核酸標記方法

2023-05-14 20:14:46 2

專利名稱：核酸標記方法
技術領域：
本發明涉及核酸標記化合物。這些標記化合物具有可檢測的部分或一些部分，其是允許通過合適的設備或試驗檢測攜帶其的RNA或其片段的分子或複合體。具體地，本發明涉及可用於標記RNA分子或片段的3′末端的核酸標記化合物。本發明的核酸標記化合物可通過使用稱作RNA裂解酶的酶連接於RNA。這種標記方法據說是用於使其從需要轉化RNA為DNA的其它方法中區分開。本發明也涉及利用核酸微陣列對標記的RNA進行的分析。
背景技術：
在病態和健康細胞中以及在在不同發育階段的細胞中的基因表達通常是不同的。在此情況下監控基因表達的能力給研究人員和醫務工作者提供了強有力的診斷工具。
人們例如可以通過測定目的基因的轉錄產物也即核酸(例如，mRNA)的存在與否監控基因表達。可通過用可檢測部分化學或生物化學標記mRNA然後與基因的核酸探針雜交來完成對核酸的監控。在探針位置檢測標記的核酸表明靶基因已經表達。
現在已經發展了多種RNA檢測方法。這些包括「Northern」印跡以及利用放射性同位素諸如32P。也已經開發了非放射性檢測技術。Langer等，Proc.Nati.Acad.Sci.USA 1981，6633-6637，例如，公開了特定生物素標記的核苷。Lockhart等的美國專利6,344,316，公開了用非放射性核苷酸標記末端的酶催化法。這些參考文獻在這裡引入作為參考。
然而，仍需要其可用於有效以及精確的標記RNA和監控基因表達的RNA標記化合物。
發明概述在本發明的一個方面，提供了可用於將可檢測部分連接到RNA分子或其片段的3′末端上的化合物。在本發明的一個方面，提供了下式化合物 其中B是雜環的鹼基部分；X是允許核酸標記化合物連接於RNA分子或RNA片段的3′OH基團的官能團；Y選自-H，-OH，-OR，-SR，-NHR，或滷素；L是接頭基團；且Sig是可檢測的標記或部分。
在本發明的另一方面，提供了下式核酸標記化合物 其中L是接頭且Sig是可檢測的部分；B1是腺嘌呤且B選自腺嘌呤，鳥嘌呤，胞嘧啶和尿嘧啶。
在本發明的另一個方面，化合物具有諸如下式的多重信號源
其中B是雜環的鹼基部分，L1是第一接頭，L2是第二接頭，Sig是可檢測部分且n是從1到6的整數。
在本發明的另一方面，提供了末端標記RNA(總RNA，mRNA，cRNA或片斷RNA)的方法。在一個實施方案中，T4RNA連接酶用於將3』-生物素化的AMP或CMP供體連接於RNA受體分子。在另一實施方案中，3′-APPN-3′-接頭-生物素型的焦磷酸鹽被用作供體分子被連接於RNA受體分子。
在本發明的另一個方面，提供了分析核酸微陣列上的核酸群的方法，包括提供核酸群或將核酸群轉化為核酸片段；利用連接酶將核酸群或片段連接於核酸標記分子來形成標記的核酸群或片段；將標記的核酸群或片段雜交於一系列核酸探針，並且測定探針的雜交信號來顯示核酸群中核酸的水平。


圖1基於各自四個重複，比較重複末端-標記的(平均連接)與內部-標記的cRNA(平均標準)。通過連接進行的末端標記與內部-標記的cRNA相比產生更大量的信號和更高的靶強度(如通過平均平均差異測定的)。
發明詳述本發明具有很多優選的實施方案並且依賴於許多本領域公知的專利申請及其它參考文獻。因此，當以下引用或重複提及專利，申請或其它參考文獻時，應能理解其被通過引入作為參考用於所有目的以及用於所列舉的問題。
如在此申請中使用的，單數形式的「a」，「an」，和「the」包括複數含義，除非上下文中清楚地說明。例如，術語「藥物」包括大量的藥物，包括其混合物。
個體不限於人，也可以是其它生物體包括但不限於哺乳動物，植物，細菌，或來源於任意上述的細胞。
在此公開中，本發明的不同方面可以是範圍形式。應能理解範圍形式的描述僅僅是為方便和簡短起見並且不應理解為對本發明範圍呆板的限制。因此，範圍的描述應被認為特定地公開了所有可能的子範圍以及在那些範圍內的個體數值。例如，範圍諸如由1到6的描述應理解為具有特定公開的子範圍諸如1到3，由1到4，由1到5，由2到4，由2到6，由3到6等等，以及那些範圍內的個體數字，例如，1，2，3，4，5，以及6。這些應用與範圍的寬度無關。
本發明的應用可使用，除非另有陳述，傳統方法以及有機化學，聚合物技術，分子生物學(包括重組技術)，細胞生物學，生物化學，以及免疫學的描述，其在本領域技術人員的知識範圍之內。這些傳統方法包括聚合物陣列合成，雜交，連接，以及利用標記進行雜交的檢測。合適技術的特定例證可在下文中實施例中參考。然而，其它相同的常規方法當然也可以被使用。這些傳統的方法和描述可在標準的實驗手冊中發現，諸如Genome AnalysisA Laboratory Manual Series(Vols.I-IV)，Using AntibodiesA Laboratory Manual，CellsA LaboratoryManual，PCR PrimerA Laboratory Manual，and Molecular CloningALaboratory Manual(all from Cold Spring Harbor Laboratory Press)，Stryer，Biochemistry，(WH Freeman)，Gait，″Oligonucleotide SynthesisA Practical Approach″1984，IRL Press，London，所有的整體引入作為用於所有的目的的參考。
本發明在某些優選的實施方案中可利用固體基質包括陣列。適用於聚合物(包括蛋白質)陣列合成的方法和技術已描述在U.S.S.N09/536,841，WO00/58516，U.S.專利5,143,854，5,242,974，5,252,743，5,324,633，5,384,261，5,424,186，5,451,683，5,482,867，5,491,074，5,527,681，5,550,215，5,571,639，5,578,832，5,593,839，5,599,695，5,624,711，5,631,734，5,795,716，5,831,070，5,837,832，5,856,101，5,858,659，5,936,324，5,968,740，5,974,164，5,981,185，5,981,956，6,025,601，6,033,860，6,040,193，6,090,555，和6,136,269，PCT申請PCT/US99/00730(國際公開號WO 99/36760)和PCT/US01/104285，以及美國系列申請Nos.09/501,099和091122,216中，其全部整體引入作為參考用於所有的目的。優選的陣列購自Affymetrix，Inc.(Santa Clara，CA)。參見www.affymetrix.com。
在特異性實施方案中描述合成技術的專利包括美國專利5,412,087，6,147,205，6,262,216，6,310,189，5,889,165和5,959,098。核酸陣列描述在許多上述的專利中，但相同的技術被用於多肽陣列。
本發明也涉及許多將聚合物連接於固體基質的應用。這些應用包括基因表達監控，繪譜，文庫篩選，基因分型，以及診斷。基因表達監控，以及繪譜方法可顯示於美國專利5,800,992，6,013,449，6,020,135，6,033,860，6,040,138，6,177,248和6,309,822中。基因分型及其應用顯示於USSN 10/013,598，和U.S專利5,856,092，6,300,063，5,858,659，6,284,460和6,333,179中。其它應用概括在美國專利5,871,928，5,902,723，6,045,996，5,541,061以及6,197,506中。
