氧化石墨烯/溶菌酶抗菌納米複合薄膜材料、其製備方法及作為抗菌材料的應用的製作方法

2023-05-14 09:08:46

專利名稱：氧化石墨烯/溶菌酶抗菌納米複合薄膜材料、其製備方法及作為抗菌材料的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種氧化石墨烯/溶菌酶抗菌納米複合薄膜材料、其製備方法及作為抗菌材料的應用。
背景技術：
複合材料由於其優良的綜合性能，特別是其性能的可設計性而被廣泛應用於航空航天、國防、醫療、交通、體育等領域；有機/無機納米複合材料是其中最具吸引力的部分， 它能夠兼具有機物與無機物的一些優良性質(例如有機材料的多功能性以及無機材料優良的物理學特性)、在納米尺度上對結構進行有效的調節，進而獲得更加優異的性能和廣闊的應用前景，因此近年來受到了廣泛的關注。在分子水平上製備有機/無機多層複合薄膜材料，將不同種類和功能的物質按照不同需要進行不同順序的組裝，每一個單層的厚度可以小至幾個到幾十個埃，這些特性賦予了納米複合多層膜更多、更新的功能。這種特殊形態與結構的組裝體因其高度有序性和微結構的可調控性在微電子學、光學等許多領域取得了令人矚目的成就，具有光明的發展前景。有機/無機多層複合薄膜材料的一個重要的發展方向，是將具有生物活性的蛋白質分子與無機物成分混合，製備成複合薄膜；藉助其中無機物成分幫助有機物分子實現「位置穩定」及「結構支撐」的作用，以實現蛋白質的生物學功能。傳統的用來搭載蛋白質等有機物分子的材料是「碳基」礦物質，例如蒙脫石、高嶺土等，這些碳基材料由於其生物學適應性、良好的機械性能和便宜的價格等因素，一直被作為主要的原料用於化學、生物學等領域的「包裹」、「搭載」等用途。後來，隨著碳納米管合成技術的出現和成熟，碳納米管逐漸被大量的應用於複合材料的製備領域。相對於其它的碳基材料而言，碳納米管具有自身顯著的優勢。它具有更好的機械學性能和化學穩定性，不容易和絕大多數的介質發生反應。然而，碳納米管也具有其自身的缺點。首先，碳納米管的長度大多在幾百微米範圍內，就目前的合成技術而言，很難突破這一局限；其次，碳納米管的可控制性較差，這就導致我們很難獲得大尺寸範圍內連續的、取向良好的複合材料；第三， 碳納米管相對周圍介質具有很強的化學穩定性，碳管與介質之間只存在範德瓦爾斯相互作用，這種作用力很弱，會導致二者之間界面滑移的發生，所獲得的複合材料結構不穩定。這種種缺點極大地限制了碳納米管在複合材料領域的應用範圍。因此，一種與生物分子結合性更強且可控性更好的原材料一直是材料學家們尋找的對象。傳統的製備有機/無機複合多層膜的方法，主要有以下幾種。(1)分子/原子層氣相沉積法。它一般是利用大型儀器的輔助，在高真空或高溫等極端條件下，將固態的原材料熔化後，逐層沉積到固體基底上。過去這種方法常被用於製備無機薄膜材料，最近它也被應用在有機/無機複合多層膜的製備上。例如，曾有研究組報導，他們用逐層沉積的方法在基底上依次沉積有機分子多層及無機原子多層，最終製備了不同厚度的有機/無機複合多層膜材料。這種方法製備的薄膜材料可控性強、取向性好，但是實驗條件苛刻，對實驗儀器、實驗材料等都有嚴格的要求，成本較高。