急性腎損傷及預後推測用生物標記物以及其用途的製作方法

2023-05-13 05:59:31

專利名稱：急性腎損傷及預後推測用生物標記物以及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及對於急性腎損傷的檢查、與腎功能相關的預後推測及急性腎損傷的鑑 別有用的新型生物標記物以及該標記物的用途。
背景技術：
急性腎損傷(Acute kidney injury，以下也稱為「AKI」)的診斷以尿量、血清肌酐 (Cr)值、血清尿素氮、尿中NAG、β 2-微球蛋白值等作為指標，但是任何一個指標都沒有可 以敏銳地診斷急性期的病理狀態的程度的診斷靈敏度，實際情況是根據檢查結果、臨床表 現綜合地進行診斷。因此，現狀是到開始有效的治療時花費的時間過多，治療成效不佳。儘管診斷、治療快速進步，但是重症監護病房(ICU)內的重症急性腎衰竭患者的 死亡率在過去50年間沒有大的進步，為50%左右，仍然是必須克服的課題。呈現AKI的疾 病多為開心術/主動脈置換術後、敗血症、器官移植後等術後需要ICU介護的疾病，發病後 需要在小時單位內掌握病理狀態，現狀是如果不進行AKI的早期診斷、早期治療介入則生 命預後無法改善。為了應對上述情況，近年來特別強調如下的必要性將腎功能迅速下降的 病理狀態作為AKI來掌握，對AKI進行分級從更早期開始診斷並進行治療介入。目前，AKI的診斷通常以血清Cr的升高為指標來進行。但是，實際上腎損傷發生後 到血清Cr升高需要2 3天，因此在AKI診斷時多數已經錯過了治療介入的時機。因此， 血清Cr作為AKI的診斷標記物是不充分的，確立早期生物標記物是當務之急。迄今為止，為治療AKI進行了抗凋亡/抗壞死劑、抗炎劑、抗敗血症劑、各種生長因 子、血管擴張劑等新型治療藥的臨床試驗，但沒有得到好的結果。作為其理由，在複雜的患 者背景和富於多樣性的AKI病因的同時，可以列舉由於缺乏診斷AKI的適當的早期生物標 記物而無法早期介入的理由。近來，作為AKI的新型尿中生物標記物，報導了中性粒細胞明膠酶相關脂質 S iii S & (NGAL neutrophil gelatinase-associatedl ipocaline> φ 專禾[!文 1)、 白介素 18(IL-18 Interleukin 18、非專利文獻 2)、腎損傷分子-1 (KIM-1 :kidney injury molecule-1、非專利文獻3)、肝型脂肪酸結合蛋白(L-FABP :liver type fatty acid-binding protein、非專利文獻4、5)等的有用性(非專利文獻6)。非專利文獻1 =Mishra J, et al.，Lancet. 2005Apr 2-8 ；365 (9466) 1231-8非專利文獻2:Prikh CR et al. , Kidney Int. 2006Jul ；70 (1) 199-203. Epub 2006May 17非專利文獻3 :Han WK et al. , Kidney Int. 2002Jul ；62(1) :237_44非專利文獻4 Nakamura Τ. et al. ,American journal of Kidney Diseases,Vol 47，No 3(March)，2006 :pp439_444非專利文獻 5 =Yamamoto Τ. et al.，J Am Soc Nephrol 18 =2894-2902, 2007非專利文獻 6 =Coca SG. et al.，Kidney Intl9 :Dec Review, 200
發明內容
在以上的背景下，本發明的課題在於提供用於早期掌握AKI的發病可能性的生物 標記物。另外，本發明的課題還在於提供AKI的檢查方法等該生物標記物的用途。另外，本 發明的課題還在於提供用於掌握與腎功能相關的預後的有用的生物標記物及其用途。此 外，本發明的課題還在於提供對於AKI的鑑別診斷有效的生物標記物。另外，本發明的課題 還在於提供AKI的鑑別方法等該生物標記物的用途。鑑於上述課題，本發明人著眼於中期因子(Midkine)(也稱為「MK」)，研究其作為 生物標記物的可能性。首先，考察了各種腎疾病中的尿中MK濃度，結果，在作為狹義AKI的 急性腎小管壞死(ATN)的患者中觀察到尿中中期因子濃度的升高。另一方面，研究了腹主 動脈瘤術後的AKI與尿中MK濃度的相關性，結果，術中尿中MK濃度升高的病例在術後表現 出AKI。即，得到在引起、發生AKI的患者中，尿中MK濃度在極早的階段就升高的令人驚訝 的發現。由此表明，從術中這樣的極早期的階段預測AKI的發病是可能的。另外，考察了腎 移植後的移植腎的腎功能與尿中MK濃度的關係、造影劑導致的腎損傷與尿中MK濃度的關 系、腎部分切除施行例與尿中MK濃度的關係、以及微小病變腎病的尿中MK濃度，結果顯示， 尿中MK濃度作為早期預測AKI發病的指標是極為有效的。其它AKI病例也顯示同樣的結 果。這樣，本發明人深入研究的結果表明，為了掌握AKI的發病可能性，尿中MK成為有用的 指標(生物標記物)。另一方面，從研究腎部分切除術施行例與尿中MK濃度的關係的實驗結果判斷出， 尿中MK濃度作為預後推測的指標是有效的。另外，研究了化學療法後、因腎病症候群而進 展的急性腎損傷與尿中MK濃度的關係，結果表明，不僅限於腎部分切除術，尿中MK濃度在 廣泛的病例中作為推測預後的指標均是有效的。另一方面，在得到急性腎小管壞死(ATN)的組織學診斷的患者中，尿中MK濃度顯 著高0而且，受i式者工作特t生曲線(receiver operating characteristic curve 曲線) 分析的結果是，顯示出極高的靈敏度及特異度。另外，進行了與現有生物標記物β_Ν-乙 醯-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)、尿中中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(NGAL)、尿中白 介素18(IL-18)的比較研究，結果表明，與這些現有生物標記物相比，尿中MK的AUC(area under the curve =ROC曲線下的面積)顯著高，作為AKI鑑別用的生物標記物尿中MK是最 優良的。如上所述，本發明人的深入研究的結果是，得到了作為AKI鑑別用的生物標記物尿 中MK極為優良的見解。本發明中，主要提供基於以上見解而完成的如下發明。[1] 一種急性腎損傷早期檢測用生物標記物，其由中期因子構成。[2] 一種急性腎損傷的檢查方法，其以尿中中期因子量作為指標。[3]如[2]所述的檢查方法，其中，包含以下步驟⑴和(2)(1)檢測尿中中期因子的步驟；(2)基於檢測結果判斷急性腎損傷的發病可能性的步驟。[4]如[2]或[3]所述的檢查方法，其中，急性腎損傷為急性腎小管壞死。[5]如[2]或[3]所述的檢查方法，其中，急性腎損傷為缺血性急性腎損傷、中毒性 急性腎損傷或敗血症性急性腎損傷。[6]如[5]所述的檢查方法，其中，缺血性急性腎損傷為術後的缺血性急性腎損傷。[7]如[6]所述的檢查方法，其中，使用從引起缺血狀態的手術實施時至術後1天 之間採集的尿液來實施步驟(1)。[8]如[6]所述的檢查方法，其中，使用從引起缺血狀態的手術實施開始3小時以 內採集的尿液來實施步驟(1)。[9]如[6] [8]中任一項所述的檢查方法，其中，手術為大血管手術、使用人工心 肺裝置的開心術、器官移植術或腎腫瘤部分腎切除術。[10]如[3] [9]中任一項所述的檢查方法，其中，除步驟(1)以外還實施以下的 步驟(1』)，在步驟(2)中基於步驟(1)和步驟(1』 )的檢測結果判斷急性腎損傷的發病可 能性(1』 )檢測選自尿中中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(NGAL)、尿中白介素 18(IL-18)、尿中腎損傷分子-1(ΚΙΜ-1)、β-Ν-乙醯_D_氨基葡萄糖苷酶(NAG)及尿中肝型 脂肪酸結合蛋白(L-FABP)中的一種以上的生物標記物的步驟。