本發明也在特定的優選的實施方案中公開了樣品製備方法。例如，參見基因表達，繪譜，基因定型專利及其它上述的專利，以及USSN09/854,317，Wu和Wallace，Genomics 4，560(1989)，Landegren等，Science241，1077(1988)，Burg，美國專利5,437,990，5,215,899，5,466,586，4,357,421，Gubler等，1985，Biochemica et Biophysica Acta，DisplacementSynthesis of Globin Complementary DNAEvidence for SequenceAmplification，transcription amplification，Kwoh等，Proc.Nati.Acad.Sci.USA 86，1173(1989)，Guatelli等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，87，1874(1990)，WO 88/10315，WO 90/06995和6,361,947。
本發明也在特定的優選的實施方案中公開了配體間雜交的檢測。參見美國專利5,143,854，5,578,832；5,631,734；5,834,758；5,936,324；5,981,956；6,025,601；6,141,096；6,185,030；6,201,639；6,218,803和6,225,625以及PCT申請PCT/US99/06097(公開為WO99/47964)，各自整體引入作為參考用於所有的目的。
本發明也利用了用於各種目的諸如探針設計，數據管理，分析，和裝置操作的多種電腦程式產品以及軟體。參見美國專利5,593,839，5,795,716，5,733,729，5,974,164，6,066,454，6,090,555，6,185,561，6,188,783，6,223,127，6,229,911和6,308,170。
另外，本發明可具有優選的實施方案，包括通過網際網路提供遺傳信息的方法。參見臨時申請60/349,546。
定義「核酸陣列」是指連接於(優選通過單個末端共價鍵)一或多個固體支持物的大量不同的寡核苷酸或多核苷酸，其中當有大量的支持物時，各個支持物具有大量的寡核苷酸或多核苷酸。術語「陣列」可指支持物上寡核苷酸或多核苷酸的全部集合或其子集。寡核苷酸或多核苷酸種類的空間分布在兩個陣列之間可能不同，但是，在優選的實施方案中其基本上是相同的。可以理解甚至當兩個陣列被設計和合成為相同時，寡核苷酸或多核苷酸探針的豐度，組成，以及分布仍然有差異。這些差異優選地為非實質性的和/或通過利用在這裡描述的對照進行補償。術語寡核苷酸和多核苷酸在本申請中可互換使用並且一個術語的使用不應作為對本發明限制來出現。
術語「核酸」或「核酸分子」是指單-或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，並且除非另有限制，應包括能以類似於天然存在的核苷酸行使功能的天然核苷酸的已知類似物。
寡核苷酸或多核苷酸是2到約1000個核苷酸的單鏈核酸，更典型地2到約500個核苷酸的長度。
在這裡使用的術語「探針」定義為能夠通過一或多種化學鍵，通常通過鹼基對互補，通常通過氫鍵形成結合於互補序列的靶核酸的寡核苷酸或多核苷酸。如在這裡使用的，寡核苷酸或多核苷酸探針可包括天然的(即，A，G，C或T)或修飾的鹼基(7-脫氮鳥苷，肌苷，等等)。此外，寡核苷酸或多核苷酸探針中的鹼基可以通過除了磷酸二酯鍵之外的鍵連接，只要其不幹擾雜交。因此，寡核苷酸或多核苷酸探針可以是肽核酸，其中組成鹼基通過肽鍵而不是磷酸二酯鍵相連接。寡核苷酸或多核苷酸探針通常可稱為核酸探針。
「靶核酸」是指寡核苷酸或多核苷酸探針特異性與其雜交的核酸(通常獲自生物樣品且因此也是指為樣品核酸)。可以理解靶核酸可衍生自基本上任意核酸的來源(例如，包括但不限於化學合成，擴增反應，法醫學樣品，等等)。檢測一或多種靶核酸的存在或者缺少，或者測定一或多種靶核酸的量。待檢測的靶核酸優選地具有和與其特異性結合(雜交)的相應探針的核酸序列互補的核苷酸序列。術語靶核酸可指與探針特異性雜交，或希望檢測其豐度(濃度)和/或表達水平的總序列(例如，基因或mRNA)的大的核酸的特異性子序列。
術語「與支持物結合」是指直接或間接地與其結合，包括通過共價鍵，氫鍵，離子相互作用，疏水性相互作用，或其它進行連接。
「可檢測的部分」或「標記的部分」是指能夠通過各種設備和或當部分連接於例如核酸時檢測試驗(包括物理的，化學的，電學的和/或基於計算機的)部分的試驗方法進行檢測的分子或分子的複合體和或粒子。
「基本上結合」是指探針核酸和靶核酸之間的互補雜交並且包含少量的錯配，所述錯配可通過降低雜交介質的嚴格性來獲得以實現靶寡核苷酸或多核苷酸序列的目的檢測。
術語「特異性雜交於」是指當序列存在於複合混合物(例如，總細胞的)DNA或RNA中時，分子優選地在嚴格條件下結合，雙聯或雜交於特定的核苷酸序列。
術語「嚴格條件」是指探針優選地雜交於其靶亞序列，且較小程度的雜交於，或根本不雜交於其它序列的條件。嚴格條件是序列依賴的且在不同的環境中不同。較長序列在較高溫度下特異性雜交。通常，所選嚴格條件為在規定的離子強度和pH下低於特異性序列的熱熔點(Tm)約5℃。Tm是50％互補於靶序列的探針與處於均衡狀態的靶序列雜交的溫度(在規定的離子強度，pH，和核酸濃度下)。(如靶序列通常過量存在，在Tm處，50％的探針處於均衡狀態)。典型地，嚴格條件是其中的鹽濃度至少為約0.01到1.0M Na離子濃度(或其它鹽)，pH 7.0到8.3並且對短探針(例如10到50個核苷酸)而言該溫度至少為約30℃。嚴格條件也可通過添加去穩定劑諸如甲醯胺來實現。
術語「背景」或「背景信號強度」是指標記的靶核酸和寡核苷酸或多核苷酸陣列(例如，寡核苷酸或多核苷酸探針，對照探針，陣列基質，等等)的組分之間的非特異性結合或其它相互作用產生的雜交信號。背景信號也可通過陣列組分自己的固有螢光來產生。單個背景信號可被計算為整個的陣列，或不同的背景信號可計算為陣列的各個區域。在一個優選的實施方案中，背景計算為陣列或陣列區域中最低1％到10％探針的平均雜交信號強度。在表達監控陣列(即，即其中探針被預先選定雜交於特異性核酸(基因))中，可以計算各靶核酸不同的背景信號。當計算各個靶基因的不同背景信號時，計算各基因最低1％到10％的探針的背景信號。當然，本領域的技術人員應能理解當探針與特定基因較好雜交且因此好象特定地結合於靶序列時，它們不應該被用於背景信號計算中。或者，背景可計算為通過雜交於與樣品中發現的所有序列不互補的探針產生的平均雜交信號強度(例如，當樣品是哺乳動物來源時，針對反義核酸或者針對在樣品中未發現的基因，諸如細菌基因的基因的探針)。背景還可以計算為由完全缺少任意探針的陣列區域產生的平均信號強度。
術語「定量測定」當用於測定核酸豐度或濃度(例如，基因的轉錄水平)的上下文中時是指絕對或相對的定量分析。絕對的定量分析可以通過包含已知濃度的一或多種靶核酸(例如，對照核酸諸如BioB或具有已知量的靶核酸本身)以及參照未知與已知靶核酸(例如通過生成標準曲線)的雜交強度來完成。或者，相對的定量分析可通過比較兩種或多種基因之間或兩種或多種處理之間的雜交信號來定量測定雜交強度的變化以及，通過顯示轉錄水平來完成。
核酸標記在本發明的一個方面，通過檢測一或多種連接於樣品核酸的標記來檢測雜交的核酸。標記可以通過本領域技術人員公知的大量任意的方式被摻入。然而，在優選的實施方案中，標記在樣品核酸製備的擴增步驟過程中同時摻入。例如，用標記的引物或標記的核苷酸進行的聚合酶鏈式反應(PCR)將提供標記的擴增產品。核酸(例如DNA)在標記的脫氧核苷酸三磷酸酯(dNTPs)的存在下擴增。擴增的核酸可以被片段化，暴露於寡核苷酸陣列，且通過與陣列相關的標記的量來測定雜交的程度。在優選的實施方案中，轉錄擴增，如上所述，利用標記的核苷酸(例如螢光素標記的UTP和/或CTP)將標記或部分摻入轉錄的核酸中。
或者，標記可以直接添加到最初的核酸樣品(例如mRNA，polyAmRNA，cDNA，等等)中或擴增完成後添加到擴增產物中。這些標記可以導致擴增產物的產量增加以及減少擴增反應需要的時間。將標記連接於核酸的方式包括，例如切口平移或末端標記(例如用標記的RNA)通過核酸的激酶酶解以及隨後將連接樣品核酸的核酸接頭連接於標記(例如，螢光基團)。