(2)電化學沉積法。用電化學沉積法製備有機/無機多層膜，一般是在電解質溶液中利用外加電場，在導電的基底上實現材料生長，最終形成複合多層膜結構的方法，它是最近幾年發展起來的一種複合材料製備技術。電化學沉積法能夠控制膜的厚度、組分的厚度和微結構，從幾納米到幾十微米的範圍內能夠保證膜的有序性，得到高度有序的複合多層膜結構，然而它對原材料的帶電性質有一定的要求。(3)Layer-by-Layer逐層自組裝技術，它的原理是，將某種具有特定表面基團的基片浸入含有功能分子的溶液中，通過固液界面化學反應，在基片表面上通過化學鍵(離子鍵、共價鍵、氫鍵等)、範德華力、偶極-偶極相互作用等形成超薄膜。LbL逐層組裝技術方法簡單成本低廉，可控性比較好，能夠在分子尺度上對膜的厚度進行控制，因此可用於製備光學薄膜等。但是，它也具有自身的一些缺點。例如，隨層數的增加，膜的無序度會大大增加，因此用這種方法製備的複合薄膜總厚度很薄(一般厚度在100納米的範圍內)，對各組分(例如納米顆粒等)的有序性難以有效的調節和控制等。(4)基於表面活性劑分子的共組裝法，它是基於表面活性劑分子的自組裝能力而產生的方法，常用的有LB膜法(逐層提拉法)，旋塗法(Spin coating)，Dip coating法， 溶液澆鑄法(Solutioncasting)等。它們都是源於含有一定濃度表面活性劑分子的混合溶液。隨著溶劑的揮發，表面活性劑的濃度增大，最終將自組裝形成固態多層結構，溶液中的其它組分將保留在層間，形成複合結構。2004年，一種新的碳基材料-石墨烯的出現，在很短時間內吸引了大家廣泛的關注，它的發現者也因此獲得了 2010年的諾貝爾物理學獎。石墨烯是單原子層的石墨，作為 「世界上最薄的材料」，它具有獨特而卓越的電子學、熱學、機械學等特性。然而，石墨的層間範德瓦爾作用力很強，這給石墨片層的分離帶來很大難度，因此它的應用在最近幾年都難以實現。為了解決這一問題，人們用化學手段將石墨轉化為氧化石墨。石墨片上修飾的大量氧化功能團降低了層間的吸引力，並引入了親水的性質，因此能夠促使石墨在水溶液中完全分離成單層的、厚度不足1納米的氧化石墨片，即氧化石墨烯(graphene oxide) 0與以往的碳基材料相比，氧化石墨烯具有以下特點(1)氧化石墨烯是在單原子層的石墨片的兩面修飾了大量的氧化功能團，例如環氧基、羥基等，這些氧化功能團賦予了氧化石墨烯親水的性質，使其能夠在水中完全分散成為單層，意味著它具有更大的表面面積可以與其它介質材料結合；(2)修飾的氧化功能團提高了了氧化石墨烯的表面活性，它們能夠直接與介質材料發生靜電吸附或鍵合作用，從而獲得穩定的複合結構；(3)氧化石墨烯具有生物學相容性，不會對蛋白質等生物分子造成明顯的影響和破壞；(4)它的石墨原子層骨架具有良好的機械強度，可以起到機械支撐的作用；(5)氧化石墨烯具有類似於表面活性劑分子的自組裝能力，能夠在平整的固體表面自組裝形成具有多層結構的連續的紙狀薄膜；(6)與以往經常採用的碳納米管相比，氧化石墨納米片價格便宜、製備簡單，非常適合大規模生產。以上特點，決定了氧化石墨烯可以作為一種完美的納米填充劑，用來製備多層納米複合材料。