅硬的細胞 壁，傳統用於魚類等動物組織樣品總脂提取和分析的方法，因無法有效破碎細胞壁，很難有 效直接應用於厚壁單細胞產油生物體的油脂提取。
[0005]目前對厚壁單細胞產油生物體油脂的提取方法主要包括機械破壁處理後 (Matthews R F, Braddock R J.Food Technology, 1987, 41:57-61)米用超臨界萃取 法(CN1015500078A)、或者直接借鑑傳統用於魚類組織樣品總脂提取的高毒有機溶劑 萃 取 法(Bligh E G, Dyer W J.A rapid method of total lipid extraction and purification [J].Can J Biochem Physiol, 1959，37:911-917)。上述依賴於機械破壁後的 溶劑提取方法首先因機械破壁效率不高(通常小於70%)而導致後續總脂提取不完全，進而 大大低估了總脂的含量；其次，不同微藻和菌體細胞壁的生物質組成差異較大，堅固程度也 不一，很難通過一個固定的操作模式達到對成千上萬種生物細胞的普適性；再次機械破壁 往往伴隨著超聲、高壓、高溫等極端操作條件，提取油脂過程易導致脂質氧化、酸敗等，這對 後續以總脂含量、脂肪組學(脂質的組成)、高值產物(多不飽和脂肪酸含量)為主導的篩選 參數會造成嚴重影響。此外，直接採用氯仿甲醇等高毒有機溶劑的直接提取方法因無法有 效破碎細胞壁，而對微藻和真菌細胞油脂提取效率極低。最後，索氏抽提法提取溫度較高， 容易引起不飽和脂肪酸的氧化、酸敗問題，影響後續篩選。氯仿等高毒有機溶劑在操作過程 中對操作人員和環境也將構成安全隱患。
【發明內容】
[0006]本發明的首要目的在於克服現有技術的缺點與不足，提供一種生物質材料油脂的提取方法。
[0007]本發明的目的還在於提供上述生物質材料油脂的提取方法在生物質材料總脂含量和脂肪酸組成分析中的應用。
[0008]本發明採用低毒性的雙溶劑系統在溫和條件下進行總脂的破壁提取，減小環境危害，優化工藝過程，避免提取過程油脂酸敗、氧化的發生，提高提取效率，再結合氣相檢測技術，精確解析脂肪酸的組成。
[0009]本發明的目的通過下述技術方案實現:
[0010]一種生物質材料油脂的提取方法，包含如下步驟:將生物質材料加入到甲醇和DMSO的混合溶劑中水浴加熱破壁，離心收集上層油相；往離心的沉澱中加入親脂性的有機溶劑水浴加熱萃取油脂，離心收集上層油相，油脂在上層油相中。
[0011]所述的生物質材料不限於產油單細胞生物，還包括產油動植物細胞、組織和器官。其中產油單細胞生物包括但不限於:酵母、黴菌、細菌和微藻等；例如:真菌中常見的產油微生物有:淺白色隱球酵母(Cryptococus albidus)、彎隱球酵母(Cryptococus albidum)、斯達氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)、類酵母紅冬抱(Rhodosporidium torulqides)等；常見的產油黴菌有:土黴菌(Asoergullus terreus)、紫癜麥角菌(Claviceps purpurea)、高梁裙抱黑粉菌(Tolyposporium ehrenbergii)、高山被抱黴(Mortierella alpina)、深黃被抱黴(Mortierella isabellina)等。產油細菌有:棒狀桿菌(Corynebacterium)、諾卡氏菌(Nocardia)、分枝桿菌(Mycobacterium)等。產油微藻有:小球藻(Chlorella sp.)、球等邊金藻(Isochrysis galbana)、球等鞭三角褐指藻(Phaeodactylumtric ornutum)、裂殖壺菌(Schizochytrium Iimacinum)、隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)等。產油動植物細胞、組織和器官包括高等植物種子和其它組織，水生植物的種子和其它組織，動物細胞、組織和器官。
[0012]所述的甲醇和DMSO的混合溶劑中甲醇與DMSO的體積比優選為5?10:1。
[0013]所述的親脂性的有機溶劑優選為正己烷與乙醚按體積比0.5?2:1組成的混合溶劑。