[11]如[3]所述的檢查方法，其中，在步驟⑴中，以微小病變腎病的患者的尿液 作為樣品檢測尿中中期因子。[12] 一種急性腎損傷檢查用試劑，其由抗中期因子抗體構成。[13] 一種急性腎損傷檢查用試劑盒，其中，包含[12]所述的試劑。[14] 一種與腎功能相關的預後推測用生物標記物，其由中期因子構成。[15] 一種與腎功能相關的預後推測方法，其以尿中中期因子量作為指標。[16]如[15]所述的預後推測方法，其為推測缺血性急性腎損傷、中毒性急性腎損 傷或敗血症性急性腎損傷的預後的方法。[17]如[15]所述的預後推測方法，其中，在腎移植後或腎部分切除術後檢測尿中 中期因子，根據以下的基準推測預後如果從術後6小時至48小時之間觀察到的尿中中期因子量的升高為一過性則預 後良好，如果從術後6小時至48小時之間觀察到的尿中中期因子量的升高並非一過性而是 高值遷延或持續則預後不良。[18]如[17]所述的預後推測方法，其中，以來自病側腎的尿液和/或來自健側腎 的尿液作為樣品檢測尿中中期因子。[19] 一種與腎功能相關的預後推測用試劑，其由抗中期因子抗體構成。[20] 一種與腎功能相關的預後推測用試劑盒，包含[19]所述的試劑。[21] 一種急性腎損傷鑑別用生物標記物，其由中期因子構成。[22] 一種急性腎損傷的鑑別方法，其以尿中中期因子量作為指標。[23]如[22]所述的鑑別方法，其中，包含以下的步驟(1)和(2)(1)檢測尿中中期因子的步驟；(2)基於檢測結果判斷急性腎損傷的原因是否是由於急性腎小管損傷引起的步
馬聚ο[24]如[22]或[23]所述的鑑別方法，其中，急性腎損傷為急性腎小管壞死。[25]如[22]或[23]所述的鑑別方法，其中，急性腎損傷為缺血性急性腎損傷。[26]如[25]所述的鑑別方法，其中，缺血性急性腎損傷為術後的缺血性急性腎損傷。[27]如[23] [26]中任一項所述的鑑別方法，其中，除步驟(1)以外還實施以下 的步驟(1』)，在步驟(2)中基於步驟(1)和步驟(1』 )的檢測結果判斷急性腎損傷的原因 是否是由於急性腎小管損傷引起的(1』 )檢測選自尿中中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(NGAL)、尿中白介素 18(IL-18)、尿中腎損傷分子-1(ΚΙΜ-1)、β-Ν-乙醯_D_氨基葡萄糖苷酶(NAG)及尿中肝型 脂肪酸結合蛋白(L-FABP)中的一種以上的生物標記物的步驟。[28] 一種急性腎損傷鑑別用試劑，其由抗中期因子抗體構成。[29] 一種急性腎損傷鑑別用試劑盒，包含[28]所述的試劑。


圖1為各腎疾病患者的尿中MK濃度。橫軸從左側開始依次為急性腎小球腎 炎(AGN)患者(5 人)、ANCA 相關腎小球腎炎(anti-neutrophil cytoplasmic antibody related GN)患者(41人)、急性腎小管壞死(ATN)患者(33人)、局灶性節段性腎小球硬化 症(FSGS)患者(29人)、紫癜性腎炎(HSPN)患者(10人)、IgA腎病(IgAN)患者(124人)、 微小病變腎病症候群(MCNS)患者(50人)、膜增生性腎小球腎炎(MPGN)患者(9人)、血栓 性微血管病(TMA)患者(8人)、異常蛋白血症(paraproteinemia)相關腎病患者(15人)、 狼瘡性腎炎(Lupus GN)患者(42人)、腎硬化症(nephrosclerosis)患者(15人)、常染色 體顯性多囊腎病(ADPKD)患者(8人)、糖尿病性腎病(Diabetic N)患者(35人)、腎小管 間質性腎炎(TIN)患者(15人)、膜性腎病(Membranous GN)患者(74人)、其它腎炎(多 種混雜)患者(37人)、正常志願者(對照)(33人)。縱軸為尿中MK濃度(pg/ml)。IH 2MKROC (receiver-operating chafacteristic curve, 工作特性曲線)曲線分析的結果。橫軸為(1-特異度)、縱軸為靈敏度。ROC曲線的下側的面 積設定為0. 965、截止值設定為70pg/ml時的診斷靈敏度及特異度分別為97.0%及90.3%。圖3是尿中MK及現有的尿中生物標記物(NAG、NGAL、IL-18)的比較。將全部583 個病例分為ATN(急性腎小管壞死)、對照(正常人)、其它腎疾病三組，用盒須圖表示各尿 中生物標記物的濃度。圖4是各種尿中生物標記物的ROC曲線的比較。使用各原中生物標記物的實測值 (未進行尿中Cr濃度校正)，進行ATN組與其它組(其中，除外正常人)的鑑別。AUC在尿 中MK的情況下得到最高的值。圖5是各種尿中生物標記物的ROC曲線的比較。使用尿中Cr濃度校正後的值，進 行ATN組與其它組(其中，除外正常人)的鑑別。與使用實測值時同樣，AUC在尿中MK的 情況下最高。圖6是各種尿中生物標記物的AUC的比較。將尿中MK的AUC與現有的尿中生物標 記物的AUC進行比較。上半部是實測值的比較，下半部是尿中Cr濃度校正後的值的比較。 在實測值、尿中Cr校正後的值的任何一種情況下，均證明尿中MK比其它生物標記物優良。 另外，SE為標準誤。圖7是多種生物標記物組合時的靈敏度及特異度的比較。以符號「 + 」表示的組合， 在該組合中所含的所有生物標記物均為陽性(截止值以上)時判斷為陽性。以符號「/」表示的組合，在該組合中所含的生物標記物有一個為陽性(截止值以上)時即可判斷為陽性。圖8是接受腹主動脈瘤置換術的患者的背景。圖9是接受腹主動脈瘤置換術的患者的術前檢查所見。圖10是腹主動脈瘤置換術的經過與尿中MK濃度的測定時期。隨時間推移進行採 尿(箭頭所示的各時刻)，通過ELISA測定尿中MK濃度。圖11是尿中MK濃度(U-MK)和尿中肌酐(Cr)量的變動(Δ Cr)。· =AKI組的尿 中MK濃度、〇非AKI組的尿中MK濃度。
:ΑΚΙ組的尿中Cr的變動量(％)、 非AKI 組的尿中Cr的變動量(％)。圖12是尿中β 2微球蛋白濃度的變動。根據尿中β 2微球蛋白，無法在手術中預 測術後發病的急性腎損傷(AKI)。圖13是尿中NAG濃度的變動。根據尿中NAG，無法在手術中預測術後發病的急性 腎損傷(AKI)。圖14是尿中半胱氨酸蛋白酶抑制劑C濃度的變動。根據尿中半胱氨酸蛋白酶抑 製劑C，無法在手術中預測術後發病的急性腎損傷(AKI)。圖15是各種生物標記物的濃度的變動。將尿中MK(U-MK)與已知的生物標記物的 濃度的變動進行比較。尿中MK濃度(U-MK)與尿中IL-18濃度(U-IL18)及尿中NGAL濃度 (U-NGAL)相比，在特別早的時期升高。圖16是表示實施使用人工心肺的心臟瓣膜置換術的病例的尿中中期因子(MK)濃 度的推移的表。圖17是實驗(腎移植後的移植腎的腎功能與尿中中期因子(MK)濃度的關係)的 規程。圖18是表示腎移植後的血清肌酐濃度與尿中中期因子(MK)濃度的測定結果的 表。上半部的表中表示血清肌酐量的推移與初尿中的MK濃度。下半部的表中表示移植術後 的尿中MK濃度的推移。PGF:prompt graft function，原發性移植腎無功能；DGF :delayed graft function，移植腎功能延遲恢復。圖19是實驗規程(造影劑造成的腎損傷與尿中中期因子(MK)濃度的關係)的概要。圖20是實驗規程(對淺表性早期腎癌實施腎部分切除術的病例與尿中中期因子 (MK)濃度的關係)的概要。圖21是實驗規程(對淺表性早期腎癌實施腎部分切除術的病例與尿中中期因子 (MK)濃度的關係)的概要。圖22是表示非AKI患者的來自病側腎的尿(腎盂尿)的MK濃度變化(左)與膀 胱尿的MK濃度變化(右)的圖表。圖23是表示AKI患者的來自病側腎的尿(腎盂尿)的MK濃度變化(左)與膀胱 尿的MK濃度變化(右)的圖表。圖24是表示AKI患者的來自病側腎的尿(腎盂尿)的MK濃度變化(左)與膀胱 尿的MK濃度變化(右)的圖表。圖25是表示重症病例的尿中MK濃度變化的表。圖26是表示用MTX進行化療後的腎損傷患者的尿中MK濃度變化的表。