溶菌酶是一種天然的、常見的抗菌蛋白，它具有很強的殺菌能力，且價格便宜。不論在自然的狀態下，還是在變性的情況下，它都能保持抗菌活性。關於溶菌酶的研究由來已久。作為一種大家都比較熟識的蛋白，它經常被選作研究對象或者工具來進行相關的實驗研究。由於其較強的殺菌能力，溶菌酶具有廣泛的應用價值，當然，作為一種水溶性的蛋白質分子，它具有蛋白質分子普遍的缺點，例如機械強度低，在固體表面難以形成連續的薄膜結構，穩定性不好，在水溶液中會迅速溶解等。這些特點在一定程度上限制了它的應用，改變這一情況的有效方法，是將溶菌酶分子與其它具有較強機械學性能的材料組合在一起。

發明內容
本發明提供一種氧化石墨烯/溶菌酶抗菌納米複合薄膜材料的製備方法，所得納米複合薄膜材料具有高度有序的結構、緩釋的性質和抗菌的功能。本發明還提供上述製備方法所得氧化石墨烯/溶菌酶抗菌納米複合薄膜材料。本發明還提供上述氧化石墨烯/溶菌酶抗菌納米複合薄膜材料作為抗菌材料的應用。所述氧化石墨烯/溶菌酶抗菌納米複合薄膜材料的製備方法，以溶菌酶和氧化石墨烯的混合溶液為原料，用溶液澆鑄法製備得到氧化石墨烯/溶菌酶抗菌納米複合薄膜材料，溶菌酶和氧化石墨烯的混合溶液中溶菌酶與氧化石墨烯的質量比為2 15 1。作為優選方案，溶菌酶和氧化石墨烯的混合溶液中氧化石墨烯的濃度為0. 1 2. 0mg/mlo所述氧化石墨烯的製備方法優選為取1 6g石墨粉，與2 IOg硝酸鈉混合， 在攪拌狀態下，緩慢倒入100 300ml濃硫酸，持續攪拌1 3小時令試劑混合均勻，在冰浴條件下，2 6小時內分批次緩慢加入10 30g高錳酸鉀，之後保持在冰浴中繼續攪拌 5 15小時；然後撤走冰浴裝置，在25 45°C水浴條件下恆溫攪拌至反應完全，緩慢加入溫水200 500ml，使體系的溫度不高於50°C;然後攪拌1 3天，後繼續加入溫水，定容至 600 1200ml，再緩慢滴入雙氧水反應掉剩餘的高錳酸鉀，至溶液不再變色為止，溶液最終變成亮黃褐色，即獲得氧化石墨溶液；將反應生成的氧化石墨溶液清洗、除雜後配製成氧化石墨濃度為0. 5 3. Omg/ml的溶液，超聲處理10 60分鐘令石墨片完全分散成單層，得到氧化石墨烯溶液。所述石墨粉優選為50 500目的粉末。所述製備方法可以獲得氧化石墨烯/溶菌酶抗菌納米複合薄膜材料。本發明利用改進的Hummers的方法，將石墨粉末氧化成氧化石墨，充分清洗後配製成0. 5 3. Omg/ml的溶液，超聲處理10 60分鐘令氧化石墨片完全分散成單層的氧化石墨烯納米片。將氧化石墨烯納米片溶液與溶菌酶蛋白溶液以一定的相對質量比混合，攪拌均勻後作為複合材料製備的母液使用。採用溶液澆鑄法製備複合薄膜。抽取一定體積的母液，滴到處理過的矽片表面，置於容器中令溶劑緩慢揮發。隨著溶劑的揮發，氧化石墨烯納米片將挾裹著蛋白質分子自組裝成平行於基底方向的、高度有序的多層複合結構。在氧化石墨烯/溶菌酶多層複合結構中，氧化石墨烯起到搭載骨架和結構支撐的作用；氧化石墨烯納米片表面的活性基團與溶菌酶分子之間的靜電吸附作用，使溶菌酶均勻的分布於相鄰兩層的氧化石墨烯片層之間，形成穩定的複合相。利用掃描電子顯微鏡 (SEM)和X射線衍射技術(XRD)分析複合薄膜材料的結構。在一定的氧化石墨烯/溶菌酶質量比例範圍內，可以觀測到高度有序的複合相的存在。