在許多應用中，其可用於直接標記核酸樣品而不必通過擴增，轉錄或其它核酸轉化步驟。其尤其適用於當希望從細胞提取總的細胞質RNA或者poly A+RNA(mRNA)並且將這些材料雜交而且無需中間步驟的情況。參見美國專利No.6,344,316，其整體引入作為參考。
末端標記可利用末端轉移酶(TdT)來進行。末端標記還可以通過將標記的核苷酸或寡核苷酸或多核苷酸或其類似物連接於靶核酸或探針的末端來完成。參見美國專利6,344,316。
在本發明的一個方面，描述了末端標記核酸及其有用試劑的方法。在本發明的一個優選的實施方案中，所述方法包括提供核酸，提供標記的核苷酸或寡核苷酸或多核苷酸以及將核苷酸或寡核苷酸或多核苷酸酶促連接到核酸的方法。因此，在本發明的一個方面，其中核酸是RNA時，標記的核糖核苷酸可利用RNA連接酶連接於RNA。RNA連接酶催化單鏈RNA(或DNA，但是與RNA反應更加有效)的5′磷酸基與另一片段RNA(或DNA)的3′-OH末端的共價連接。應用這些酶的特定要求描述在，The Enzymes，XV卷，B部分，T4RNA連接酶，Uhlenbeck和Greensport，第31-58頁；以及Sambrook等，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NewYork(1982)的5.66-5.69中，所有的這些整體引入作為參考。
根據本發明的一個方面，提供了將標記直接添加於核酸(例如提取的RNA)而不是在核酸聚合步驟中將標記插入核苷酸中的方法。根據本發明的一個方面，這些可通過將標記的核糖核苷酸或短的標記寡核糖核苷酸添加於單鏈核酸的末端來完成。
根據本發明的一個方面，RNA標記化合物可直接連接於RNA分子的′3-OH基團而沒有任何分子處理。例如微RNA(miRNAs)是小的非編碼RNAs(大約15-25個核苷酸)的廣義類別。人們相信這些RNAs在基因表達的調控中起作用。例如在線蟲(Caenorhabditis elegans)中，lin-4和let-7miRNAs控制幼蟲發育過程中神經元和真皮細胞的命運特化的時間。Lagos-Quintana M，Rauhut R，Lendeckel W，Tuschl TIdentificationof novel genes coding for small expressed RNAs.Science 2001，294853-858。已廣泛研究了參與植物和動物中miRNAs生物起源的酶促機制。III型RNAse樣Dicer，和Argonaute蛋白一起，裂解miRNA髮夾前體(70到75核苷酸)來由髮夾的一個臂產生穩定的，～22個核苷酸的miRNA。Ke XSLiu CM，Liu DP，Liang CCMicroRNAskey participants in generegulatory networks.Curr OptiChem Biol 2003，7516-523。
本領域的技術人員能夠理解miRNAs具有游離的3』OH基團。因此，本發明的核酸標記分子可直接連接到這些RNAs的末端而沒有mRNA或cRNA所需要的預片段化或去磷酸化。
RNA在Mg2+存在下通過加熱隨機地片段化。這些通常產生具有5′OH基團和磷酸化3′末端的RNA片段。根據本發明的一個方面，鹼性磷酸酶用來由RNA片段的3′末端除去磷酸基。根據本發明的一個方面，包括具有可檢測的部分和具有5′-末端磷酸的核糖核苷酸的供體然後利用T4RNA連接酶被連接於RNA片段的3′OH基團來提供標記的RNA。根據本發明，供體也稱為核酸標記化合物。
T4RNA連接酶通過形成3′到5′磷酸二酯鍵，將ATP為水解AMP和PPi，催化5′磷醯基-末端核酸供體連接於3′羥基-末端核酸受體。儘管微小受體必須是三核苷二磷酸，二核苷焦磷酸(NppN)和單核苷3′，5′-二磷酸(pNp)在分子間反應中是有效的供體。參見Hoffmann和McLaughlin，Nuc.Acid.Res.15，5289-5303(1987)，其內容整體引入作為參考。
適用於本發明的可檢測的標記包括通過分光鏡，光化學，生物化學，免疫化學，電學，光學或化學方法可檢測的任意組合物。本發明中有用的標記包括用標記的鏈黴親和素結合物染色的生物素，磁珠(例如，DynabeadsTM)，螢光染料(例如，螢光素，德克薩斯紅，若丹明，綠色螢光蛋白，等等，參見，例如，Molecular Probes，Eugene，Oregon，USA)，放射性標記(例如，3H，125I，35S，14C，或32P)，酶(例如，辣根過氧化物酶，鹼性磷酸酶以及其它通常用於ELISA的)，以及比色分析標記諸如膠體金(例如，高效率的40-80納米直徑粒度範圍的散射綠光金顆粒)或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯，聚丙烯，乳膠，，等等)磁珠。這些標記應用的專利教導包括美國專利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241。
螢光標記是優選的因為其提供非常強的信號以及低的背景。其通過快速掃描方法可高解析度和高敏感性地進行光學檢測。核酸樣品全部可以用單個標記，例如，單螢光標記進行標記。或者，在另一實施方案中，不同的核酸樣品可以同時雜交，其中各個核酸樣品具有不同的標記。例如，一個靶可以具有綠色螢光標記並且第二靶可以具有紅色螢光標記。掃描步驟將紅色標記結合的位點與綠色螢光標記結合的位點區分開來。每一核酸樣品(靶核酸)可以獨立於其它樣品進行分析。
雜交核酸雜交簡單地包括在探針及其互補靶可以通過鹼基互補配對形成穩定的雜交雙鏈體條件下提供變性探針和靶核酸。然後洗去沒有形成雜交雙鏈體的核酸留下通常通過檢測連接的可檢測的標記或部分檢測的雜交核酸。通常認為通過增加溫度或減少含有核酸的緩衝液的鹽濃度，或添加化學試劑，或提高pH值使核酸變性。在低嚴謹性條件(例如，低溫和/或高鹽和/或高的靶濃度)下，甚至當退火的序列不完全互補時也將形成雜交雙鏈體(例如，DNA:DNA，RNA:RNA，或RNA:DNA)。因此雜交的特異性在較低嚴謹性條件下降低了。相反，在較高嚴謹性條件下(例如，較高的溫度或較低的鹽濃度)成功的雜交要求較少的錯配。
本領域的技術人員能夠理解可選擇雜交條件來提供任意的嚴緊度。在優選的實施方案中，在6X SSPE-T約40℃到約50℃(0.005％TritonX-100)低嚴謹性下進行雜交來確保雜交然後隨後在較高嚴謹性條件(例如，1×SSPE-T 37℃)下進行衝洗來消除錯配的雜交雙鏈體。可在逐漸增加的較高嚴謹性條件(例如，在37℃到50℃降至低至0.25×SSPE-T進行連續衝洗直至獲得理想的雜交特異性。嚴謹性還可以通過添加諸如甲醯胺的試劑來增加。雜交特異性可通過試驗探針的雜交與可存在的不同對照(例如，表達水平對照，正常對照，錯配對照等等)的雜交比較來進行評價。
通常雜交特異性(嚴謹性)和信號強度之間有一個折衷。因此，在優選的實施方案中，在產生一致結果並且提供大於約背景強度的10％的信號強度的最高嚴謹性下進行衝洗。因此，在優選的實施方案中，雜交陣列可在依次提高嚴謹性溶液的條件下衝洗並且在每一衝洗之間進行讀數。由此產生的數據系列的分析將揭示上述的衝洗嚴謹性，即其雜交模式沒有可察覺的改變並且其提供充分的用於特定目的寡核苷酸或多核苷酸探針的信號。
在優選的實施方案中，在雜交過程中通過使用洗滌劑(例如，C-TAB)或阻斷試劑(例如，精子DNA，cot-1DNA，等等)減少背景信號以減少非特異性的結合。在尤其優選的實施方案中，在約0.1到約0.5mg/ml DNA(例如，鯡魚精DNA)存在下進行雜交。阻斷劑在雜交中的應用對於本領域技術人員來說是公知的(參見，例如，上文P.Tijssen中第8章)。
RNAs或DNAs之間形成的雙鏈體在溶液中的穩定性通常次序為RNA:RNA＞RNA:DNA＞DNA:DNA。長探針與靶具有良好的雙鏈體穩定性，但是比較短的探針具有較差的錯配識別力(錯配識別力是指測定的完全匹配的探針和單個鹼基錯配探針之間雜交信號比)。較短的探針(例如，8-聚物)非常好的識別錯配，但是總的雙鏈體穩定性較低。
通過利用寡核苷酸或多核苷酸類似物探針賦予的改變的雙鏈體穩定性可通過下述來確定，例如，與靶寡核苷酸或多核苷酸雜交的寡核苷酸或多核苷酸類似物陣列隨著時間變化的螢光信號強度。數據允許特定雜交條件的優化，例如，室溫(將來用於簡單的診斷應用)。