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圖27是合併有急性腎小管壞死(ATN)的微小病變腎病症候群患者(MCNS)與未合 並ATN的微小病變腎病症候群患者(MCNS)的尿中MK濃度的比較。圖28是表示尿中MK濃度與血漿中MK濃度的關係的圖表。對ATN組和其它腎疾病 組515例測定尿中MK濃度和血漿中MK濃度，進行作圖。皮爾遜積差相關係數為0. 23 (95% 可信區間為0. 15 0. 31、ρ < 0. 001)。圖29是表示尿中MK濃度與血漿中MK濃度的關係的圖表。測定接受腹主動脈瘤 置換術的患者的尿中MK濃度和血漿中MK濃度，進行作圖。圖30是MK親和層析的原理(左)和結果(右)。用X表示推測為MK結合蛋白的 條帶。X'推測為X的片段。圖31是對合併有腎澱粉樣變性的慢性風溼性關節炎患者給與肝素時的尿中MK濃 度與血漿中MK濃度的比較。通過給與肝素血漿中MK濃度升高，但結果尿中MK濃度並不升
尚ο圖32是表示血漿中MK濃度為高值與尿中MK濃度無關的病例提示。在病例1 (對 照)和呈現不同選擇性的腎病症候群的病例2-5中，雖然血漿中MK濃度為高值，但尿中MK 濃度為測定靈敏度以下。相反在病例6-9的ATN的情況下，無論血漿中MK濃度如何，尿中 MK濃度均高。
具體實施例方式1.急性腎損傷(AKI)的早期檢測本發明的第一方面涉及急性腎損傷的早期檢測。在該方面中，提供急性腎損傷早 期檢測用的生物標記物及其用途。1-1.急性腎損傷早期檢測用的生物標記物本說明書中，「急性腎損傷(以下也稱為「AKI」)早期檢測用的生物標記物」是指作 為AKI的發病可能性的指標的生物分子。「AKI」是腎功能快速下降的病理狀態的總稱。因 此，"AKI，，中包括腎前性腎損傷、腎性腎損傷(急性腎小管壞死(ATN)、腎小管間質性腎炎、 腎小球腎炎等)及腎後性腎損傷。對於腎小球疾病或尿路感染症，如果不引起繼發性急性 腎小管損傷則不包括在「AKI」中。因此，在引起繼發性急性腎小管損傷的情況下，腎小球疾 病和尿路感染症也是本發明的應用對象。狹義的AKI是指腎前性腎損傷、即一次性引起急性腎小管損傷的病理狀態的ATN。 本發明對於狹義的AKI的早期檢測特別有用。ATN中包括缺血性AKI、中毒性AKI或敗血症 性AKI。作為缺血性AKI的例子，可以列舉腹主動脈瘤置換術等大血管手術、心臟瓣膜置換 術等使用人工心肺裝置的開心術、器官移植術或腎腫瘤部分腎切除術等的術後發生的AKI ； 伴隨充血性心力衰竭、造影劑給與(例如以心絞痛、心肌梗死等為對象進行的造影劑檢查 時)、肝腎症候群或血栓性微血管損傷而發生的AKI ；由鈣調磷酸酶抑制劑、血管緊張素轉 換酶抑制劑、血管緊張素II受體拮抗劑、非留體類消炎鎮痛劑等藥劑引起的AKI，但不限於 這些。另一方面，作為中毒性AKI的例子，包括由作為外源性因子的抗菌藥、抗癌劑等藥劑、 作為內源性因子的血紅素色素(血紅蛋白尿、肌紅蛋白尿)、多發性骨髓瘤等的異常蛋白、 尿酸、甲氨蝶呤等結晶成分等引起的AKI。本發明的生物標記物由中期因子(MK)構成。MK是作為維甲酸應答基因的產物被發現的增殖分化因子，由富含鹼性胺基酸和半胱氨酸的分子量13kDa的多肽構成 (Kadomatsu, K. et al. :Biochem. Biophys. Res. Commun. , 151 1312-1318 ；Tomomura, Μ. et al. J. Biol. Chem.，265 :10765_10770，1990)。MK具有細胞增殖、細胞趨化、血管新生、炎症 誘導、纖維素溶解等多方面的活性。另外，血清MK水平有望作為腫瘤標記物(Ikematsu.S et al.，Br. J. Cancer. 2000 ；83 701-706.)。公共資料庫中收錄的MK的胺基酸序列(GenBank，ACCESSION :NP_001012333, DEFINITION :midkine[Homo sapiens]) (GenBank，收錄號NP_001012333，定義中期因子 [人類])如序列表的序列編號1所示。另外，作為本發明的生物標記物利用的MK不是生物 體中存在的MK，而是從生物體採集的(即分離出的)樣品中的MK。1-2.急性腎損傷(AKI)的檢查方法作為本發明的生物標記物的用途之一，本發明還提供AKI的檢查方法。本發明的 檢查方法用於AKI的發病可能性的判斷(發病的早期預測)。優選用於狹義的AKI、即急性 腎小管壞死(ATN)的發病可能性的判斷。本發明的檢查方法對於缺血性AKI、中毒性AKI及 敗血症性AKI的發病可能性的判斷有用。本發明的檢查方法可以在入院時或進入重症監護病房(I⑶)時實施。為判斷微小 病變腎病(minimal change)是否進展為AKI也可以實施本發明的檢查方法。另外，已知作 為腎病症候群的頻率最高的原因的「微小病變腎病(minimal change) 」的一至兩成會呈現 少尿型急性腎衰竭。本發明的檢查方法中使用尿中MK量作為判斷指標。具體而言，本發明的檢查方法 中實施下述步驟(1)和(2)。(1)檢測尿中MK的步驟；(2)基於檢測結果判斷AKI的發病可能性的步驟。步驟(1)在步驟(1)中，準備從被檢者採集的尿樣，檢測其中存在的MK(尿中MK)。本說明 書中，「檢測尿中MK」與測定尿中MK量為相同含義。無需嚴格的定量，可以半定量地測定尿 中MK量。例如，以能夠判斷尿中MK量是否超過規定的基準量的方式進行檢測。尿中MK的檢測方法沒有特別限制，優選利用免疫學的方法。根據免疫學的方法， 可以快速且靈敏度良好地測定尿中MK濃度。另外，操作也簡便。在利用免疫學方法進行的 尿中MK濃度的測定中，使用與MK具有特異的結合性的物質。作為該物質通常使用抗MK抗 體，但是只要是與MK具有特異的結合性且可以測定其結合量的物質，則不限於抗MK抗體均 可使用。作為測定方法，可以例示膠乳凝集法、螢光免疫測定法(FIA法)、酶免疫測定法 (EIA法)、放射免疫測定法(RIA法)、免疫印跡法。作為優選的測定方法，可以列舉FIA法 及EIA法(包含ELISA法)。利用這些方法，可以高靈敏度、快速且簡便地進行檢測。FIA 法中，使用螢光標記的抗體，以螢光為信號檢測抗原抗體複合物(免疫複合物)。另一方面， EIA法中，使用酶標記的抗體，以酶反應引起的顯色或發光為信號檢測免疫複合物。關於MK的測定，開發了優良的EIA法(參照日本特開平10-160735號公報)及 ELISA法(S. Ikematsu，et al. Br. J. Cancer 2000 ；83)，可以該方法或以該方法為基準的方 法進行測定。對本領域技術人員而言，根據檢測目的對條件或程序的一部分進行改良是很容易的。ELISA法具有檢測靈敏度高且特異度高、定量性優良、操作簡便、適合同時處理多 樣品等許多優點。利用ELISA法時的具體操作方法的一例如下所述。首先，將抗MK抗體固 定化於不溶性支撐體上。具體而言，例如將微孔板的表面用抗MK抗體致敏(包被)。使尿 樣與這樣固相化的抗體接觸。該操作的結果是，如果尿樣中存在針對固相化的抗MK抗體的 抗原(MK)則會形成免疫複合物。通過洗淨操作除去非特異的結合成分後，添加結合有酶的 抗體由此對免疫複合物進行標記，然後與酶的底物反應使其顯色。然後，以顯色量為指標檢 測免疫複合物。另外，關於ELISA法的詳細說明在很多書籍和論文中均有記載，設定各方法 的實驗程序和實驗條件時可以參考這些書籍和論文。另外，不限於非競爭法，也可以使用競 爭法(與樣品一起添加抗原使其進行競爭的方法)。可以採用用標記化抗體直接檢測樣品中的MK的方法，或者也可以採用夾心法。夾 心法中，使用表位不同的兩種抗體(捕獲用抗體及檢測用抗體)。