用於古細菌多樣性分析的針對16SrRNA基因的引物的製作方法

2023-05-14 16:00:51

專利名稱：用於古細菌多樣性分析的針對16S rRNA基因的引物的製作方法
技術領域：
本發明涉及一對用於PCR的引物。特別是一對用於古細菌多樣性分析的針對16S rRNA 基因的引物。
背景技術：
在過去的二十年中，微生物多樣性研究的方法有了飛速的發展。這些手段主要依賴 於聚合酶鏈式反應(PCR)對目的基因的擴增。16SrRNA基因是這類研究中使用最有效 最普遍的分子標記。這些分子生物學方法的進展使我們能對未能培養的微生物進行一定 的研究，有助於我們對來自各種環境中的未知微生物群落進行分類學和生態學層面上的 研究。古細菌在形態學和生理學上都是多種多樣的。它們可以是球形、杆形、螺旋形、 不規則形和多態形等。有些是單細胞的，而有些是形成菌絲體或團聚體。直徑範圍一般 在O. lum至15um， 一些菌絲體能長到200 tx m。古細菌通常在極端生境中被發現，例如 產甲烷古細菌大量生長在含豐富有機物的厭氧環境中沼氣池、動物的瘤胃和腸道系統、 水域中的沉積物、沼澤溼地、溫泉，甚至是厭氧原生動物體內。目前，古細菌研究正在 世界範圍內升溫，這不僅因為古菌中蘊藏著遠多於另兩類生物的、未知的生物學過程和 功能，以及有助於闡明生物進化規律的線索，而且因為古細菌有著不可估量的生物技術 開發前景。目前，微生物多樣性的研究主要依賴於對16SrRNA基因這類研究中使用最有 效最普遍的分子標記的分析。而這種分析通常需要使用PCR技術。引物是PCR的關鍵， 直接影響到能否全面反映微生物多樣性。儘管有多種古細菌的16S rRNA引物在研究中被 用到，但缺乏適合於單方向測序可讀取長度的的此類引物。

發明內容
本發明的目的在於提供一對用於古細菌多樣性分析的針對16S rRNA基因的引物。 為達至lj上述目的，本發明搜集了 Sw的formula see original document page 3
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的全長16SrRNA基因，運用MEGA4.0軟體進行序列排列，挖掘其保守區段的序列。隨 後運用引物設計軟體Primer Premier 5.0進行引物設計。考慮到後續測序能力，每條序列 單方向測序的有效讀取長度一般小於1000個鹼基，所以設計出擴增片段長度約800個鹼 基對的引物，該引物的鹼基序列為
f， (5，-ACGGCTCAGTAACACG國3，)； r, (5，-CCGCCAATTCCTTTAAGT-3，)。
與現有技術相比，本發明的用於古細菌多樣性分析的針對16SrRNA基因的引物具有 很好的通用性和實用性，能良好反映實驗對象中古細菌的多樣性，可以適用於來源於土 壤，沉積物，人畜胃腸道等環境樣品的分析。