驗證改變的雙鏈體穩定性的另一方式是通過下面雜交隨時間產生的的信號強度。上述利用DNA靶和DNA晶片的實驗表明信號強度隨時間而增加，而且較穩定的雙鏈體比較不穩定的雙鏈體更快的產生較高的信號強度。一定時間後信號達到平穩狀態或「飽和」，由於所有的結合位點都被佔據。這些數據允許雜交的優化，以及在特定溫度下確定最好的條件。雜交條件的優化方法是本領域技術人員公知的(參見，例如，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，Vol.24Hybridization With Nucleic Acid Probes，P.Tijssen，ed.Elsevier，N.Y.，(1993))。
標記的核苷酸根據本發明的一個方面，T4RNA連接酶用於將核酸標記化合物酶促摻入RNA或片段化RNA群中。T4RNA連接酶通過形成3′到5′磷酸二酯鍵，水解ATP為AMP和PPi，催化5′磷醯基-末端核酸供體連接於3′羥基-末端核酸受體。儘管微小受體必須是三核苷二磷酸，但二核苷焦磷酸(NppN)和單核苷3′，5′-二磷酸(pNp)在分子間反應中是有效的供體。參見，例如，Richardson，R.W.和Gumport，R.I.(1983)，Nuc.AcidRes11，6167-6185和England，T.E.，Bruce，A.G.，和Uhlenbeck，O.C.(1980)，Meth.Enzymo165，65-74，其內容整體引入作為參考。
在本發明的一個方面，公開了在雜交於DNA微陣列之前末端標記片段化RNA(總RNA，mRNA，cRNA或片斷RNA)的方法。系統利用T4RNA連接酶來將3′-生物素化的AMP(或CMP)供體連接於RNA受體分子的3′-末端。T4RNA連接酶催化具有5′-末端磷酸的寡核苷酸或多核苷酸供體分子與具有3′-末端羥基的寡核苷酸或多核苷酸受體分子之間的核苷酸間磷酸二酯鍵的形成。儘管微小受體必須是三核苷酸二磷酸，但二核苷焦磷酸(NppN)和單核苷3′，5′-二磷酸(pNp)在分子間反應中是有效的供體。
這些技術可用於標記RNA靶並且通常利用有效的標記部分和酶。可利用目前的GeneChipArray(Affymetfix，Inc.，Santa Clara，CA)表達方案(除了體外轉錄用標準核苷酸進行)然後去磷酸化以及如本發明公開的連接於合適的核酸標記化合物來產生cRNA。
可檢測的分子可檢測的部分直接或間接地提供信號。當標記基團在適合刺激導入後自發地發射信號，或產生信號時產生直接信號。放射性標記，諸如3H，125I，35S，14C或32p，以及磁性粒子，諸如DynabeadsTM，是直接和自發提供信號的基團的非限制性實例。在刺激物存在下直接提供信號的標記基團包括下列非限制性實例膠體金(40-80nm直徑)，其高效率散射綠光；螢光標記，諸如螢光素，德克薩斯紅，若丹明，和綠色螢光蛋白質(Molecular Probes，Eugene，Oregon)，其吸收和隨後發光；化學發光的或生物發光標記，諸如發光氨，洛粉鹼，吖啶鹽和蟲螢光素，其由於化學或生物反應產生電子刺激且隨後發光；自旋標記物，諸如釩，銅，鐵，錳和硝基氧自由基，其通過電子自旋共振(ESR)光譜法進行；染料，諸如喹啉染料，三芳基甲烷染料和吖啶染料，其吸收特定波長的光；以及有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯，聚丙烯，乳膠，等等)磁珠。參見美國專利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241。
可檢測的部分提供間接信號，其中其與自發發射信號，或在導入適合刺激後產生信號的第二化合物相互作用。
生物素是尤其優選的可檢測部分。生物素通過與鏈黴親和素形成結合物產生信號，然後檢測鏈黴親和素。參見Hybridization With NucleicAcid Probes。在Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology中；Tijssen，P.，Ed.；ElsevierNew York，1993；Vol.24。如在ELISA測定中的酶，諸如辣根過氧化酶或鹼性磷酸酶，其連接於標記-抗體-抗體中的抗體，也產生間接信號。在優選的實施方案中，多信號基團被摻入到核酸標記化合物中。在本發明尤其優選的實施方案中，多生物素基團可增加或增強待檢測的Sig基團的能力。
優選的可檢測部分是螢光基團。螢光基團通常產生高信噪比，由此在檢測過程提供增加的解析度和敏感性。優選地，螢光基團吸收具有高於約300納米的波長，更優選地高於約350納米，且最優選地高於約400納米。通過螢光基團發射的光的波長優選地高於約310納米，更優選地高於約360納米，且最優選地高於約410納米。
螢光可檢測的部分選自各種結構的類別，包括下列非限制性的實例1-和2-氨基萘，p，p′二氨基芪，芘，四級菲啶鹽，9-氨基吖啶，p，p』-二氨基二苯甲酮亞胺，蒽，氧雜羰花青，marocyanine，3-氨基馬萘雌酮，苝，二苯並唑，二-p-噁唑基苯，1，2-苯並吩嗪(benzophenazin)，視黃醇，二-3-氨基吡啶鹽，嚏根苷配基，四環素，sterophenol，苯並咪唑基苯胺，2-氧代-3-色烯(chromen)，吲哚，呫噸(xanthen)，7-羥基香豆素，吩噁嗪，水楊酸酯，毒毛旋花苷配基，卟啉，三芳基甲烷，黃素，呫噸染料(例如，螢光素和若丹明染料)；花青染料；4，4-二氟-4-硼-3a，4a-二氮雜-s-indacene染料和螢光蛋白(例如，綠色螢光蛋白質，藻膽蛋白)。
大量的螢光化合物適用於包括在本發明中。這些化合物的非限制性實例包括丹磺醯氯；螢光素，諸如3，6-二羥基-9-苯基呫噸氫醇；若丹明異硫氰酸酯；N-苯基-1-氨基-8-磺化萘(sulfonatonaphthalene)；N-苯基-2-氨基-6-磺化萘(sulfonatonaphthanlene)；4-乙醯氨基-4-異硫氰酸二苯乙烯-2，2』-二磺酸；芘-3-磺酸；2-甲苯氨基萘(toluidinonapththalene)-6-磺酸酯；N-苯基，N-甲基-2-氨基萘-6-磺酸酯；溴化乙錠；stebrine；auromine-0，2-(9』-anthroyl)棕櫚酸酯；丹磺醯基磷脂醯乙醇胺；N，N′-二-十八烷基氧雜羰花青；N，N′-己二基氧雜羰花青；部花青，4-(3』-芘基)butryate；d-3-氨基脫氧-馬萘雌酮；12-(9′-anthroyl)硬脂酸酯；2-甲基蒽；9-乙烯基蒽；2，2』-(亞乙烯基-p-亞苯基)二苯並唑；p-二[2-(4-甲基-5-苯基噁唑基)]苯；6-二甲氨基-1，2-苯並吩嗪(benzophenzin)；視黃醇；二(3』-氨基吡啶)-1，10-decandiyl二碘化物；嚏根苷配基的磺基萘基腙(sulfonaphthylhydrazone of hellibrienin)；金黴素；N-(7-二甲氨基-4-甲基-2-氧代-3-色烯基)馬來醯亞胺；N-[p-(2-苯並咪唑基)苯基]馬來醯亞胺；N-(4-氟蒽基)馬來醯亞胺；二(高香草酸)；刃天青(resazarin)；4-氯代-7-硝基-2，1，3-苯並噁二唑；部花青540；試滷靈；玫瑰紅和2，4-二苯基-3(2H)-呋喃酮。優選地，螢光可檢測的部分是螢光素或若丹明染料。
另一個優選的可檢測部分是膠體金。膠體金顆粒通常直徑為40到80納米。膠體金可以各種方式連接於標記化合物。在一個實施方案中，核酸標記化合物的接頭部分端接硫醇基團(-SH)，且硫醇基團通過配價鍵直接結合於膠體金。參見Mirkin等，Nature 1996，382,607-609。在另一個實施方案中，其間接地連接，例如通過抗生物素的膠體金共軛物和生物素醯化的標記化合物之間的相互作用。金標記化合物的檢測可通過使用銀增強方法來增強。參見Danscher等，J.Histotech 1993，16，201-207。