[0014]所述的水浴加熱破壁和水浴加熱萃取油脂的條件均優選為45?60°C水浴加熱10?40分鐘。為了提高破壁效率，可在水浴加熱的過程中增加不斷連續攪拌的操作。
[0015]上述生物質材料油脂的提取方法在生物質材料總脂含量和脂肪酸組成分析中的應用。
[0016]一種生物質材料總脂含量的分析方法，包括如下步驟:
[0017](I)對待測定生物質材料進行冷凍乾燥處理；準確稱取一定量生物質材料；
[0018](2)加甲醇和DMSO的混合溶劑水浴加熱破壁，離心，收集上層油相；
[0019](3)收集離心的沉澱，加入親脂性的有機溶劑水浴加熱萃取油脂，離心收集上層油相；
[0020](4)合併上述收集的油相，水洗，離心，收集上層油相；
[0021](5)下層水相用有機溶劑萃取，離心，收集上層油相；[0022](6)合併油相併進行濃縮處理，獲得總脂，計算總脂含量。
[0023]步驟(5)中所述的有機溶劑優選為正己烷或石油醚。
[0024]步驟(6)中所述的濃縮處理的方法優選為用氮氣吹乾、真空離心乾燥或其它小體 積濃縮方法，並冷凍乾燥除去油脂中的痕量水。
[0025]優選的，所述的生物質材料總脂含量的分析方法，包括如下步驟:
[0026]( I)對待測定生物質材料進行冷凍乾燥處理；準確稱取冷凍乾燥後的生物質材料 100?200mg (總脂含量在20% (w/w)以上的，為使總脂含量在60?120mg，需要適當增加 或減少待測物質的用量);
[0027](2)加2?IOmL甲醇與DMSO以體積比5?10:1組成的混合溶劑45?60°C水浴 加熱10?40分鐘破壁，離心，收集上層油相；
[0028](3)重複步驟(2)，將離心的沉澱用甲醇與DMSO的混合溶劑水浴加熱破壁I?5 次，收集上層油相；
[0029](4)收集離心的沉澱，加入2?IOmL正己烷與乙醚以體積比0.5?2:1組成的混 合溶劑45?60°C水浴加熱10?40分鐘萃取油脂，離心收集上層油相；
[0030](5)重複步驟(4)，將離心的沉澱用正己烷與乙醚的混合溶劑水浴加熱萃取油脂 I?5次，收集上層油相；
[0031](6)合併上述收集的油相，水洗，離心，收集上層油相；
[0032](7)下層水相用正己烷或石油醚萃取，離心，收集上層油相；
[0033](8)重複步驟(7) I?3次，收集上層油相；
[0034](9)合併油相，用氮氣吹乾、真空離心乾燥或其它小體積濃縮方法進行油脂濃縮處 理，再用冷凍乾燥的方法除去油脂中的痕量水，獲得總脂，計算總脂含量。
[0035]一種生物質材料總脂脂肪酸組成的分析方法，包含如下步驟:
[0036](I)使用上述方法獲得總脂後，用有機溶劑配製一定濃度的總脂溶液；
[0037](2)將總脂溶液用氮氣吹乾後進行甲酯化，萃取甲酯化生成的脂肪酸甲酯；
[0038](3)氣相檢測分析脂肪酸甲酯組成及含量。
[0039]步驟(I)中所述的有機溶劑優選為正己烷或石油醚，所述的總脂溶液的濃度優選 為 10 ?30mg/mL。
[0040]步驟(2)優選為:取50?100 ii L濃度為10?30mg/mL總脂溶液，氮氣吹乾後，力口
0.5?2mL濃度為0.1?Imol/mL的KOH-甲醇溶液，40?70°C水浴反應10?40min ;待冷 卻到室溫，加0.5?2mL濃度為14%的BF3-甲醇溶液，45?65°C水浴反應5?20min ;待冷 卻到室溫，加0.5?2mL飽和食鹽水和0.5?2mL正己燒或石油醚萃取脂肪酸甲酯。
[0041]步驟(3)中所述的氣相檢測的方法優選為:色譜柱:毛細管柱HP-88 (60mX250umX0.2um)或類似固定相的毛細管氣相色譜柱；載氣:高純度N2 ;柱流速:
1.5mL/min ;尾吹流速:25mL/min ；H2 流速:30mL/min ;空氣流速:400mL/min ;分流比:20:1 ； 汽化室溫度:240°C ；，檢測器溫度:240°C ;色譜柱梯度升溫:初始溫度為100°C，保持5min， 以 4°C /min 升至 240°C,保持 IOmin0