圖l是實施例1中的PCR電泳圖，S為PCR產物
圖2是實施例2中，根據所構建的16S rDNA克隆文庫的測序結果所建立的系統發 育進化樹的一個小分支。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實例僅用於說明本發明而
不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常
規條件，如分子克隆(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.)中所述條
件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例一使用本發明引物進行對環境微生物基因組DNA樣品的擴增
取來源於沼氣池漿中微生物基因組DNA樣品，進行PCR擴增。PCR的反應體系為
50 1: 10Xbuffer: 5 u 1， lOmM dNTP: 1 U 1， 10mM primer f: 2.5 u 1， 10mM primer r: 2.5
ul， Taq酶(2U/iU) : 1 lU， DNA:0.5ul， ddH20: 37.5 lU。 PCR參數設計如下起
始變性5分鐘，95°C; 30個循環(變性30秒，95°C;退火30秒，55°C;延伸50秒，72
°C);最後延伸7分鐘，72°C 。瓊脂糖凝膠電泳所用瓊脂糖濃度為1%的凝膠，含0.5 u g/mL
溴化乙錠，所用DNA分子量標記(Marker)為北京天為時代科技有限公司的100bpladder。
電泳結果見圖1。
實施例二由本發明擴增得到的PCR產物構建16S rDNA克隆文庫，並建立系統 發育進化樹。具體方法為使用實施例1中的方法得到PCR產物。將PCR產物經BODA PCR Purification Kit Columns純化，並與T載體連接，經電擊轉化構建16S rDNA克隆文
庫。從每個樣品中隨機挑選出克隆進行96孔板擴增培養，使用鹼法板抽轉化子質粒。獲 得的質粒使用DYEnamic ET Dynamic Terminator Sequencing Reagent (Applied Amersham)和2 pm的測序引物M13R (5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3，)做測序反應，然 後使用MegaBACE4500 DNA測序儀(Applied Amersham)進行單向測序。對獲得的序列 剔除屬於載體的序列和質量值低於20的序列，保留可讀長度約700個鹼基的序列做進一 步的系統分類分析。
序列經MEGA 4.0排列。依據測序圖譜，對每條序列進行人工編輯，只保留測序鹼 基位點明確的序列做後續分析，引物的序列被去除。對所獲得序列使用MEGA 4.0建系 統發育進化樹。圖2表示了進化樹中的一個小分支，上部的兩條所得序列是和己知古細 菌菌禾中Memawaraeta cowcz7〃禾口 M"/zawward"af 5p.—致，說明通過使用這對引物，能檢 測已知的古細菌；而下部13條序列與已知菌種的序列存在差異，根據系統發育樹顯示的 進化關係說明它們屬於古細菌，這些序列在NCBI(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)的登錄號 為012F06，EU838472; 012B04, EU838440; 012D11, EU838458; 011E08, EU838404; 014C11, EU838558; 012F02, EU838469; 011D06, EU838394; 005H04, EU838491; 011H10, EU838431; 012C08, EU838450; 012B06, EU838368; 013D05, EU838526; 012A06, EU838435說明通過使用這對引物，能檢測出樣品中所含古細菌的多樣性。
實施例三對由本發明擴增得到的PCR產物構建16SrDNA克隆文庫進行多樣性評 價對由實施例2得到的PCR-16S rDNA克隆文庫進行多樣性評價。使用軟體 DOTUR(Distance-based OTUs and Richness)計算產生評價多樣性的Shannon指數。所有文 庫中的序列經MEGA4.0整合的ClustalW程序進行了排列，然後使用程序Philip計算出 距離矩陣。將距離矩陣作為輸入文件導入DOTUR程序進行運算，得到Shannon指數。 如下表所示
序列差異度Shannon指數
03.46207
0.012.62061
0.022.05837
0.031.90364
0. 041.81368
0. 051.73168
序列差異度的取值直接影響到Shannon指數的值，由表所示當序列差異度取值為0.05 時，Shamion指數是1.73，說明此文庫內所含古細菌具有可觀的遺傳多樣性。因此表明本
發明引物能很好地來探測古細菌的多樣性。
序列表
上海大學
用於古細菌多樣性分析的針對16S rRNA基因的引物
2
1
16
DNA 人工序列
1
ACGGC TCAGT A AC AC G 16
2
21
DNA 人工序列
2
CCGCC AATTC CTTTAAGT 18
權利要求
1.一種用於古細菌多樣性分析的針對16S rRNA基因的引物，其特徵在於該引物的鹼基序列為f5』-ACGGCTCAGTAACACG-3』；r5』-CCGCCAATTCCTTTAAGT-3』。
全文摘要
本發明涉及一對用於古細菌多樣性分析的針對16S rRNA基因的引物。該引物的鹼基序列為f，(5』-ACGGCTCAGTAACACG-3』)；r，(5』-CCGCCAATTCCTTTAAGT-3』)。本發明可用於聚合酶鏈式反應(PCR)，通過實驗證明能很好反映實驗對象中古細菌的多樣性。
文檔編號C12N15/11GK101368214SQ200810200280
公開日2009年2月18日 申請日期2008年9月24日 優先權日2008年9月24日
發明者宋任濤, 莉 李, 佳 濮, 胡啟雯, 許政暟, 賀其其, 馬中良 申請人:上海大學