根據本發明，提供了檢測目的RNA存在的方法，該方法具有下列步驟提供可能具有或可能不具有所述目的RNA的樣品；將RNA連接於具有下式的標記試劑 其中B為雜環鹼基部分；X為允許核酸標記化合物連接到所述片段的3′OH基團的官能團；Y選自-H，-OH，-OR，-SR，-NHR或滷素；L為接頭基團；並且Sig為提供給標記RNAs的可檢測的部分；提供具有針對所述目的RNA的探針的核酸陣列；將標記RNAs雜交於所述的核酸陣列；以及測定所述探針雜交的程度以測定所述目的RNA的存在。
在本發明的上述方面，RNA包括microRNA。對於較長的RNAs諸如cRNAs或mRNAS而言，該方法可進一步地包括用片段化試劑處理樣品來提供RNA片段的步驟；以及在提供所述樣品的步驟之後和所述連接步驟之前除去所述片段的磷酸基來提供具有游離的3′OH基團的片段。3′磷酸基為片段化試劑諸如Mg或RNAseIII的通常產物。磷酸基必須被去除以允許連接酶添加核酸標記化合物。因此，在本發明的這些方面，mRNA和cRNA是優選的。然而，可以理解microRNAS不具有3′磷酸基並且它們很短，小於25個核苷酸。因此，它們不需要片段化或磷酸酶處理。
優選的片段化試劑選自RNAse III和含有二價金屬離子諸如Mg2+以及具有中性到鹼性範圍的pH的緩衝液。可用鹼性磷酸酶由3′羥基除去磷酸基。
X優選地選自具有適量的選自H+，Li+，Na+，NH4+或K+的相反離子的HO-，PO42--，P2O73--，P3O104--，OP(S)O22-以及腺苷酸-(5′)-P2O7＝-。Y優選地為OH。連接酶優選地為T4RNA連接酶。優選地核酸陣列為寡核苷酸陣列。更優選地，寡核苷酸陣列通過光刻法製備。
接頭基團優選地選自-CH2-CH(OH)-CH2-(O-CH2-CH2)3-O-CH2-CH2-CH2-NH-和-CH2-CH(OPO3＝)-CH2-(O-CH2-CH2)3-O-CH2-CH2-CH2-NH-。更優選地，L為-CH2-CH(OH)-CH2-(O-CH2-CH2)3-O-CH2-CH2-CH2-NH-。
根據本發明的一個方面，X為PO42-。B選自嘧啶鹼基，嘌呤鹼基，天然的鹼基類似物以及非天然類似物。更優選地，B選自腺嘌呤，鳥嘌呤，胞嘧啶和尿嘧啶。更優選地，B選自腺嘌呤和胞嘧啶。最優選地，B為胞嘧啶。
優選的標記試劑為 其中R為H或PO32-。優選地R為H。另一種優選的標記試劑為
其中R為H或PO32-。優選地R為H。
另一個優選的標記試劑為下列結構 其中B選自腺嘌呤，鳥嘌呤，胞嘧啶和尿嘧啶；且R為H或PO3＝。更優選地，B選自腺嘌呤和胞嘧啶且R為H。更優選地B為腺嘌呤。在另一個優選的實施方案中，B為胞嘧啶且R為H。
一種優選的檢測目的RNA存在的方法，具有下列步驟提供可能具有或可能不具有所述目的RNA的樣品；將所述RNA連接於具有下式的標記試劑 其中B為雜環的部分；且R選自H和PO3＝以及n為1到6；提供具有對應於所述目的基因的探針的核酸陣列；將標記的核酸片段雜交於核酸陣列；以及確定所述探針雜交的程度來確定所述目的RNA的存在。上述方法中，microRNAs是優選的。
在優選的實施方案中，方法進一步地包括用片段化試劑處理樣品來提供RNA片段的步驟；以及在提供所述樣品的步驟之後和所述連接步驟之前除去所述片段的磷酸基來提供具有游離的3』OH基團的片段。對於這些方法而言，優選地mRNAs和cRNAs作為模板。
優選地，片段化試劑選自包含RNAse III和含有二價金屬離子諸如Mg2+以及具有中性到鹼性範圍的pH的A緩衝液。由3′羥基除去磷酸基優選地用鹼性磷酸酶進行。
B優選地選自腺嘌呤，鳥嘌呤，胞嘧啶和尿嘧啶；且n為2到4。更優選地，B選自腺嘌呤和胞嘧啶。最優選地B是胞嘧啶，n優選地為2-4。更優選地，n為3。
優選的標記試劑如下
以及
其它優選的標記試劑如下 以及 本發明也提供了核酸標記化合物。一個優選的化合物如下 其中B是雜環的鹼基部分；X是允許核酸標記化合物連接於所述片段的3′OH基團的官能團；Y選自-H，-OH，-OR，-SR，-NHR，或滷素；L是接頭基團；且Sig是可檢測的部分。
L優選地選自-CH2-CH(OH)-CH2-(O-CH2-CH2)3-O-CH2-CH2-CH2-NH-和-CH2-CH(OPO3＝)-CH2-(O-CH2-CH2)3-O-CH2-CH2-CH2-NH-。
更優選地L為CH2-CH(OH)-CH2-(O-CH2-CH2)3-O-CH2-CH2-CH2-NH-。
X優選地選自具有適量選自H+，Li+，Na+，NH4+或K+的相反離子的-HO-，pO42--，P2O73--，P3O104--，OP(S)O22-和腺苷酸-(5』)-P2O7＝。Y優選地為OH。B選自嘧啶鹼基，嘌呤鹼基，天然鹼基類似物以及非天然類似物。更優選地，B選自腺嘌呤，鳥嘌呤，胞嘧啶和尿嘧啶。更優選地，B選自腺嘌呤和胞嘧啶。進一步優選地，B為胞嘧啶。
在本發明的優選的核酸標記化合物中，該化合物具有結構 L是接頭且Sig是可檢測的部分；B1是腺嘌呤且B選自腺嘌呤，鳥嘌呤，胞嘧啶和尿嘧啶。
根據權利要求44的核酸標記化合物具有下式 其中B1為腺嘌呤，且B選自腺嘌呤，鳥嘌呤，胞嘧啶和尿嘧啶；
且R為H或PO3＝。
根據上式的優選化合物，具有結構 根據本發明又一個優選的化合物，具有通式 其中B是雜環的鹼基部分，L1是第一接頭，L2是第二接頭，Sig是可檢測部分且n是從1到6的整數。
本發明該方面優選的化合物，具有下式結構 其中B為雜環的鹼基部分；且R選自H和PO3＝。
本發明將通過下列非-限制性的實施例被進一步理解。
實施例15′-pCp-3′-接頭-生物素和5′-pAp-3′-接頭-生物素的合成方法這些化合物是利用市售的試劑通過固相亞磷醯胺化學法製備的。參見，例如，美國專利4,415,732；McBride，L.和Caruthers，M.Tetrahedron Letters，24245-248(1983)；和Sinha，N.等，Nuc.AcidsRes.124539-4557(1984)，其中兩者都引入作為參考。3′-生物素醯化的接頭獲自市售的BiotinTEG固相支持體(Glenn Research，Sterling，Virginia)。試劑的結構顯示如下生物素-TEG合成支持體 六乙二醇(HEG)亞磷醯胺 生物素-TEG亞磷醯胺 5′-磷酸-ON亞磷醯胺
實施例23′-AppC-3′-接頭-生物素供體分子的合成方法前-腺苷酸焦磷酸供體，A(5』)pp(5』)Cp(生物素-TEG)-3′通過根據文獻方法(7)進行的p(5′)Cp(生物素-TEO)-3′和腺苷酸-5′-單磷酸醯嗎啉(Sigma)的溶液-相凝濃縮(圖2)來進行製備。通過反相然後離子交換HPLC純化產物至＞95％純度，且特徵為MALDI-TOF MS。
實施例3對照和樣品的製備根據建議的GeneChip表達方案(Affymetrix，Inc.，Santa Clara，CA)由總RNA(1μg的人心臟RNA作為在這些數據中的初始物質)製備未標記的cRNA，除了未標記的核糖核苷酸用於體外轉錄外。在典型的反應中，將10微克的cRNA在標準片段化緩衝液(40mM Tris-乙酸，30mM醋酸鎂，100mM醋酸鉀)中片段化以及用0.01U/μl終濃度的蝦鹼性磷酸酶(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)進行去磷酸化。然後在65℃加熱蝦鹼性磷酸酶15分鐘滅活，以及通過乙醇沉澱法純化反應。將片段化的cRNA置入含有100μM 3′生物素-CMP與2U/μl T4RNA連接酶(New England Biolabs，Beverly，MA)和16％PEG的推薦緩衝液的連接反應中37℃2小時。連接反應然後添加至含有0.5mg/ml乙醯化BSA(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)，0.1mg/ml鯡魚精DNA(Promega，Madison，WI)，50pM Oligo B2(AffymetrixInc.，Santa Clara，CA)和1×真核生物雜交對照(Affymetrix Inc.)的雜交混合物中，使得總體積為220μl。200μl標記的cRNA靶與Affymetrix HuU95Av2陣列在45℃雜交16小時。標準的衝洗和染色方案如基因晶片表達分析技術手冊(GeneChip Expression Analysistechnical manual)所建議的。利用Affymetrix Microarray Suite 4.0進行分析。