[0042]本發明基於「相似相溶」原理，細胞體與雙溶劑充分混合接觸時，極性溶劑甲醇、 DMSO會溶解藻細胞的極性脂如磷脂、糖脂、脂蛋白、脂多糖等成分，從而破壞極性脂質與蛋 白質分子間的氫鍵和靜電作用，使非極性溶劑正己烷進入細胞並溶解胞內疏水性的脂肪體以及組成脂肪體或脂滴的中性脂成分，並且由於使用的試劑溫和，不會使提取出的脂類物質成分改變，符合多不飽和脂肪酸和脂肪組學樣品製備提取要求。充分萃取後，在體系中加入水，極性溶劑即溶於水而與含油脂的非極性溶劑分層，後又用非極性溶劑正己烷洗滌油脂層I?3次，使油脂萃取更加完全，並減少油脂中的非油膠質等雜質，從而提高了總脂和脂肪酸測定的準確度。
[0043]本發明在用有機溶劑破壁提取的過程中，加入加熱攪拌的步驟，增大破壁剪切力，提高破壁率和提取率。其中水浴溫度不得高於有機溶劑的沸點，本發明水浴溫度45?60。。。加熱攪拌時間10?40分鐘。
[0044]本發明在油脂甲酯化步驟中，先在KOH-甲醇溶液中發生皂化反應，再用BF3催化脂肪酸甲酯化，整個反應過程均在45?65°C水浴中進行，以使反應完全。
[0045]本發明在油脂檢測過程中，使用操作簡單，環境危害小，檢測限高的氣相色譜準確測定油脂的組成及含量。
[0046]本發明相對於現有技術具有如下優點和效果:
[0047]本發明基於對微藻和菌體等生物體細胞壁的深入研究，認識細胞壁生物質組成的基礎上，創造性的提出了以高滲透性的DMSO-甲醇強極性溶劑在溫和條件下先行破壞細胞的細胞膜和細胞壁，在細胞壁和細胞膜上溶解或者部分溶解細胞膜上的極性磷脂和糖脂層，大大改善和提高了細胞膜和細胞壁的通透性。然後改用弱極性的正己烷/乙醚溶劑系統對胞內脂肪體中的甘油酯等中性油脂進行提取。相比機械破壁，該雙溶劑提取系統可大大提高細胞壁的破碎效率。另外，正己烷/乙醚及甲醇等溶劑和具有神經系統劇毒性的氯仿相比，大大改善了提取方法的安全性和可操作性。提取油脂過程無酸敗、脂質氧化發生，提取獲得的總脂能較好地維持其在生物材料中原始組分和結構，可為後續的脂肪組學及脂肪酸組分的解析提供高品質油脂材料。
[0048]快捷高效的提取方法可實現對總脂含量的快速測定，結合氣相色譜法對甲酯化的總脂進行測定，可達到快速篩選單細胞生物體中總脂含量和脂肪酸組成信息的目的。
[0049]綜上所述，採用本發明的提取方法分析生物質材料總脂含量和脂肪酸組成，相比於已有傳統的方法，細胞的破壁率和浸提率更高(可達99%以上)，提取條件更簡單溫和，使用溶劑毒性低、對環境更友好，是目前成本較低，提取效率較高並最為準確的方法。採用本發明的總脂和脂肪酸的檢測方法，操作更簡單高效，可實現對單細胞厚壁微藻或微生物總脂和高值多不飽和脂肪酸的快速篩選。該方法對總脂和脂肪酸組分分析的重現性好，可靠性高。
【具體實施方式】
[0050]下面結合實施例對本發明做進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。
[0051]實施例1裂殖弧菌菌粉總脂與脂肪酸組成分析
[0052](I)油脂提取
[0053]I)準確稱量冷凍乾燥後的裂殖弧菌菌粉(總脂含量為77.01%) 150.0mg,加3mL混合溶劑甲醇/DMSO (V:V=9:1)，5(TC水浴加熱30分鐘破壁，5000r/min離心5分鐘，取上層油相，重複操作3次，收集上層油相。
[0054]2)向下層菌渣中加3mL混合溶劑正己烷/乙醚(v: V=1:1)，60°C水浴加熱30分鐘，萃取油脂，5000r/min離心5分鐘，取上層油相，重複操作3次，收集上層油相。
[0055]3)合併兩次收集的油相，加入3mL純化水，水洗，2000r/min離心5分鐘，收集上層油相。
[0056]4)向下層水相中加3mL正己烷萃取，2000r/min離心5分鐘，取上層油相，重複操作3次，收集上層油相。
[0057]5)將上述油相收集合併於離心管中，採用氮氣吹乾的方法去除有機溶劑，並冷凍乾燥20h除去油脂中的痕量水和有機溶劑殘留，稱量並代入公式:
【權利要求】
1.一種生物質材料油脂的提取方法及其應用，其特徵在於包含如下步驟:將生物質材料加入到甲醇和DMSO的混合溶劑中水浴加熱破壁，離心收集上層油相；往離心的沉澱中加入親脂性的有機溶劑水浴加熱萃取油脂，離心收集上層油相。
2.根據權利要求1所述的生物質材料油脂的提取方法，其特徵在於:所述的生物質材料包括產油單細胞生物、產油動植物細胞、組織和器官。