採集尿樣的時期(時機)沒有特別限制，鑑於發生AKI的患者在術後的極早的階 段尿中MK量就升高的事實，在對腹主動脈瘤置換術、心臟瓣膜置換術、器官移植術或腎腫 瘤部分腎切除術等的術後可能發生的缺血性AKI的發病可能性進行判斷時，優選使用從引 起缺血狀態的手術實施時至術後1天之間採集的尿液作為樣品實施步驟(1)，進一步優選 使用從引起缺血狀態的手術實施時至手術結束時之間採集的尿液作為樣品實施步驟(1)， 最優選使用從引起缺血狀態的手術實施開始3小時以內(術中、術後均可)採集的尿液實 施步驟(1)。通過像這樣使用在較早的階段採集的尿樣，可以早期預測AKI的發病。此處 的「引起缺血狀態的手術實施」相當於血管的夾閉或人工心肺操作等。列舉具體例，在腹主 動脈瘤手術的情況下，主動脈阻斷相當於「引起缺血狀態的手術實施」。另外，「手術結束時」 是指進行縫合、關腹的時期。判斷以心絞痛或心肌梗死等為對象的造影劑檢查後的AKI的發病可能性時，例如 以造影劑檢查後4小時以內(以造影劑注入時為基準(0時))、優選造影劑檢查後2小時以 內採集的尿液作為樣品。另外，判斷藥劑給與後發生的AKI的發病可能性時，例如以藥劑給 與後4小時以內、優選藥劑給與後2小時以內採集的尿液作為樣品。以腎損傷的患者(例 如微小病變腎病的患者)為對象時，例如以門診就診時、入院時、腎活檢時等採集的尿液作 為樣品。在本發明的一個方式中，不僅檢測了尿中MK，還檢測了作為AKI的指標的其它生 物標記物，將兩者的檢測結果用於AKI的發病可能性的判斷。即，在該方式中除步驟(1)以 外還實施以下的步驟(1』)，在步驟(2)中基於步驟(1)和步驟(1』 )的檢測結果判斷AKI 的發病可能性。(1，)檢測選自尿中NGAL、尿中IL-18、尿中KIM_1、NAG及尿中L-FABP中的一種以 上的生物標記物的步驟。根據該方式，由於基於兩種以上不同的指標進行判斷，因此可以得到命中率和/ 或可靠性更高的檢查結果。各生物標記物(包括MK)的變動有各自固有的特性，通過將多 種生物標記物組合，可以提高判斷AKI的發病可能性的命中率和可靠性。另外，還可以得到 對於預後推測、急性腎小管壞死(ATN)與腎炎、腎病的鑑別等有益的信息。從提高命中率和/或可靠性的觀點考慮，原則上步驟(1』)中的檢測對象的生物標 記物的數量越多越好。因此，優選步驟(1』)中以兩種以上的生物標記物作為檢測對象(例如，NGAL及IL-18這兩種)。步驟(1』 )中的各生物標記物的測定方法沒有特別限制。例如，可以與MK的測定 時同樣，採用免疫學的測定方法。各生物標記物的測定根據標準的方法或已報導的方法進 行即可。例如，非專利文獻1中有NGAL的測定方法(免疫印跡法及ELISA法)的說明。非 專利文獻2中有NGAL的測定方法(ELISA法)及IL-18的測定方法(ELISA法)的說明。非 專利文獻3中有KIM-I的測定方法(免疫印跡法及ELISA法)的說明。非專利文獻4、5中 有L-FABP的測定方法(ELISA法)的說明。測定這些生物標記物時的尿樣的採集時期(時機)沒有特別限制。可以考慮過去 的報導或根據預實驗的結果適當設定尿樣的採集時期。步驟(2)在步驟⑵中，基於步驟⑴的檢測結果(還實施步驟(1』 )時基於步驟⑴及 (1』)的檢測結果)，判斷AKI的發病可能性。發病可能性的判斷可以是定性或定量的任何 一種。定性判斷和定量判斷的例子如下所述。另外，此處的判斷根據其判斷基準是顯而易見 的，即使不通過醫師或檢查技師等具有專業知識的人的判斷也可以自動地/機械地進行。(定性判斷的例1)測定值(MK量)高於基準值時判斷為「發病可能性高」，測定值低於基準值時判斷 為「發病可能性低」。(定性判斷的例2)確認到反應性(陽性)時判斷為「發病可能性高」，未確認到反應性(陰性)時判 斷為「發病可能性低」。(定量判斷的例子)如下所述地按照每個測定值的範圍預先設定發病可能性(％ )，從測定值判斷發 病可能性(％ )。測定值a b 發病可能性為10%以下測定值b c 發病可能性為10% 30%測定值c d 發病可能性為30% 50%測定值d e 發病可能性為50% 70%測定值e f 發病可能性為70% 90%下面給出除MK以外還利用其它生物標記物(從選自尿中NGAL、尿中IL-18、尿中 KIM-1、尿中NAG及尿中L-FABP中的一種以上生物標記物組成的組中選擇的一種以上的生 物標記物)時的判斷方法的一例，首先，基於MK的檢測結果判斷發病可能性，如果得到發病 可能性高的判斷結果則追加實施其它生物標記物的檢測，然後基於其它生物標記物的檢測 結果做出發病可能性的最終判斷。該例中，採用利用MK的檢測結果作為一次判斷、利用其 它生物標記物的檢測結果作為最終判斷的判斷方法。與此相反，也可以利用其它生物標記 物的檢測結果作為一次判斷，利用MK的檢測結果作為最終判斷。1-3.急性腎損傷(AKI)檢查用試劑及試劑盒本發明還提供AKI檢查用試劑及試劑盒。本發明的試劑由抗MK抗體構成。抗MK 抗體只要對MK具有特異的結合性，則其種類或來源等沒有特別限制。另外，可以是多克隆 抗體、寡克隆抗體(數種 數十種抗體的混合物)及單克隆抗體的任何一種。作為多克隆
12抗體或寡克隆抗體，除了動物免疫得到的抗血清來源的IgG組分以外，可以使用利用抗原 親和純化的抗體。抗MK抗體可以是Fab、Fab' F(ab' ) 2、scFv、dsFv抗體等抗體片段。抗MK抗體可以利用免疫學方法、噬菌體展示法、核糖體展示法等來製備。禾Ij用免 疫學方法的多克隆抗體的製備可以按照如下程序進行。製備抗原(MK或其一部分)，使用其 對兔等動物實施免疫。通過對生物樣品進行純化可以得到抗原。另外，也可以使用重組型 抗原。重組型MK例如可以通過使用載體將編碼MK的基因(也可以是基因的一部分)導入 適當的宿主，並在得到的重組細胞內進行表達來製備。為了增強免疫誘導作用，可以使用結合有載體蛋白的抗原。作為載體蛋白，可以使 用 KLH(鑰孔槭血藍蛋白)、BSA (Bovine Serum Albumin，牛血清白蛋白)、OVA (Ovalbumin， 卵清蛋白)等。載體蛋白的結合可以使用碳二亞胺法、戊二醛法、重氮縮合法、MBS(3-馬 來醯亞胺基苯甲酸琥珀醯亞胺酯)法等。另一方面，也可以使用使CD46(或其一部分)與 GST、i3半乳糖苷酶、麥芽糖結合蛋白或組氨酸(His)標籤等以融合蛋白形式表達而得到的 抗原。這樣的融合蛋白可以通過通用的方法簡便純化。根據需要反覆進行免疫，在抗體效價充分升高的時刻採血，通過離心處理等得到 血清。將所得的抗血清進行親和純化，得到多克隆抗體。另一方面，對於單克隆抗體可以按照如下程序製備。首先，通過與上述同樣的程序 實施免疫操作。根據需要反覆進行免疫，在抗體效價充分升高的時刻從免疫動物體內取出 抗體產生細胞。然後，將得到的抗體產生細胞與骨髓瘤細胞融合得到雜交瘤細胞。接著，將 該雜交瘤細胞單克隆化後，篩選產生對目的蛋白具有高特異性的抗體的克隆。將篩選出的 克隆的培養液進行純化，由此得到目的抗體。另一方面，也可以通過使雜交瘤細胞增殖到所 需數量以上後，將其移植到動物(例如小鼠)的腹腔內，在腹水內使其增殖並純化腹水來獲 得目的抗體。上述培養液的純化或腹水的純化優選使用利用蛋白G、蛋白A等的親和層析。 另外，也可以使用將抗原固相化的親和層析。另外，也可以使用離子交換層析、凝膠過濾層 析、硫酸銨分級沉澱及離心分離等方法。這些方法可以單獨或任意組合使用。在保持對MK的特異結合性的條件下，可以對所得的抗體進行各種改變。這樣的改 變後的抗體也可以作為本發明的試劑。如果使用標記化抗體作為抗MK抗體，則可以以標記量為指標直接檢測結合的抗 體量。因此，可以構建更簡便的檢查方法。其反面，是存在如下問題需要準備結合有標記 物質的抗MK抗體，此外，檢測靈敏度一般會降低。因此，優選使用利用結合有標記物質的二 次抗體的方法、利用二次抗體與標記物質結合而成的聚合物的方法等間接的檢測方法。此 處的二次抗體是指對抗MK抗體具有特異結合性的抗體，例如以兔抗體形式製備抗MK抗體 時可以使用抗兔IgG抗體。有可對兔、山羊、小鼠等的各種抗體使用的標記二次抗體市售 (例如Fimakoshi公司或COSMO BIO公司等)，可以根據本發明的試劑適當選擇適合的二次 抗體來使用。標記物的例子有過氧化物酶、微過氧化物酶、辣根過氧化物酶(HRP)、鹼性磷 酸酶、β -D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶等酶；異硫氰酸螢光素 (FITC)、四甲基羅丹明異硫氰酸酯(TRITC)及銪等螢光物質；魯米諾、異魯米諾及吖啶.錫鹽 衍生物等化學發光物質；NAD等輔酶；生物素以及131I及125I等放射性物質。在一個方式中，根據用途將本發明的試劑固相化。用於固相化的不溶性支撐體沒