圖1顯示了存在呼叫百分比以及末端標記的RNA和內部標記RNA的平均-平均差異。平均-平均差異是微陣列上完全匹配探針強度減去錯配探針的強度的除以所有探針集合，並且是所有信號強度的測定。存在呼叫百分比是基於基因探針系列強度的MicroArray Suite(Affymetrix，Inc.，Santa Clara，CA)軟體計算的結果。二者是標記效率和RNA完整性的計量標準。利用連接法比利用內部-標記RNA產生更多數目的基因稱作存在。此外，螢光信號(如通過平均平均差異測定的)高於連接法。
為了試驗連接標記法的再現性，由總的人心臟RNA開始利用建議的GeneChip(Affymetrix，Inc.，Santa Clara，CA)表達方案進行四個獨立反應，除了未標記的核糖核苷酸用於體外轉錄。產生的45μg cRNA被片段化並且在一式兩份51μl反應中用0.01/μl終濃度的蝦鹼性磷酸酶37℃處理1小時。然後在65℃加熱滅活蝦鹼性磷酸酶15分鐘，並且用乙醇沉澱法純化反應。用2U/μl T4RNA連接酶和16％PEG在一式兩份33μl反應中37℃將11μg片段化的，去磷酸cRNA連接於100μM的3』生物素-CMP。然後將每一33μl連接反應物添加至含有0.5mg/ml乙醯化BSA(Invitrogen Life Technologies)，0.1mg/ml鯡魚精DNA，50pM Oligo B2和1×真核生物雜交對照的雜交混合物中，使總體積為200μl。200μl標記的cRNA靶在45℃雜交於HuU95Av2陣列(Affymetrix，Inc，Santa Clara，CA)16小時。如基因晶片表達分析技術手冊(Affymetrix，Inc.Santa Clara，CA)所建議的進行標準的衝洗和染色方案。利用Micmarray Suite Version 4.0(Affymetrix，Inc.SantaClara，CA)進行分析。
定量比較來自重複反應的表達數據產生重複之間0.98-0.99的相關係數(R2)，表明末端標記法的高再現性。末端標記重複與內部-標記RNA的比較產生0.88-0.94之間的R2值。
實施例4表1概括了本發明的核酸標記試劑(其也更具體的描述在上文中)並且也提供了活當的縮寫(PLR＝RNA標記試劑)

實施例5RLR-4a和RLR-4b的連接效率此實驗的目的是證明連接-介導的標記的概念以及測定兩個不同RNA標記試劑(RLRs)的標記效率RLR-4a，(5』pAp-TEG-生物素-3』)和RLR-4b，(5』-pA5p-TEG-生物素-3′)[10]。測定RLR濃度(1μM到250μM)和T4RNA連接酶濃度(1U/μl到4U/μl)以及連接時間(4小時和8小時)。沒有T4RNA連接酶的一個反應用作陰性對照。另一個連接反應省略cRNA去磷酸化步驟以便測定去磷酸化作用的要求。所有反應用人心臟RNA(Ambion)進行並且在標準條件(10μg標記的cRNA在1×雜交液[100mM MES，1M Na+，20mM EDTA，0.01％Tween20]45℃，60rpm雜交16小時)下雜交於人U95Av2陣列。衝洗陣列，染色(利用單一染色方案)，並且根據標準的Affymetrix方案掃描。
下列是測定每一RLR化合物的濃度50μM，10μM和1μM。在30℃用2U/μl T4RNA連接酶(New England Biolabs)進行連接4小時。一個RELA樣品沒有用蝦鹼性磷酸酶處理並且沒有用RLR-4a在50μM進行連接用於比較。
信號(AvgAvgDifference)和存在呼叫率(％P)通過獨立地增加RLR濃度和T4RNA連接酶濃度而提高。通過增加RLR濃度以及酶濃度獲得最好的操作。單核苷酸RLR-4a在相同的濃度始終好於五-聚體，五核苷酸RLR-4b。溫育4小時和溫育8小時之間沒有觀察到顯著的差異。如在50μM RLR-4a非-SAP處理的樣品中通過低信號和存在呼叫的數量所證明的cRNA的去磷酸化為有效連接所必需。所有陣列的背景強度是類似的。在此階段，最佳的反應條件是250μM RLR-4a，4U/μl T4RNA連接酶，30℃，4小時。此實驗證明了用於DNA微陣列的末端標記RNA的活力。
實施例6RLR-5的連接效率然後測定了在連接反應中RLR-5(5′-pCp-TEG-生物素-3』)濃度的範圍。在文獻中，5′-[32p]pCp-3′被公認為是大多數放射標記條件下的優選供體分子[5]。我們測定了在20℃下列RLR-5濃度的範圍50μM，100μM，250μM，500μM和1000μM。此外，兩個250μM RLR-5反應溫育在30℃和37℃用來與20℃反應溫度比較。利用人心臟RNA，2U/μl T4RNA連接酶和16％PEG進行連接反應2小時。
所有的RLR-5樣品與標準相比產生相同的或更好的信號。100μMRLR-5樣品產生最高的信號，但是這些差異可能在實驗誤差範圍內。在250μM RLR-5樣品的20℃，30℃和37℃溫育溫度之間的信號沒有顯著性差異。然而，250μM RLR-5的37℃溫育在所有測定條件中產生最好的總存在呼叫率。50μM-250μM之間的RLR-5濃度與標準相比產生相同的或更好的存在呼叫率；如通過稍微低的存在呼叫所證明的，大於或等於500μM的RLR-5濃度可能是稍微抑制性的，儘管信號強度仍保持很高。這些實驗證明RLR-5稍微優於RLR-4a在50μMRLR濃度，16％PEG和20℃，RLR-5比RLR-4a具有較高的信號和存在呼叫(50μM RLR-4a，16％PEG，20℃32.0％p，104未測定信號；93測定的信號)。
標準方法和RELA方法之間的R2相關係數為0.93-0.94的範圍。不同連接反應之間的R2相關係數為0.97-0.99的範圍，其與標準標記法的差異是類似的。
實施例7RLR-6的連接效率在本實驗中，我們測定了RLR-6(A(5′)pp(5′)Cp-TEG-生物素-3′)腺苷酸化的供體中間體，在連接反應的不同濃度中的特性。我們也測定了反應的動力學，比較連接時間，RLR濃度和酶濃度對陣列特性的影響。下列七個反應是利用人心臟RNA在U95Av2陣列上進行的1)標準(內部-標記的cRNA)2)50μM RLR-620min.2.0U/μl T4RNA連接酶3)100μM RLR-6 20min.2.0U/μl T4RNA連接酶4)200μM RLR-6 20min.2.0U/μl T4RNA連接酶
5)100μM RLR-65min.2.0U/μl T4RNA連接酶6)100μM RLR-6120min. 2.0U/μl T4RNA連接酶7)100μM RLR-620min. 0.5U/μl T4RNA連接酶僅僅20分鐘後，100μM和200μM濃度的RLR-6與2U/μl T4 RNA連接酶與標準相比產生相同的或更好的信號。在100μM RLR-6反應物中信號隨反應時間由5分鐘增加到20分鐘到120分鐘而增加。類似地，信號隨RLR-6濃度在20分鐘連接時間內由50μM增加到100μM到200μM而增加。用100μM RLR-6，2U/μl T4RNA連接酶，120分鐘反應獲得最好的信號；所述信號與0.93的R2相關係數的標準的信號良好相關。用200μM，20分鐘連接獲得其次好的信號，其與標準相比具有0.94的R2相關係數。
關於酶濃度，利用0.5U/μl T4RNA連接酶，或四分之一的正常量，降低了一半的信號。存在呼叫結果與所述信號產生相同的傾向。除5分鐘反應和0.5U/μl連接酶反應之外，所有反應與標準的相比產生相同的或更好的存在呼叫。產生最好的總結果的條件是100μMRLR-6，2U/μl T4RNA連接酶，2小時反應。次好的結果來自200μM，20分鐘反應，其具有類似的存在呼叫但是稍微減慢的信號。
我們也測定了在用RLR-6的連接反應中對ATP的要求。因為RLR6是預-腺苷酸化供體分子，ATP在連接反應中不應該是必需的且可能被抑制[7]。的確，上述反應在沒有ATP條件下進行，證明了ATP不是用RLR-6進行有效連接所必需的。我們發現ATP的存在的確具有輕微的抑制作用。