3.根據權利要求1所述的生物質材料油脂的提取方法，其特徵在於:所述的甲醇和DMSO的混合溶劑中甲醇與DMSO的體積比為5~10:1 ;所述的親脂性的有機溶劑為正己烷與乙醚按體積比0.5~2:1組成的混合溶劑；所述的水浴加熱破壁的條件為45~60°C水浴加熱攪拌10~40分鐘；所述的水浴加熱萃取油脂的條件為45~60°C水浴加熱10~40分鐘。
4.權利要求1-3任一項所述的生物質材料油脂的提取方法在生物質材料總脂含量和脂肪酸組成分析中的應用。
5.一種生物質材料總脂含量的分析方法，其特徵在於包括如下步驟:(1)對待測定生物質材料進行冷凍乾燥處理；準確稱取一定量生物質材料；(2)加甲醇和DMSO的混合溶劑水浴加熱破壁，離心，收集上層油相；(3)收集離心的沉澱，加入親脂性的有機溶劑水浴加熱萃取油脂，離心收集上層油相；(4)合併上述收集的油相，水洗，離心，收集上層油相；(5)下層水相用有機溶劑萃取，離心，收集上層油相；(6)合併油相併進行濃縮處理，獲得總脂，計算總脂含量。
6.根據權利要求5所述的生物質材料總脂含量的分析方法，其特徵在於:步驟(5)中所述的有機溶劑為正己烷或石油醚；步驟(6)中所述的濃縮處理的方法為用氮氣吹乾、真空離心乾燥或其它小體積濃縮方法，並冷凍乾燥除去油脂中的痕量水。
7.根據權利要求5所述的生物質材料總脂含量的分析方法，其特徵在於包括如下步驟:(1)對待測定生物質材料進行冷凍乾燥處理；準確稱取冷凍乾燥後的生物質材料 100 ~200mg ；(2)加2~IOmL甲醇與DMSO以體積比5~10:1組成的混合溶劑45~60°C水浴加熱 10~40分鐘破壁，離心，收集上層油相；(3)重複步驟(2)，將離心的沉澱用甲醇與DMSO的混合溶劑水浴加熱破壁I~5次，收集上層油相；(4)收集離心的沉澱，加入2~IOmL正己烷與乙醚以體積比0.5~2:1組成的混合溶劑45~60°C水浴加熱10~40分鐘萃取油脂，離心收集上層油相；(5)重複步驟(4)，將離心的沉澱用正己烷與乙醚的混合溶劑水浴加熱萃取油脂I~5 次，收集上層油相；(6)合併上述收集的油相，水洗，離心，收集上層油相；(7)下層水相用正己烷或石油醚萃取，離心，收集上層油相；(8)重複步驟(7)1~3次，收集上層油相；(9)合併油相，用氮氣吹乾、真空離心乾燥或其它小體積濃縮方法進行油脂濃縮處理，再用冷凍乾燥的方法除去油脂中的痕量水，獲得總脂，計算總脂含量。
8.—種生物質材料總脂脂肪酸組成的分析方法，其特徵在於包含如下步驟: (1)使用權利要求5-7任一項所述的方法獲得總脂後，用有機溶劑配製一定濃度的總脂溶液； (2)將總脂溶液用氮氣吹乾後進行甲酯化，萃取甲酯化生成的脂肪酸甲酯； (3)氣相檢測分析脂肪酸甲酯組成及含量。
9.根據權利要求8所述的生物質材料總脂脂肪酸組成的分析方法，其特徵在於: 步驟(1)中所述的有機溶劑為正己烷或石油醚，所述的總脂溶液的濃度為10~30mg/mL ； 步驟(2)為:取50~IOOii L濃度為10~30mg/mL總脂溶液，氮氣吹乾後，加0.5~2mL濃度為0.1~Imol/mL的KOH-甲醇溶液，40~70°C水浴反應10~40min ;待冷卻到室溫，加0.5~2mL濃度為14%的BF3-甲醇溶液，45~65°C水浴反應5~20min ;待冷卻到室溫，加0.5~2mL飽和食鹽水和0.5~2mL正己燒或石油醚萃取脂肪酸甲酯。
10.根據權利要求8所述的生物質材料總脂脂肪酸組成的分析方法，其特徵在於: 步驟(3)中所述的氣相檢測的方法為:色譜柱:毛細管柱HP-88或類似固定相的毛細管氣相色譜柱；載氣:高純度N2 ;柱流速:1.5mL/min ;尾吹流速:25mL/min ；H2流速:30mL/min ;空氣流速:400mL/min ;分流比:20:1 ;汽化室溫度:240°C ；，檢測器溫度:240°C ;色譜柱梯度升溫:初始溫度為100°C，保持5min，以4°C /min升至240°C，保持lOmin。
【文檔編號】G01N1/28GK103604891SQ201310638357
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月27日 優先權日:2013年11月27日
【發明者】陳偉, 曹騰騰, 李康, 劉永梅, 李西清, 王志臻, 潘倩倩 申請人:青島旭能生物工程有限責任公司