13有特別限制。例如可以使用由聚苯乙烯樹脂、聚碳酸酯樹脂、矽樹脂、尼龍樹脂等樹脂或玻 璃等不溶於水的物質形成的不溶性支撐體。抗體在不溶性支撐體上的負載可以通過物理吸 附或化學吸附來進行。本發明的試劑盒包含本發明的試劑作為主要構成要素。試劑盒中也可以包含實施 檢查方法時使用的其它試劑(緩衝液、封閉用試劑、酶的底物、顯色試劑等)和/或裝置、 器具(容器、反應裝置、螢光酶標儀等)。另外，優選試劑盒中包含MK作為標準樣品。另 外，試劑盒中還可以包含用於檢測MK以外的生物標記物(選自尿中NGAL、尿中IL-18、尿中 KIM-1、尿中NAG及尿中L-FABP中的一種以上的生物標記物)的試劑、使用該試劑時所需的 其它試劑、器具等。另外，通常本發明的試劑盒附有操作說明書。2.與腎功能相關的預後推測本發明的第二方面涉及與腎功能相關的預後推測。在該方面中，提供與腎功能相 關的預後推測用的生物標記物及其用途。以下，說明該方面的詳細內容，對於與第一方面共 同的事項，引用在第一方面中的說明。2-1.與腎功能相關的預後推測用的生物標記物本說明書中，「與腎功能相關的預後推測用的生物標記物」是指作為與腎功能相關 的預後的推測指標的生物分子。「與腎功能相關的預後」是指腎功能的將來的狀態，包括承 受了可能引起腎功能損傷的事件的患者的將來的腎功能的狀態、和罹患了腎功能損傷的患 者的將來的腎功能的狀態。「可能引起腎功能損傷的事件」包含缺血性AKI、中毒性AKI及敗 血症性AKI的全部。作為缺血性AKI的例子，可以列舉腹主動脈瘤置換術等大血管手術、 心臟瓣膜置換術等使用人工心肺裝置的開心術、器官移植術或腎腫瘤部分腎切除術等的術 後發生的AKI ；伴隨充血性心力衰竭、造影劑給與(例如以心絞痛、心肌梗死等為對象進行 的造影劑檢查時)、肝腎症候群或血栓性微血管損傷而發生的AKI ；由鈣調磷酸酶抑制劑、 血管緊張素轉換酶抑制劑、血管緊張素I I受體拮抗劑、非留體類消炎鎮痛劑等藥劑引起的 AKI，但不限於這些。另一方面，作為中毒性AKI的例子，包括由作為外源性因子的抗菌藥、 抗癌劑等藥劑、作為內源性因子的血紅素色素(血紅蛋白尿、肌紅蛋白尿)、多發性骨髓瘤 等的異常蛋白、尿酸、甲氨蝶呤等結晶成分等引起的AKI。2-2.與腎功能相關的預後推測方法作為本發明的生物標記物的用途之一，本發明還提供與腎功能相關的預後推測方 法。本發明的預後推測方法中使用尿中MK量作為判斷指標，實施檢測尿中MK的步驟(步 驟(1))及基於檢測結果推測預後的步驟(步驟(2))。步驟(1)與第一方面的步驟(1)同 樣，因此省略其說明。另外，使用來自病側腎的尿液和/或來自健側腎的尿液作為樣品。在後續的步驟(2)中，以尿中MK量為指標進行預後的推測。例如，在推測腹主動 脈瘤置換術等大血管手術、心臟瓣膜置換術等使用人工心肺裝置的開心術、器官移植術或 腎腫瘤部分腎切除術等的術後的預後時，可以根據以下的基準推測預後。(判斷基準)如果從術後6小時至48小時之間觀察到的尿中中期因子量的升高為一過性則預 後良好，如果從術後6小時至48小時之間觀察到的尿中中期因子量的升高並非一過性而是 高值遷延或持續則預後不良。另外，本發明中的預後的推測，根據其判斷基準是顯而易見的，即使不通過醫師或
14檢查技師等具有專業知識的人的判斷也可以自動地/機械地進行。2-3.與腎功能相關的預後推測用試劑及試劑盒本發明還提供與腎功能相關的預後推測用的試劑及試劑盒。本發明的試劑由抗MK 抗體構成。關於抗MK抗體，與第一方面的試劑的情況同樣，因此省略其說明。本發明的試 劑盒包含本發明的試劑作為主要構成要素。試劑盒中也可以包含實施預後推測方法時使用 的其它試劑(緩衝液、封閉用試劑、酶的底物、顯色試劑等)和/或裝置、器具(容器、反應 裝置、螢光酶標儀等)。另外，優選試劑盒中包含MK作為標準樣品。另外，通常本發明的試 劑盒附有操作說明書。3.急性腎損傷(AKI)的鑑別診斷本發明的第三方面涉及AKI的鑑別診斷。在該方面中，提供急性腎損傷鑑別用的 生物標記物及其用途。以下，說明該方面的詳細內容，對於與第一方面共同的事項，引用在 第一方面中的說明。3-1.急性腎損傷腎鑑別用的生物標記物本說明書中，「急性腎損傷(AKI)鑑別用的生物標記物」是指作為AKI的鑑別(判 斷AKI的原因是否為以急性腎小管壞死(ATN)為代表的急性腎小管損傷而引起)指標的生 物分子。3-2.急性腎損傷(AKI)的鑑別方法作為本發明的生物標記物的用途之一，本發明還提供AKI的鑑別方法。根據本發 明的鑑別方法，可以判斷AKI的原因是否為以急性腎小管壞死(ATN)為代表的急性腎小管 損傷。典型地，關於AKI的原因，可以得到「是ATN」或「是ATN以外的腎損傷」的判斷結果。本發明的鑑別方法中使用尿中MK量作為判斷指標。具體而言，本發明的鑑別方法 中實施以下的步驟(1)和(2)。(1)檢測尿中MK的步驟；(2)基於檢測結果判斷急性腎損傷的原因是否是由於急性腎小管損傷引起的步
馬聚ο步驟⑴與第一方面的步驟⑴同樣因此省略其說明。在本發明的一個方式中，不僅檢測了尿中MK，還檢測了作為AKI的指標的其它生 物標記物，將兩者的檢測結果用於AKI的鑑別。即，在該方式中除步驟(1)以外還實施以下 的步驟(1』)，在步驟(2)中基於步驟(1)和步驟(1』 )的檢測結果判斷AKI的原因是否是 由於急性腎小管損傷引起的。(1，)檢測選自尿中NGAL、尿中IL-18、尿中KIM_1、NAG及尿中L-FABP中的一種以 上的生物標記物的步驟。根據該方式，由於基於兩種以上不同的指標進行判斷，因此可以得到命中率和/ 或可靠性更高的鑑別結果。各生物標記物(包括MK)的變動有各自固有的特性，通過將多 種生物標記物組合，可以提高鑑別結果的命中率和可靠性。另外，還可以得到對於預後推測 等有益的信息。從提高命中率和/或可靠性的觀點考慮，原則上步驟(1』)中的檢測對象的生物標 記物的數量越多越好。因此，優選步驟(1』)中以兩種以上的生物標記物作為檢測對象(例 如，NGAL及IL-18這兩種)。
步驟(1』 )中的各生物標記物的測定方法沒有特別限制。各生物標記物的標準方 法或已報導的方法等如第一方面的部分中所述。步驟(2)在步驟(2)中，基於步驟(1)的檢測結果(還實施步驟(1』 )時基於步驟(1)及 (1』)的檢測結果)，判斷AKI的原因是否是由於急性腎小管損傷引起的。此處的判斷可以 是定性或定量的任何一種。定性判斷和定量判斷的例子如下所述。另外，此處的判斷根據 其判斷基準是顯而易見的，即使不通過醫師或檢查技師等具有專業知識的人的判斷也可以 自動地/機械地進行。(定性判斷的例1)測定值(MK量)高於基準值時判斷為「是ATN」或「是ATN的可能性高」，測定值低 於基準值時判斷為「不是ATN」或「不是ATN的可能性高」。測定值低於基準值時也可以判 斷為「是ATN以外的腎損傷」或「是ATN以外的腎損傷的可能性高」。(定性判斷的例2)確認到反應性(陽性)時判斷為「是ATN」或「是ATN的可能性高」，未確認到反應 性(陰性)時判斷為「不是ATN」或「不是ATN的可能性高」或者「是ATN以外的腎損傷」或 「是ATN以外的腎損傷的可能性高」。(定量判斷的例子)如下所述地按照每個測定值的範圍預先設定「是ATN的可能性(％ ) 」，從測定值判 斷「是ATN的可能性(％ )」。測定值a b 是ATN的可能性為10%以下測定值b c 是ATN的可能性為10% 30%測定值c d 是ATN的可能性為30% 50%測定值d e 是ATN的可能性為50% 70%測定值e f 是ATN的可能性為70% 90%下面給出除MK以外還利用其它生物標記物(選自尿中NGAL、尿中IL-18、尿中 KIM-1、尿中NAG及尿中L-FABP中的一種以上生物標記物)時的判斷方法的一例，首先，基 於MK的檢測結果判斷是ATN的可能性，如果得到是ATN的可能性高的判斷結果則追加實施 其它生物標記物的檢測，然後基於其它生物標記物的檢測結果做出是ATN的可能性的最終 判斷。該例中，採用利用MK的檢測結果作為一次鑑別、利用其它生物標記物的檢測結果作 為最終鑑別的判斷方法。與此相反，也可以利用其它生物標記物的檢測結果作為一次鑑別， 利用MK的檢測結果作為最終鑑別。組合使用兩種以上的生物標記物時，可以採用以下的⑴或(2)的判斷方法。(1)組合中所含的所有生物標記物均為陽性(截止值以上)時判斷為陽性，除此以 外時判斷為陰性。(2)組合中所含的生物標記物有一個為陽性(截止值以上)時即判斷為陽性，除此 以外時判斷為陰性。本發明人的研究的結果表明，根據組合的生物標記物的種類及數量的不同，診斷 靈敏度及診斷特異度也不同(後述的實施例)。因此，可以根據目的選擇最佳的生物標記物 的組合。例如，診斷靈敏度高的組合適合於篩選性的檢查。與此相對，診斷特異度高的組合