實施例8連接反應添加劑在本實驗中，我們設法通過添加已知增強涉及核酸的不同的酶促反應的物質來增加連接效率。文獻中的報導表明添加劑，諸如BSA，DMSO和PEG可提高對於一些底物的效率[11，12]。由片段化的，去磷酸化的人心臟cRNA開始，我們用下列添加劑測定了連接1)10μg/ml BSA，2)10％DMSO，3)16％PEG 8000，4)沒有添加劑(對照)。四個反應用2U/μl T4RNA連接酶(來自NEB)和50μM RLR 4a(亞最佳的連接條件)進行。利用Promega T4RNA連接酶無添加劑的第五個連接反應用於對比比較。連接反應物在標準條件下雜交於U95Av2陣列。
三個添加劑中，僅僅PEG在陣列特性方面對連接效率有顯著的影響。與沒有添加劑的對照相比較添加16％PEG顯著地增加了總信號強度以及存在呼叫百分比。如通過較低的信號強度和較低的存在呼叫率所證明，BSA似乎是阻礙連接。DMSO對信號或存在呼叫率沒有影響。在酶特性方面，NEB T4RNA連接酶比Promega形式更加有效，其在所有測定條件中具有最小的信號和存在呼叫率。
我們開始鑑別連接反應中的最佳PEG濃度。如同上述的優化實驗一樣，我們測定亞最佳條件下的連接來辨別不同測定條件之間的細微差異。連接反應用2U/μl T4RNA連接酶和50μM RLR-4a 20℃在下列PEG濃度下進行2小時0％，10％，16％，和25％。我們也測定了較高濃度的RLR-4a，179μM，加上或減去16％PEG。連接反應物在標準條件下雜交於U95Av2陣列。
在連接反應中增加PEG濃度增加了信號和存在呼叫百分比。在50μM RLR-4a子集內，用25％PEG連接反應獲得最好的信號。在存在呼叫方面，16％PEG和25％PEG連接產生相同的結果，超過標準的存在呼叫百分比約2％。PEG的添加證明了甚至在最好的RLR-4a測定濃度，179μM處是有益的。與「無PEG」對照相比，16％PEG的添加增加信號1.3倍並且存在呼叫增加了幾乎6％。由於PEG溶液的高粘度，我們發現16％PEG的終濃度增強了陣列特性且是易處理的。
實施例9RNA片段化測定Mg2+水解參數為了優化陣列特性，我們研究了不同的片段化緩衝液以及片段長度對陣列特性的影響。對於RELA方法我們測定了片段長度，陣列強度以及檢測靈敏度之間的關係。
因為下遊連接反應受片段化緩衝液的影響，我們研究了具有較低單價離子濃度和替代陽離子組分的緩衝液。按照標準的表達方案由HeLa總RNA製備標記和未標記的cRNA。利用Mg2+和高溫加熱在下述緩衝液中使標記和未標記的cRNAs片段化a)5×＝200mM Tris-醋酸，pH 8.1，150mM MgOAc，500mM KOAc(Affymetrix standard)b)5×＝200mM Tris，150mM MgOAc，pH 8.2c)5×＝200mM Tris，150mMMgCl2，pH 8.2。片段化的未標記cRNA利用蝦鹼性磷酸酶在37℃去磷酸1小時；然後在65℃加熱-失活15分鐘。在含有2U/μl T4RNA連接酶，16％PEG的反應中用100μM RLR-6在37℃末端標記去磷酸化的，片段化的cRNA兩個小時。所有反應中，10微克的標記的cRNA雜交於U133A陣列並且根據標準的抗體擴增方案進行處理。
對於RELA和STD二者而言，MgOAc對於最佳總信號強度和存在呼叫量優於MgCl2。到目前為止，用Affymetrix商用緩衝液進行的標準的cRNA片段化是最好的。用修飾的緩衝液進行的標準tRNA的片段化顯著地降低了存在呼叫量和信號強度。對於RELA樣品而言，不同的待測片段化緩衝液之間的存在呼叫率沒有顯著差異。然而，用含有MgOAc的緩衝液片段化的RELA樣品比用MgCl2緩衝液片段化的樣品具有較高的信號。
實施例10多生物素進行末端標記RLR-7，RLR-8和RLR-9根據本發明的一個方面，Sig部分可具有許多生物素殘基。根據本發明，已經發現將具有多生物素殘基的核酸標記化合物用於末端標記RNA具有增加靶RNA信號以及檢測靈敏度的潛在可能。然而，原始數據表明可摻入到Sig部分中並且用於末端標記RNA用於如本發明描寫的檢測目的的生物素殘基的數目是有限的。
關於對可用於摻入供體分子的生物素部分的數目的可能的限制，合成了稱作RLR-7的具有連接於核糖3′位置的五個TEG-生物素(5′-pCp-(TEG-生物素)5-3′)的供體分子。在預試驗中，RNA用RLR 7標記並雜交於GeneChip陣列在此實驗中產生異常的雜交結果。用RLR-7標記的RNA的總雜交模式有點類似於具有一個生物素的標準的以及RLR-5的模式。然而，在很多情況下，RLR-7雜交未發生在其中信號應該存在的區域並且照亮了在標準中不存在的區域。這些RLR-7的初始數據的重要性目前是未知的。
製備具有少於五個生物素部分的供體分子RLR-8(2個生物素)，以及RLR-9(3個生物素)。RLR-9產生最好的未測定的信號強度。然而，背景強度隨信號增加相應地增加。在進行的預試驗中，RLR-9與檢測的其它RNA標記試劑特性相當。儘管具有最高的背景，RLR-9與RLR-5和RLR-相比具有最高的存在呼叫總量。
實施例11PEG優化在本實驗中，我們開始鑑定連接反應中的最佳PEG濃度。如同上述的優化實驗一樣，我們測定了亞最佳條件下的連接來辨別不同測定條件之間的細微差異。連接反應用2U/μl T4RNA連接酶和50μMRLR-4a 20℃在下列PEG濃度下進行2小時10％，16％和25％。我們也測定了較高濃度的RLR4a，179μM，加上或減去16％PEG。連接反應物在標準條件下雜交於U95Av2陣列。
在連接反應中增加PEG濃度增加了信號和存在呼叫百分比。在50μM RLR-4a子集內，用25％PEG連接反應獲得最好的信號。在存在呼叫方面，16％PEG和25％PEG連接產生相同的結果，超過標準的存在呼叫百分比約2％。PEG的添加證明了甚至在最好的RLR-4a測定濃度，179μM處是有益的。與「無PEG」對照相比，16％PEG的添加使信號增加了1.3倍並且使存在呼叫增加了幾乎6％。由於PEG溶液的高粘度，我們發現16％PEG的終濃度增強了陣列特性且是易處理的。
實施例12核糖核酸酶III片段化cRNA的陣列特性在此實驗中，我們測定了RELA方案內(RNA末端標記分析)RNA片段化的兩種不同方法與標準方法的比較。先前，凝膠遷移試驗揭示了Mg2+-水解的RNA利用T4RNA連接酶不能有效地連接。因此，我們改用RNase III進行降解的替代片段化方法。我們用每10微克的cRNA，1單位的酶在37℃降解RNA共35分鐘；然後在65℃加熱滅活RNase III酶20分鐘。然後，利用蝦鹼性磷酸酶對片段化的RNA去磷酸化並且用T4RNA連接酶連接於RLR-5。
對於三個反應而言，我們測定了組合RNase降解和去磷酸化作用步驟來減少試驗的持續時間。從現在起，我們將這些反應稱為「兩步」反應因為RELA方案被基本上減少為兩步1)片段化與去磷酸化作用，2)連接。對於這些反應而言，片段化和去磷酸化作用同時進行35或40分鐘，然後在65℃加熱失活兩種酶20分鐘。基於上述這些較高的溫度提高了識別力的發現一些靶在50℃雜交。所有的反應進行一式兩份並且根據標準方案雜交於U133A陣列。
RNase片段化顯著地提高了信號強度。在RELA方案內，RNase降解比Mg2+-水解的cRNA提高了2倍係數的強度。這與表明RNase-降解的RNA是比Mg2+-水解的RNA更有效地連接的凝膠遷移結果一致。與標準方案相比，RNase片段化的信號增加了大約1.2倍。RNase-降解的靶在50℃對比45℃的雜交，45℃時的信號強度降低5-10％，但是這些信號仍然高於在45℃雜交的標準的那些信號強度。兩步反應如同利用RELA方案的標準方式製備一樣來進行，信號＞＝240。
上述引用的參考文獻的部分列舉1.England TE，Uhlenbeck OC3′-terminal labelling of RNA with T4RNA ligase.Nature 1978，275560-561.