利用帶耗散的石英晶體微天平OiCM-D)分析氧化石墨烯/溶菌酶複合薄膜材料在水中的緩釋性質。通過調節複合材料中氧化石墨烯與溶菌酶的質量比例，可以有效控制複合薄膜在水中的解吸附動力學性質，這一性質是由於複合薄膜多層有序的複合結構導致的，可以在藥物緩釋方面有實際的應用價值。所述氧化石墨烯/溶菌酶抗菌納米複合薄膜材料作為抗菌材料的應用。所述菌優選為蠟樣芽孢桿菌。利用蠟樣芽孢桿菌測試氧化石墨烯/溶菌酶複合薄膜材料的抗菌效果。與其它固體表面相比，在氧化石墨烯/溶菌酶複合薄膜材料的表面，細菌更難以吸附和成活，這意味著該複合薄膜可以鋪展在其它固體的表面，起抗菌保護的作用。作為本發明的改進，將所述氧化石墨烯/溶菌酶抗菌納米複合薄膜材料作為抗菌材料應用時，可以使用超聲的方法，將氧化石墨烯/溶菌酶抗菌納米複合薄膜材料從其附著的基底上剝離下來並轉移到待保護固體的表面，起抗菌保護的作用。本發明的有益效果是，設計和製備了一種新的、以氧化石墨烯納米片和溶菌酶蛋白為基礎的功能納米複合薄膜材料，它具有高度有序的結構、緩釋的性質和抗菌的功能。


圖1是氧化石墨烯/溶菌酶抗菌納米複合薄膜材料的結構示意圖。圖2是氧化石墨烯/溶菌酶抗菌納米複合薄膜材料中的蛋白質分子及氧化石墨烯納米片在水中的解吸附示意圖。圖3是石墨與氧化石墨的X射線粉末衍射圖譜。圖4是單層氧化石墨烯納米片的原子力顯微鏡掃描圖。圖5是矽基底上的純溶菌酶蛋白薄膜的掃描電子顯微鏡照片。圖6是矽基底上的純氧化石墨烯薄膜(厚度約為90nm)的掃描電子顯微鏡照片， 其中(a)為薄膜表面形貌，(b)和(c)為截面形貌。圖7是矽基底上的純氧化石墨烯薄膜(厚度約為4 μ m)的掃描電子顯微鏡照片， 其中(a)為薄膜表面形貌，(b)為截面形貌。圖8是矽基底上氧化石墨烯/溶菌酶抗菌納米複合薄膜材料的掃描電子顯微鏡照片，其中(a)為薄膜表面形貌，(b)為截面形貌。圖9是一系列相對濃度的氧化石墨烯/溶菌酶抗菌納米複合薄膜材料的X射線衍射圖譜。(B)-(G)所代表的薄膜材料中，蛋白質與氧化石墨烯的質量比例依次為2.5，5.0， 6.3,7.5,10.0,12.5 1。作為參照，(A)和(H)分別是純氧化石墨烯薄膜和純蛋白質薄膜的X射線衍射曲線。圖10是一系列相對濃度的氧化石墨烯/溶菌酶抗菌納米複合薄膜材料在水中的石英晶體微天平解吸附圖譜頻率Af隨時間變化的趨勢圖。圖中的字母(A)-(H)與圖9 中代表相同的含義。圖11是圖10中曲線的局域放大。圖12是該系列相對濃度的氧化石墨烯/溶菌酶抗菌納米複合薄膜材料在水中的石英晶體微天平解吸附圖譜耗散係數AD隨時間變化的趨勢圖。圖中的字母(A)-(H)與圖9中代表相同的含義。圖13是氧化石墨烯/溶菌酶抗菌納米複合薄膜材料在水中解吸附、以及在2%(質量分數)的十二烷基硫酸鈉溶液中脫落的石英晶體微天平測量曲線。圖14(a_e)是三種不同的表面在大腸桿菌液中培養10小時後受細菌汙染情況的 SEM對比照片(a_b)代表乾淨的矽片表面，(c-d)代表純氧化石墨烯薄膜表面，(e)代表複合薄膜材料表面，其中(b)和(d)分別是(a)和(c)的局域放大圖。(f)是複合薄膜材料的表面在蠟樣芽孢桿菌液中培養20小時後受細菌汙染情況的掃描電子顯微鏡照片。圖15是從基底上剝離的氧化石墨烯/溶菌酶抗菌納米複合薄膜材料被轉移到矽片(a)及銅網(b)表面的掃描電子顯微鏡照片。