16適合於需要進行可靠性更高的判斷的檢查(例如二次檢查或三次檢查)。通過將診斷靈敏度及診斷特異度的平衡不同的判斷方法進行組合，可以實現效率 化和準確度乃至可靠性的提高。例如，使用提供高診斷靈敏度的生物標記物的組合選出陽 性對象(一次檢查、篩選檢查)後，使用提供高診斷特異度的生物標記物的組合進行最終判 斷(二次檢查)。不限於這樣的兩階段的判斷，也可以進行三階段以上的判斷。列舉生物標記物的組合的例子，有MK與NAG的並用、MK與IL-18的並用、MK與 NGAL的並用、MK和NAG及IL-18的並用、MK和NAG及NGAL的並用、MK和IL-18及NGAL的 並用以及MK和NAG和IL-18及NGAL的並用。如後述的實施例所述，除MK與NGAL的並用 (此時得到靈敏度與特異度的平衡良好的結果)以外，這些並用都可以期待診斷特異度的 提尚。3-3.急性腎損傷(AKI)鑑別用試劑及試劑盒本發明還提供AKI鑑別用試劑及試劑盒。本發明的試劑由抗MK抗體構成。關於抗 MK抗體，與第一方面的試劑的情況同樣，因此省略其說明。本發明的試劑盒包含本發明的 試劑作為主要構成要素。試劑盒中也可以包含實施鑑別方法時使用的其它試劑(緩衝液、 封閉用試劑、酶的底物、顯色試劑等)和/或裝置、器具(容器、反應裝置、螢光酶標儀等)。 另外，優選試劑盒中包含MK作為標準樣品。另外，通常本發明的試劑盒附有操作說明書。實施例1.各種腎疾病的尿中中期因子(MK)濃度(1)對象MK是肝素結合性生長因子，缺血損傷時在近端腎小管中表達增強(Sato W. et al.，J Immunol. 2001S印 15 ； 167 (6) :3463_9.)。以 583 例為對象研究尿中 MK 濃度與 AKI 的相關性。583例的明細是作為AKI的主要原因的急性腎小管壞死(ATN)患者33人、ATN 以外的腎損傷患者517人、正常志願者33人。(2)方法取得書面同意後，採集各對象的尿液，測定尿中MK濃度。具體而言，使用尿樣 0.01ml，通過利用兩種多克隆抗MK抗體(雞抗體、兔抗體)的夾心ELISA，測定尿中MK濃度。(3)結果尿中MK濃度的測定結果(實測值)如圖1所示。另夕卜，ROC曲線 (receiver-operating characteristic curve，受試者工作特徵曲線)分析的結果如圖2 所示。與對照組或AKI以外的腎損傷患者的尿中MK濃度相比，在作為AKI的主要原因的急 性腎小管壞死(ATN)的患者中，觀察到尿中MK濃度的顯著升高(圖1)。作為生物標記物的 靈敏度、特異度指標的ROC曲線的AUC(曲線下面積)為0. 965，得到單一生物標記物無法匹 敵的優異結果(圖2)。現有的尿中生物標記物(β -N-乙醯-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)、尿 中中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(NGAL)、尿中白介素18(IL-18))中，未觀察到像尿 中MK那樣的AKI特異性的濃度變化(圖3)。另外，如圖4 (實測值的比較)、圖5 (尿中肌酐 (Cr)校正後的值的比較)及圖6(比較的總結)所示，尿中MK濃度的AUC與尿中NAG、尿中 IL-18、尿中NGAL相比顯著高。如果設定尿中MK濃度的截止值為70pg/ml，則使用尿中MK 濃度的ATN診斷的靈敏度為97. 0%、特異度為90. 3%，遠在現有的尿中生物標記物(NAG、NGAL, IL-18)之上。如上所述，可以判斷尿中MK濃度是AKI的敏銳的生物標記物，並且發揮超出現有 生物標記物的有用性。即，可以說在AKI的鑑別診斷方面尿中MK濃度是最優良的生物標記 物。另外，急性腎損傷的病例雖多為缺血性AKI，但此外還有敗血症性AKI (s印tic AKI)、抗癌劑給與所伴隨的中毒性AKI (toxic AKI)、造影劑腎病(radiocontrast nephropathy)(有時包含在缺血性AKI中)等種類。如下所示，在這些急性腎損傷中也確認 到尿中MK濃度的升高。敗血症性AKI :710pg/ml (38 歲女性)、750pg/ml (75 歲男性)、502pg/ml (74 歲男 性)中毒性AKI :141pg/ml(13 歲女性)造影劑腎病272pg/ml (41歲男性)2.多種生物標記物組合的AKI診斷計算將尿中MK濃度與其它生物標記物組合進行AKI診斷時的靈敏度及特異度。作 為各生物標記物的值，使用Cr校正後的值(與圖5所示的ROC曲線對應)。另外，通過ROC 曲線分析，如下設定各生物標記物的截止值。尿中MK濃度的截止值75. lpg/mgCr尿中NAG濃度的截止值31. OU/gCr尿中IL-18濃度的截止值173. 6pg/mgCr尿中NGAL濃度的截止值26. 7ng/mgCr對各種組合進行統計處理，比較靈敏度及特異度(圖7的表)。以符號「 + 」表示的 組合，在該組合中所含的所有生物標記物均為陽性(截止值以上)時判斷為陽性，計算靈敏 度及特異度。例如MK+IL-18+NGAL的情況下，在尿中MK濃度、尿中IL-18濃度及尿中NGAL 濃度全部為陽性(截止值以上)時判斷為陽性，除此以外時判斷為陰性，示出了此時的靈敏 度(48.5%)、特異度(97.8%)。另一方面，以符號「/」表示的組合，在該組合中所含的生 物標記物有一個為陽性(截止值以上)時即判斷為陽性，計算靈敏度及特異度。例如，MK/ IL-18/NGAL的情況下，尿中MK濃度、尿中IL-18濃度及尿中NGAL濃度中有一個為陽性(截 止值以上)時即判斷為陽性，除此以外時判斷為陰性，示出此時的靈敏度(100%)、特異度 (53. 2% )。如圖7的表所示，根據組合的生物標記物的種類及數量的不同，靈敏度及特異度 的平衡也不同。這表示通過根據目的選擇生物標記物的組合，可以進行更符合目的的診斷。 一般而言，靈敏度高的組合(例如MK/NGAL、MK/IL-18/NGAL、MK/NAG/IL-18/NGAL)適合於篩 選檢查，與此相對特異度高的組合(例如MK+NAG、MK+IL-18、MK+NAG+IL-18、MK+NAG+NGAL、 MK+IL-18+NGAL、MK+NAG+IL-18+NGAL)適合於二次檢查或三次檢查等需要進行可靠性更高 的判斷的檢查。例如，如果在實施使用前者的檢查選出陽性對象後，實施使用後者的檢查來 進行最終的判斷，則可以有效且高可靠度地進行AKI診斷(AKI的鑑別)。3.腹主動脈瘤術後的急性腎損傷(AKI)與尿中中期因子(MK)濃度(1)對象以從2005年12月至2007年5月在名古屋大學醫學部附屬病院實施擇期腹主動脈瘤術、並獲得書面同意的下述32例為對象，考察尿中MK濃度與術後的AKI的相關性。另 外，患者詳細背景如圖8所示，術前檢查所見如圖9所示。性別男性29例、女性3例年齡72士8歲病型腎動脈上2例、腎動脈下30例人造血管1型11例、Y型21例估算GFR :56. 