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上述的參考文獻引入作為參考。
可以理解在這裡描述的實施例和實施方案僅僅用於說明性的目的，且本領域的技術人員能夠進行不同的修飾或改變並且包括在此申請的精神和範圍以及附加權利要求的範圍之中。所有在這裡引用的公開物、專利和專利申請都引入作為通用的參考。
權利要求
1.一種檢測目的RNA的存在的方法，所述方法包括下列步驟提供包括其可能具有或可能不具有所述目的RNA的RNA的樣品；將所述RNA連接於具有下式的標記試劑 其中B是雜環部分；X是允許核酸標記化合物連接於所述片段的3′OH基團的官能團；Y選自-H，-OH，-OR，-SR，-NHR，或滷素；L是接頭基團；並且Sig是提供標記的RNAs的可檢測部分；提供具有針對所述目的RNA的探針的核酸陣列；將標記的RNAs雜交於所述核酸陣列；以及測定所述探針的雜交程度來確定所述目的RNA的存在。
2.根據權利要求1的方法，其中所述RNA包括microRNA。
3.根據權利要求1的方法，進一步地包括用片段化試劑處理所述樣品來提供RNA片段的步驟；以及在提供所述樣品的步驟之後和所述連接步驟之前除去所述片段的磷酸基來提供具有游離的3′OH基團的片段的步驟。
4.根據權利要求3的方法，其中所述片段化試劑選自RNAse III和含有諸如Mg2+的二價金屬離子以及具有中性到鹼性範圍pH的緩衝液。
5.根據權利要求3的方法，其中所述由3』羥基除去磷酸基的步驟是用鹼性磷酸酶進行的。
6.根據權利要求1的方法，其中X選自具有選自H+，Li+，Na+，NH4+或K+的相反離子的HO-，PO42--，P2O73--，P3O104--，OP(S)O22-以及腺苷-(5』)-P2O7=-。
7.根據權利要求1的方法，其中Y為F。
8.根據權利要求3的方法，其中所述RNA包括mRNA。
9.根據權利要求3的方法，其中所述RNA包括cRNA。
10.根據權利要求1的方法，其中所述連接酶為T4RNA連接酶。
11.根據權利要求1的方法，其中Y為-OH。
12.根據權利要求1的方法，其中所述核酸陣列為寡核苷酸陣列。
13.根據權利要求12的方法，其中所述核酸陣列由光刻法製備而來。
14.根據權利要求1的方法，其中所述接頭基團選自-CH2-CH(OH)-CH2-(O-CH2-CH2)3-O-CH2-CH2-CH2-NH-和-CH2-CH(OPO3=)-CH2-(O-CH2-CH2)3-O-CH2-CH2-CH2-NH-。
15.根據權利要求14的方法，其中L為-CH2-CH(OH)-CH2-(O-CH2-CH2)3-O-CH2-CH2-CH2-NH-。
16.根據權利要求1的方法，其中X為PO4=。
17.根據權利要求1的方法，其中B選自嘧啶鹼基，嘌呤鹼基，天然鹼基類似物以及非天然類似物。
18.根據權利要求17的方法，其中B選自腺嘌呤，鳥嘌呤，胞嘧啶和尿嘧啶。
19.根據權利要求18的方法，其中B選自腺嘌呤和胞嘧啶。
20.根據權利要求19的方法，其中B為胞嘧啶。
21.根據權利要求1的方法，其中所述標記試劑含有下列結構 其中R為H或PO32-。
22.根據權利要求21的方法，其中R為H。
23.根據權利要求1的方法，其中所述標記試劑含有下列結構 其中R為H或PO32-。
24.根據權利要求21的方法，其中R為H。
25.根據權利要求1的方法，其中所述標記試劑含有下列結構 其中B選自腺嘌呤，鳥嘌呤，胞嘧啶和尿嘧啶；R為H或PO3=。
26.根據權利要求25的方法，其中B選自腺嘌呤和胞嘧啶且R為H。
27.根據權利要求26的方法，其中B為腺嘌呤。
28.根據權利要求26的方法，其中B為胞嘧啶。
29.檢測目的RNA的存在的方法，所述方法包括下列步驟提供包括其可能具有或可能不具有所述目的RNA的RNA的樣品；將所述RNA連接於具有下式的標記試劑 其中B為雜環部分；且R選自H和PO3=並且n為1到6；提供具有對應於所述目的基因的探針的核酸陣列；將標記的核酸片段雜交於核酸陣列；以及測定所述探針的雜交程度來確定所述目的RNA的存在。
30.根據權利要求29的方法，其中所述RNA包括microRNA。
31.根據權利要求29的方法，進一步地包括用片段化試劑處理所述樣品來提供RNA片段的步驟；以及在提供所述樣品的步驟之後和所述連接步驟之前除去所述片段的磷酸基來提供具有游離3′OH基團的片段的步驟。
32.根據權利要求31的方法，其中所述片段化試劑選自RNAse III和含有諸如Mg2+的二價金屬離子以及具有中性到鹼性範圍pH的緩衝液。
33.根據權利要求31的方法，其中所述由3′羥基除去磷酸基的步驟是用鹼性磷酸酶進行的。
34.根據權利要求29的方法，其中所述RNA包括microRNA。
35.根據權利要求29的方法，進一步地包括用片段化試劑處理樣品來提供RNA片段的步驟；以及在提供所述樣品的步驟之後和所述連接步驟之前除去所述片段的磷酸基來提供具有游離的3′OH基團的片段。
36.根據權利要求31的方法，其中所述片段化試劑選自RNAse III和含有諸如Mg2+的二價金屬離子以及具有中性到鹼性範圍pH的緩衝液。
37.根據權利要求31的方法，其中所述由3′羥基除去磷酸基的步驟是用鹼性磷酸酶進行的。
38.根據權利要求27的方法，其中B選自腺嘌呤，鳥嘌呤，胞嘧啶和尿嘧啶，且n為2到4。
39.根據權利要求34的方法，其中B選自腺嘌呤和胞嘧啶。
40.根據權利要求35的方法，其中B為胞嘧啶。
41.根據權利要求34的方法，其中n為3。
42.根據權利要求1的方法，其中所述標記試劑選自 和
43.根據權利要求29的方法，其中所述標記試劑為 或 且其中R為H或PO32-。
44.具有下式的核酸標記化合物 其中B是雜環的鹼基部分；X是允許核酸標記化合物連接於所述片段的3′OH基團的官能團；Y選自-H，-OH，-OR，-SR，-NHR，或滷素；L是接頭基團；且Sig是可檢測的部分。
45.根據權利要求44的化合物，其中L選自-CH2-CH(OH)-CH2-(O-CH2-CH2)3-O-CH2-CH2-CH2-NH-和-CH2-CH(OPO3=)-CH2-(O-CH2-CH2)3-O-CH2-CH2-CH2-NH-。
46.根據權利要求45的化合物，其中L為CH2-CH(OH)-CH2-(O-CH2-CH2)3-O-CH2-CH2-CH2-NH-。
47.根據權利要求44的化合物，其中X選自具有選自H+，Li+，Na+，NH4+或K+的相反離子的HO-，PO42--，P2O73--，P3O104--，OP(S)O22-以及腺苷-(5』)-P2O7=-。
48.根據權利要求44的化合物，其中Y為氟。
49.根據權利要求44的化合物，其中B選自嘧啶鹼基，嘌呤鹼基，天然鹼基類似物以及非天然類似物。
50.根據權利要求45的化合物，其中B選自腺嘌呤，鳥嘌呤，胞嘧啶和尿嘧啶。
51.根據權利要求50的化合物，其中B選自腺嘌呤和胞嘧啶。
52根據權利要求47的化合物，其中B為胞嘧啶。
53.根據權利要求44的核酸標記化合物，具有下式結構 其中L是接頭且Sig是可檢測的部分；B1是腺嘌呤且B選自腺嘌呤，鳥嘌呤，胞嘧啶和尿嘧啶。
54.根據權利要求44的核酸標記化合物，具有下式結構 其中B1為腺嘌呤，且B選自腺嘌呤，鳥嘌呤，胞嘧啶和尿嘧啶；R為H或PO3=。
55.根據權利要求44的核酸標記化合物，具有下式結構
56.下式的核酸標記化合物 其中B是雜環的鹼基部分，L1是第一接頭，L2是第二接頭，Sig是可檢測部分並且n是從1到6的整數。
57.根據權利要求56的核酸標記化合物，具有下式結構 其中B為雜環的鹼基部分；n是由1到6的整數，並且R選自H和PO3=。
58.根據權利要求56的核酸標記化合物，具有下式結構
59.根據權利要求56的核酸標記化合物，具有下式結構
60.根據權利要求56的核酸標記化合物，具有下式結構
全文摘要
在本發明的一個方面，提供了末端標記RNA(總RNA，mRNA，tRNA或片段化的RNA)的方法。在本發明的一個方面，T4RNA連接酶用於將3』－標記的AMP或CMP供體連接於RNA受體分子。在另一實施方案中，焦磷酸分子3′－AppN－3′－接頭－可檢測部分被用作供體分子。在本發明的另一個方面，提供了檢測樣品中目的RNA的存在的方法，方法具有下列步驟提供含有可能或可能不具有所述目的RNA的RNA的樣品；用片段化試劑處理樣品來提供RNA片段；由所述片段除去磷酸基來提供具有游離3′OH基團的片段；連接具有本發明標記試劑的所述片段；提供具有針對所述目的RNA的探針的核酸陣列；將標記的核酸片段雜交於所述核酸陣列；以及測定所述探針的雜交程度來測定所述目的RNA的存在。
文檔編號C07H19/00GK1818076SQ200510124689
公開日2006年8月16日 申請日期2005年11月4日 優先權日2004年11月4日
發明者凱爾·B·科萊, 格倫·H·麥高爾, 維維·張, 安東尼·D·巴龍 申請人:阿菲梅特裡克斯公司