具體實施例方式1、氧化石墨烯/溶菌酶抗菌納米複合薄膜材料的製備1.1氧化石墨烯的合成。1. 1. 1石墨的氧化石墨的氧化採用改進的Hummers方法。作為原料的石墨是325目的粉末，純度為 99. 9995%，購於Alfa Aesar公司，高錳酸鉀、硝酸鈉、濃硫酸、鹽酸、雙氧水等化學試劑購於南京化學試劑公司。取2g石墨粉，與3. 75g硝酸鈉混合後置於大燒杯中；安裝電動攪拌器，在之後的整個氧化過程中保持攪拌器持續工作。緩慢倒入170mL濃硫酸，持續攪拌2小時令試劑混合均勻。將燒杯置於冰浴中，分批次緩慢加入高錳酸鉀，共22g，整個過程持續時間為4小時， 之後保持在冰浴中繼續攪拌8小時。撤走冰浴裝置，將燒杯置於水浴中35°C下恆溫攪拌30小時，至反應完全。緩慢加入溫水345mL，這是一個劇烈的放熱過程，因此要緩慢和小心的進行，以保證體系的溫度始終不高於50°C。攪拌1天，後繼續加入溫水，定容至800ml。最後緩慢滴入雙氧水反應掉剩餘的高錳酸鉀，至溶液不再變色為止(約IOml)，溶液最終變成亮黃褐色，即獲得氧化石墨溶液。1.1. 2氧化石墨的清洗將反應生成的氧化石墨溶液用10%的鹽酸和超純水依次清洗，重複5遍以上。之後置於池 14k的透析袋中透析3天以上，去掉溶液中的雜質離子，可獲得較乾淨的氧化石墨。1. 1.3氧化石墨烯的獲得測定製得的氧化石墨溶液的質量分數，在此基礎上，配置2. Omg/ml的溶液，超聲處理20分鐘令石墨片完全分散成單層。此溶液即可作為原始的氧化石墨烯溶液用於之後的實驗。1.2蛋白溶液的準備溶菌酶粉末購於Sigma。稱取IOmg溶菌酶，溶於Iml磷酸鹽緩衝液中，輕微震蕩令其完全溶解，獲得10mg/ml濃度的蛋白溶液。1.3矽片基底的清洗將單面拋光的(100)矽基片，切成8*8mm尺寸的小片。分別以丙酮和酒精溶液超聲清洗10分鐘，取出以超純水衝洗乾淨。將其置於H2SO4 H2O2 H2O = 1 1 5的混合溶液中煮沸15分鐘，取出以純水衝洗，再置於NH3 · H2O H2O2 H2O = 1 1 5的混合溶液中煮沸10分鐘，之後取出，衝淨後以隊吹乾備用。1.4複合薄膜的製備1.4. 1母液的準備以微升進樣器量取適量的蛋白溶液，滴入10μ 1氧化石墨烯溶液中，加入適量純水，使溶液總體積達到50μ 1，輕微震蕩令其混合均勻，作為樣品製備的母液使用。量取的蛋白溶液體積，根據樣品要求的不同濃度而有所區別。選用的母液中樣品濃度範圍(以溶菌酶與氧化石墨烯的質量相對濃度表示)及所量取的蛋白溶液體積分別
為
(1)溶菌酶氧化石I■烯=2. 5 1，蛋白浮 液=5μ 1 ；
(2)溶菌酶氧化石i■烯=5.0 1，蛋白浮賄=10μ 1 ；
(3)溶菌酶氧化石i■烯=6. 3 1，蛋白浮 液=12. 5μ 1 ；