9士21. 8(ml/ 分鐘 /1. 73m2)⑵方法實施前瞻性觀察試驗。隨時間推移進行一般檢查的同時，通過ELISA(S. Ikematsu, et al. Br. J. Cancer 2000 ；83)測定尿中 MK 濃度(參照圖 10)。在 AKI 組(以 Δ Cr ^ 50% 進行定義)與非AKI組之間進行比較、評價。(3)結果試驗結果如圖11所示。根據以術後第2天(P0D2)、第3天(P0D3)為峰值的Cr升 高將5例(16%)診斷為ΑΚΙ。在AKI組中，尿中MK濃度先於Cr實時升高(雙因素方差分 析，組間差P = O. 001)，從主動脈阻斷時開始至術後1天(PODl)顯示高值。特別是從主動 脈阻斷時開始至手術結束時(從主動脈阻斷時開始約3小時後)顯示非常高的值(峰值為 從主動脈阻斷時開始約1小時後的主動脈開放時)。由以上結果表明，術中尿中MK濃度升高的病例呈現術後AKI的可能性極高。換 言之，如果利用尿中MK作為標記物，則可以在術中這樣的極早期預測AKI的發病。另一方 面，與作為現有標記物的尿中NAG、尿中β2微球蛋白(β 2MG)、尿中半胱氨酸蛋白酶抑制 劑C(Cys-C)比較的結果是，這些標記物不能早期預測發病(圖12 14)。另外，對於作為 急性腎損傷的早期診斷標記物被報導的尿中IL-18及尿中NGAL的濃度，在術後未發現升高 (圖15)。這樣，使用已知的生物標記物(包括保險適用的生物標記物)，不能實現像使用 尿中MK濃度時那樣的早期預測。另外，尿中NAG、尿中β 2微球蛋白在外部機構進行測定。 另夕卜，血清半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、尿中IL-18及尿中NGAL通過市售的ELISA測定試劑盒 (尿中半胱氨酸蛋白酶抑制劑C通過^ 7 二一卜GC半胱氨酸蛋白酶抑制劑C試劑盒(膠體 金凝集法、Alfresa Pharma 公司制)、尿中 NGAL 通過 NGAL ELISA 試劑盒(CircuLex NGAL/ 脂質運載蛋白-2ELISA試劑盒/Cat#CY-8070/CircuLex)、尿中IL-18通過人IL-18ELISA試 劑盒(編號7620、MBL公司制)，使用0. Olml尿樣進行測定。另外，在實施使用人工心肺的心臟瓣膜置換術後呈現AKI的病例中，在術中也發 現尿中MK濃度的顯著升高(圖16)。這樣，得到支持尿中MK在AKI的早期發病預測中的有 用性的結果。4.腎移植後的移植腎的腎功能與尿中中期因子(MK)濃度(1)對象及方法對於實施活體腎移植的2例病例，如圖17的規程所示，在移植物(graft)的血流 再通(0小時)後、初尿、1小時後、2小時後、6小時後、8小時後及之後數日間隨時間推移進 行採尿，測定血中肌酐和尿中MK濃度。(2)結果(圖 18)病例1在移植後存活良好，從次日開始血清肌酐順利地恢復。該病例從剛移植後
19至利尿開始後8小時的尿中MK為Opg/ml。另一方面，病例2在術後移植腎的存活不良，腎 衰竭狀態遷延至移植後第4天。就該患者的尿中MK濃度而言，剛開始利尿後的MK濃度顯 示442pg/ml的高值，以後減少，4小時以後降至靈敏度以下。(3)考察通過剛開始利尿後的尿中MK的濃度測定，可以預測移植腎的存活是良好還是不 良(急性腎損傷(AKI)的超早期診斷劑)。特別是在日本以外，屍體腎移植的病例多，術後 存活不良遷延的病例多，在這些病例中，可以從手術剛實施後預測存活不良，將對於移植腎 存活的治療從一般的規程變更為更積極的治療方法，從而提高移植腎的存活率。5.造影劑造成的腎損傷與尿中中期因子(MK)濃度(1)對象及方法使用造影劑的檢查在日常診療中廣泛應用，但是造影劑造成的腎損傷成為臨床上 的大問題，對可以更早期進行診斷的生物標記物的需求提高。其中，心絞痛、心肌梗死中冠 狀動脈造影、冠狀動脈再造術的病例數較多。如圖19的規程所示，在即將進行心臟導管檢 查前、剛進行心臟導管檢查後以及次日進行採血、採尿，測定血清肌酐、尿中MK濃度、尿中 IL-18濃度及尿中NGAL濃度。(2)結果對慢性腎臟病患者剛使用造影劑後(血清肌酐為7. 62mg/dl)的初尿的尿中MK濃 度、尿中IL-18濃度及尿中NGAL濃度分別顯示272pg/ml、18. 69pg/ml及68. 88ng/ml的高值。(3)考察心臟導管檢查是在全世界範圍內廣泛進行的診斷性、治療性戰略。通過測定剛進 行檢查後的尿中MK，可以預測造影劑腎病(toxic AKI)，顯示出可以改善檢查後的預後，即， 尿中MK濃度作為急性腎損傷(AKI)的超早期診斷標記物有用。6.對淺表性的早期腎癌實施腎部分切除術的病例與尿中中期因子(MK)濃度(1)對象及方法在對淺表性的早期腎癌進行的腎部分切除術中，在切除腎癌部分的過程中，阻斷 病側的腎動脈，切除後使腎血流再通。該手術中，在將腫瘤部分切除的過程中將腎動脈和腎 靜脈完全阻斷約30分鐘，因此病側腎產生缺血性腎損傷。原本腎臟的儲備能力很大，通常 即使將一側腎完全摘除，另一側的腎臟也可以代償，因此Cr升高有限，但是在一部分病例 中，該手術引起的腎損傷遷延。該手術中，為了觀察術後出血及確認尿量等在病側的腎盂內 插入導管採集病側尿液，並從留置在一側膀胱內的導管主要採集來自健側腎的尿液，這成 為基本的手術處置。按照圖20及21所示的規程，採集術前、術後的血液及尿液，考察尿中 MK濃度。(2)結果來自切除腎的尿液觀察到兩相性的尿中MK濃度的峰值，在手術開始後1小時以內 觀察到第一峰值，從術後6小時至48小時以內觀察到第二峰值。第二峰值在來自病側腎和 健側腎的尿液中也觀察到。認為這反映的是病側腎發生的缺血損傷波及到包括健側腎在內 的全身器官，而反映出使兩側腎的新的蛋白質合成亢進的MK。因此，在腎損傷輕微的病例 中，第一峰值及第二峰值均為一過性的升高(圖22)。另一方面，在腎儲備能力下降的老年人、慢性腎臟病患者中腎功能損傷遷延(圖23、24)。此時尿中MK濃度的第二峰值不限於一 過性的升高，而是高值遷延、持續。認為這是對缺血引起的應激產生反應，通過稱為HIF-I 的轉錄因子促進新的MK蛋白的產生、分泌的結果，該第二峰值遷延的病例(病例2及3)表 示應激持續、即腎損傷強。由此可以說，如果著眼於第二峰值則可以進行預後的推測。(3)考察由以上表明，在該疾病組中尿中MK濃度作為早期的急性腎損傷的標記物也是有 用的。並且，可以判斷出尿中MK濃度不僅作為急性腎損傷的「早期診斷用標記物」有用、而 且作為「作為預後預測因子的生物標記物」也是有用的。7.在化學療法後或腎病症候群中進展的腎損傷與尿中中期因子(MK)濃度(1)對象及方法對甲氨蝶呤(MTX)等的化學療法後及腎病症候群治療過程中腎功能損傷進展、遷 延的病例，測定尿中MK濃度。(2)結果在腎病症候群的治療過程中、腎功能損傷遷延的期間內，尿中MK濃度持續高值 (腎活檢後第7天 第9天；尿中MK 730-770pg/ml)，與此相對，隨著腎功能的改善尿中MK 濃度降低(圖25上半部)。在敗血症性AKI的患者中也觀察到同樣的傾向(圖25下半 部)。另外，如圖26所示，在MTX化學療法後的腎損傷中，在腎功能損傷持續的期間(第2 天 第6天)，尿中MK濃度也持續高值。(3)考察除前述的腎癌部分切除術以外，在化學療法後的AKI、腎病症候群等原發性、繼發 性腎小球腎炎後續的AKI中，尿中MK作為「作為預後預測因子的生物標記物」也是有用的。8.微小病變腎病症候群與尿中中期因子(MK)濃度已知作為腎病症候群的頻率最高的原因的「微小病變腎病(minimal change) 」的 一至兩成會呈現急性腎小管壞死(ATN)。對微小病變腎病的主要在腎活檢時採集的尿樣的 MK濃度進行考察的結果是，合併有急性腎小管壞死(ATN)的病例中為顯著高值(圖27)。由 此表明，尿中MK濃度對於從微小病變腎病中進展為ATN(狹義的AKI)的病例的早期檢測是 有用的。9.尿中MK濃度與血中MK濃度的關係1(1)對象及方法對515例腎炎患者測定尿中MK濃度和血漿中MK濃度(橫斷面研究)。另外，在 32例接受腹主動脈瘤置換術的患者中對尿中MK濃度和血漿中MK濃度進行了多次測定(病 例對照研究)。另一方面，製作MK的親和柱，嘗試了與血清中的MK結合的蛋白的鑑定。(2)結果尿中MK濃度和血中MK濃度的測定結果如圖28及29所示。可知MK未受到腎小 球過濾。另一方面，通過電泳對結合在MK的親和柱上的血清中的成分進行考察(圖30)，結 果推測分子量約250kDa的高分子量蛋白(圖中的X所示的條帶。圖中X'所示的條帶推 測為X的片段)與MK結合。對該蛋白用TOF-MAS進行分子的鑑定。由這些結果可知，血中 的MK絕大部分與血管內皮細胞的硫酸乙醯肝素鏈(heparan)結合，即使有可溶性MK也與 血中的250kDa的蛋白結合而存在，因此幾乎不會排洩到尿中(腎小球基底膜上存在孔徑屏