(4)溶菌酶氧化石i■烯=7. 5 1，蛋白浮賄=15μ 1 ；
(5)溶菌酶氧化石i■烯=10. 01，蛋白;容液=20μ 1 ；
(6)溶菌酶氧化石i■烯=12. 51，蛋白;容液=25μ 1 ；
1. 4.2複合薄膜材料的製備
複合薄膜材料採用傳統的浮 液澆鑄法製備。用微升進樣器量取10 μ 1母液，滴至
清洗過的矽基片上，溶液將在矽基片親水的表面完全鋪開，覆蓋住整個表面。將其置於室溫環境下20小時以上令溶劑完全揮發，氧化石墨烯挾裹著蛋白質分子自組裝成多層結構，即可獲得矽基底上的納米複合薄膜材料。2、氧化石墨烯/溶菌酶抗菌納米複合薄膜材料的結構表徵2.1表徵手段氧化石墨烯的單層結構是利用X射線粉末衍射和原子力顯微鏡判定的，所用儀器分別為德國Bruker公司D8Advance X射線衍射儀和NanoScope IIIa-D3000原子力顯微鏡。薄膜材料的表面形貌用Hitachi公司的S-4200掃描電子顯微鏡(工作電壓5kV) 及Philips公司的XL30S-FEG掃描電子顯微鏡(工作電壓IOkV)觀測，觀測前先將樣品表面噴塗約5nm厚的金層。將薄膜用刀片切開，即可觀察其截面形貌。複合薄膜的X射線衍射測量是在德國Bruker公司DSAdvance X射線衍射儀上進行的。複合薄膜在水中的解吸附動力學觀測是在瑞典Q-sense公司的石英晶體微天平儀器OlCM-D)上進行的，儀器型號為Q-sense El。2. 2表徵結果及分析2. 2. 1單層氧化石墨烯的表徵為了證明氧化石墨的成分，我們進行了 X射線粉末衍射實驗。圖3是氧化前後石墨的X射線粉末衍射曲線。原始的石墨晶體在 尖銳的衍射峰對應著Z方向層狀結構的周期為3.4 A。氧化以後，這一特徵峰完全消失，同時在 12°出現了一個較寬的峰，對應周期約為7. 6 A，這與文獻中關於氧化石墨的報導是一致的，意味著石墨層間修飾的氧化功能團的出現。圖4是AFM下對分散到矽片表面的氧化石墨片的厚度的測量，約為0.71nm，這與X射線粉末衍射中氧化石墨層狀結構的周期是一致的，可見氧化石墨片獲得了完全的分離。
2. 2. 2氧化石墨烯/溶菌酶複合薄膜的SEM形貌表徵圖5-7是純溶菌酶薄膜及純氧化石墨烯薄膜表面和截面形貌的掃描電子顯微鏡照片。圖5是純溶菌酶薄膜樣品的表面形貌圖，其中黑色部分為矽基底，白色條紋是溶菌酶蛋白，它呈現不連續的、雜亂的枝狀形貌。它很不穩定，浸泡在水中後會迅速溶解。圖6-7 是不同厚度的純氧化石墨烯薄膜樣品，其中圖6的薄膜樣品厚度約為0. 1 μ m，圖7中樣品厚度約為4μπι。在表面形貌圖中，黑色區域為樣品表面較平整的部分，白色條紋為散亂分布的波紋狀褶皺。這些褶皺可能是由於樣品製備過程中，某些氧化石墨烯片層的錯位導致的。 隨著樣品厚度的增加，褶皺逐漸增多，樣品表面的粗糙度迅速增大。從圖6(c)和7(b)的截面形貌圖中，可以清晰的分辨出薄膜樣品的層狀結構，圖中的碎片是電鏡樣品製備過程中用刀片切割的結果。這種平行有序的層狀結構與以往的報導中採用真空過濾的方法製備的薄膜的結構是類似的。在氧化石墨烯含量相同的情況下，氧化石墨烯/溶菌酶複合薄膜比純氧化石墨烯薄膜的厚度大得多，這意味著溶菌酶蛋白成功插入了複合薄膜材料的結構；另一方面，與純氧化石墨烯薄膜相比，複合薄膜樣品的表面粗糙度較小。圖8是複合薄膜樣品的表面及截面形貌的掃描電子顯微鏡照片，在樣品截面形貌觀察過程中，由於截面處沒有事先噴塗導電的金層，薄膜中的有機成分在高能電子束的照射下迅速燒掉，展露出殘餘的無機成分，呈現與基底相平行的、一維有序的層狀分布。我們可以假設，這些無機的氧化石墨烯片均勻的分散在有機基體中，將溶菌酶分子夾在相鄰的兩層之間，並在整個複合結構中起到機械支撐的作用。後面我們將用X射線衍射測量來驗證這一假設。2. 2. 3氧化石墨烯/溶菌酶複合薄膜的X射線衍射結構表徵為了觀測氧化石墨烯納米片在複合薄膜樣品中的分布情況，我們引入了 X射線衍射實驗。如圖9是不同蛋白濃度樣品的X射線衍射圖譜。對於純氧化石墨烯薄膜樣品(曲線Α)，在11. 5°位置有一個寬的衍射峰，這是氧化石墨晶體的特徵峰，對應 7. 7Α的周期， 這與之前測得的氧化石墨烯片層的厚度是一致的(圖4)。對於複合薄膜樣品，這個衍射峰完全消失，意味著複合材料中氧化石墨烯片層的完全分散。對於溶菌酶/氧化石墨烯質量比為2. 5 12. 5範圍的複合薄膜樣品，在2. 2°左右出現了一個新的衍射峰，它對應的周期約為41 士5 Α，這與圖8中複合薄膜樣品截面的SEM形貌圖是對應的。考慮到溶菌酶分子的尺寸為45 X 30 X 30 Α，可以推測這一衍射峰是氧化石墨/溶菌酶複合相存在的表現；隨著薄膜內蛋白質分子數量的增多，分子越來越擁擠、傾斜(如圖1中所示)，將會導致複合相層狀結構的周期略有增大，如圖9中從曲線B到曲線G的趨勢所示。3、氧化石墨烯/溶菌酶抗菌納米複合薄膜材料的緩釋性質的表徵3. 1實施方法帶耗散的石英晶體微天平OiCM-D)被廣泛應用於化學、物理、生物、醫學和表面科學等諸多領域，是一種成熟而靈敏的質量測量工具。它對其晶體表面上所吸附物質的質量及粘彈性的變化非常敏感，因此可以作為測量發生在固-液界面的吸附、解吸附動力學過程的有效手段。我們首先在石英晶體微天平的晶體表面製備氧化石墨烯/溶菌酶複合薄膜，將其安裝進石英晶體微天平儀器中靜置1小時等待儀器運行穩定。利用外接的蠕動泵以 280 μ 1/min的速度通入純水，此後的實驗都在相同的流動狀態下進行。通水5分鐘以後，掃描基線，開始複合薄膜樣品的解吸附動力學測量。採集3倍共振的頻率f(即基線基礎上頻率的變化值Δι)及耗散D (即基線基礎上耗散的變化值AD)隨時間t的變化曲線，用於之後的分析。3. 2表徵結果圖10是不同蛋白濃度的複合薄膜樣品的解吸附動力學圖譜。作為參照，純氧化石墨烯薄膜和純溶菌酶薄膜樣品的測量曲線也被顯示在同一張圖內。根據圖譜中頻率f隨時間t的變化趨勢，可以分析出這一系列樣品不同的解吸附動力學規律。首先，對於純溶菌酶薄膜樣品(曲線H)，在測量時間段內其頻率基本不發生變化， 這是由於蛋白分子在測量取值之前等待系統穩定的過程中已經完全溶解的緣故；純氧化石墨烯薄膜樣品(曲線A)的頻率隨時間略有降低，在10，000秒之後達到平衡；複合薄膜樣品則呈現不同的變化趨勢。與曲線B到G對應的一系列複合薄膜樣品中，氧化石墨烯的數量相等，溶菌酶的數量遞增。