21障(膠原蛋白纖維的網狀小孔、據稱半徑約70人)，分子量為250kDa時不被過濾)。10.尿中MK濃度與血中MK濃度的關係2(1)對象及方法比較合併有腎澱粉樣變性的慢性風溼性關節炎患者在有無給與肝素的情況下的 尿中MK濃度和血漿中MK濃度。(2)結果MK濃度在給與肝素時確實升高(圖31)，即使在腎澱粉樣變性導致的腎病狀態 (腎小球基底膜損傷強、不僅白蛋白而且IgG等高分子蛋白也漏出)下尿中未檢測到MK。 即，可以認為基本沒有從腎小球漏出的MK。圖32的病例1 5中，儘管血漿中MK濃度高，但尿中未檢測到MK。特別是病例 2、3、5是蛋白選擇性低的疾病(即，腎小球基底膜的損傷強、透過性亢進、連高分子也洩漏 到尿中的代表性疾病)，值得關注。病例6 9是尿中MK濃度為高值的ATN(狹義的AKI) 病例，但血漿中MK濃度從低值到高值呈現各種情況。AKI基本上多由全身性應激的基礎疾 病產生(例如敗血症或術後等)，血漿中MK也升高的情況當然也多。如上所述，證明MK不 被腎小球過濾。產業實用性本發明的檢查方法中，以尿中MK量作為指標判斷AKI的發病可能性。根據本發明 的檢查方法，可以實現用已知的生物標記物(NGAL、IL-18等)無法實現的、極早期的發病 預測。如果AKI的早期預測成為可能，則可以在很早的階段積極地介入治療，也可以改善預 後。尿中MK量對於與腎功能相關的預後的推測也是有用的。如果以尿中MK量作為指標， 則不僅可以推測AKI的發病可能性，而且可以推測與腎功能相關的預後。尿中MK的應答性 與已知的生物標記物不同。利用該應答性的差異，如果將尿中MK與已知生物標記物並用， 則可以進行準確度更高且可靠性更優良的判斷。另一方面，本發明的鑑別方法中，也以尿中MK量作為指標進行AKI的鑑別。根據 本發明的鑑別方法，可以以極高的靈敏度及特異度鑑別AKI。將尿中MK與已知生物標記物 並用，還可以實現準確度乃至可靠性的提高。本發明不受上述發明的實施方式及實施例的說明的限制。在不偏離本發明要求保 護的範圍的情況下、在本領域技術人員能夠容易地想到的範圍內的各種變形方式也包括在 本發明中。本說明書中所述的論文、公開專利公報及專利公報等的內容，通過援引引用其全 部內容。
權利要求
一種急性腎損傷早期檢測用生物標記物，其由中期因子構成。
2.一種急性腎損傷的檢查方法，其以尿中中期因子量作為指標。
3.如權利要求2所述的檢查方法，其中，包含以下步驟(1)和(2)(1)檢測尿中中期因子的步驟；(2)基於檢測結果判斷急性腎損傷的發病可能性的步驟。
4.如權利要求2或3所述的檢查方法，其中，急性腎損傷為急性腎小管壞死。
5.如權利要求2或3所述的檢查方法，其中，急性腎損傷為缺血性急性腎損傷、中毒性 急性腎損傷或敗血症性急性腎損傷。
6.如權利要求5所述的檢查方法，其中，缺血性急性腎損傷為術後的缺血性急性腎損傷。
7.如權利要求6所述的檢查方法，其中，使用從引起缺血狀態的手術實施時至術後1天 之間採集的尿液來實施步驟(1)。
8.如權利要求6所述的檢查方法，其中，使用從引起缺血狀態的手術實施開始3小時以 內採集的尿液來實施步驟(1)。
9.如權利要求6 8中任一項所述的檢查方法，其中，手術為大血管手術、使用人工心 肺裝置的開心術、器官移植術或腎腫瘤部分腎切除術。
10.如權利要求3 9中任一項所述的檢查方法，其中，除步驟(1)以外還實施以下的 步驟(1』)，在步驟(2)中基於步驟(1)和步驟(1』 )的檢測結果判斷急性腎損傷的發病可 能性(1』 )檢測選自尿中中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(NGAL)、尿中白介素 18 (IL-18)、尿中腎損傷分子-I(KIM-I)、β-N-乙醯_D_氨基葡萄糖苷酶(NAG)及尿中肝型 脂肪酸結合蛋白(L-FABP)中的一種以上的生物標記物的步驟。
11.如權利要求3所述的檢查方法，其中，在步驟(1)中，以微小病變腎病的患者的尿液 作為樣品檢測尿中中期因子。
12.一種急性腎損傷檢查用試劑，其由抗中期因子抗體構成。
13.—種急性腎損傷檢查用試劑盒，其中，包含權利要求12所述的試劑。
14.一種與腎功能相關的預後推測用生物標記物，其由中期因子構成。
15.一種與腎功能相關的預後推測方法，其以尿中中期因子量作為指標。
16.如權利要求15所述的預後推測方法，其為推測缺血性急性腎損傷、中毒性急性腎 損傷或敗血症性急性腎損傷的預後的方法。
17.如權利要求15所述的預後推測方法，其中，在腎移植後或腎部分切除術後檢測尿 中中期因子，根據以下的基準推測預後如果從術後6小時至48小時之間觀察到的尿中中期因子量的升高為一過性則預後良 好，如果從術後6小時至48小時之間觀察到的尿中中期因子量的升高並非一過性而是高值 遷延或持續則預後不良。
18.如權利要求17所述的預後推測方法，其中，以來自病側腎的尿液和/或來自健側腎 的尿液作為樣品檢測尿中中期因子。
19.一種與腎功能相關的預後推測用試劑，其由抗中期因子抗體構成。
20.一種與腎功能相關的預後推測用試劑盒，其中，包含權利要求19所述的試劑。
21.一種急性腎損傷鑑別用生物標記物，其由中期因子構成。
22.一種急性腎損傷的鑑別方法，其以尿中中期因子量作為指標。
23.如權利要求22所述的鑑別方法，其中，包含以下的步驟(1)和(2)(1)檢測尿中中期因子的步驟；(2)基於檢測結果判斷急性腎損傷的原因是否是由於急性的腎小管損傷引起的步驟。
24.如權利要求22或23所述的鑑別方法，其中，急性腎損傷為急性腎小管壞死。
25.如權利要求22或23所述的鑑別方法，其中，急性腎損傷為缺血性急性腎損傷。
26.如權利要求25所述的鑑別方法，其中，缺血性急性腎損傷為術後的缺血性急性腎 損傷。
27.如權利要求23 26中任一項所述的鑑別方法，其中，除步驟(1)以外還實施以下 的步驟(1』)，在步驟(2)中基於步驟(1)和步驟(1』 )的檢測結果判斷急性腎損傷的原因 是否是由於急性的腎小管損傷引起的(1』 )檢測選自尿中中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(NGAL)、尿中白介素 18 (IL-18)、尿中腎損傷分子-I(KIM-I)、β-N-乙醯_D_氨基葡萄糖苷酶(NAG)及尿中肝型 脂肪酸結合蛋白(L-FABP)中的一種以上的生物標記物的步驟。
28.一種急性腎損傷鑑別用試劑，其由抗中期因子抗體構成。
29.一種急性腎損傷鑑別用試劑盒，包含權利要求28所述的試劑。
全文摘要
本發明的課題在於，提供對於急性腎損傷的早期發病預測、與腎功能相關的預後推測及急性腎損傷的鑑別有用的新型生物標記物。另外，本發明的課題在於提供該新型生物標記物的用途。使用中期因子作為生物標記物。基於尿中中期因子的檢測結果，進行急性腎損傷的發病可能性的判斷、與腎功能相關的預後推測或急性腎損傷的鑑別。
文檔編號G01N33/53GK101960308SQ20098010660
公開日2011年1月26日 申請日期2009年2月26日 優先權日2008年2月29日
發明者松尾清一, 林宏樹, 池松真也, 湯澤由紀夫, 門松健治 申請人:國立大學法人名古屋大學