圖譜顯示，當溶菌酶含量較低時，例如曲線B，頻率隨時間單調的降低，直到50，000秒之後仍未達到穩定值；對於蛋白含量較大的樣品，例如曲線C和Ej^ 率在一定時間的降低之後出現轉折、轉而升高，並且該轉折點t。隨蛋白濃度的增大而提前； 直至對應著最大蛋白濃度的曲線G，頻率的降低行為已被完全掩蓋，從測量伊始頻率即呈現上升趨勢。3. 3表徵結果分析在材料的解吸附過程中，頻率的升高主要是由於石英晶體微天平的晶體表面吸附物質質量的降低或脫離導致的，而頻率的降低(絕對值的增大)意味著材料對溶液中水分的吸收，包括兩種可能的方式水分的「裝載」(loading)和「沉陷」(trapping)，因此可以說，解吸附過程中頻率隨時間的改變是幾個不同的動力學過程同時發生和競爭的整體體現。在此基礎上我們可以分析圖10中不同材料樣品的頻率變化規律。(1)，曲線A即純氧化石墨烯薄膜樣品，頻率的降低意味著材料內水分的吸收；(2)，曲線B，水溶性蛋白分子在多層膜層間的插入增強了薄膜吸收水分的能力，導致了曲線斜率的增大，頻率也變化的更加明顯；(3)，曲線C和E，蛋白的繼續增多在提高薄膜吸水能力的同時，也促使其更容易從基底上脫離下來，兩種過程競爭的結果表現為在轉折點t。之前，水分的吸收佔優勢；在此之後，材料(包括材料內部吸收的水分)的剝離佔優勢A4)，對於更大蛋白濃度的曲線G， 在測量時間範圍內只能觀察到材料脫離佔據優勢的過程。在材料的吸水現象中，水分的「裝載」(loading)和「沉陷」 (trapping)可以通過另一個參數-耗散係數D-的變化量來區分。對於理想的牛頓液體相，水分的吸收會導致頻率 (絕對值)和耗散係數同時發生改變，二者的變化量呈現線性對應關係，即AD Δ f，這是一個水分「裝載」的過程。除此之外，材料粗糙表面的缺陷也會吸附大量的水分子，即水分的「沉陷」過程，它會導致AD和Af之間非線性的變化關係。圖12是這一系列樣品耗散係數D的變化圖譜。根據之前的分析，樣品的變化規律可以分為兩類(l)，f發生改變，D保持不變，例如曲線B、C和曲線E在t。之前的部分，這是一個蛋白質分子吸水的水分「沉陷」 過程；(2)，f與D同時發生變化，但Δ D/ Δ f保持為常數，例如曲線A、G和曲線E的後半部分，這是一個薄膜層間吸水的水分「裝載」過程。圖11是圖10中複合薄膜樣品解吸附曲線的區域放大圖，可以清楚地觀察到周期性的波動，且對於不同的複合薄膜樣品，它們波動的周期At基本相同。這意味著薄膜材料
10的動力學解吸附過程是由於其高度有序的多層結構導致的。4、氧化石墨烯/溶菌酶抗菌納米複合薄膜材料的結構形成機制的分析氧化石墨烯是在單層的疏水的石墨片層的兩面修飾上大量的親水氧化基團，它的這一結構賦予了它與表面活性劑分子類似的自組裝能力。對於純氧化石墨烯薄膜材料，水分的揮發增大了溶液中氧化石墨烯的濃度，促使其自組裝成與基底平行的層狀結構，它構建了一個層狀的骨架，可以作為複合材料的搭載骨架使用。氧化石墨烯/溶菌酶複合薄膜材料高度有序結構的形成也是在氧化石墨烯自組裝能力的基礎上實現的。在原始的母溶液中(即一定濃度比例的氧化石墨烯/溶菌酶混合溶液)，氧化石墨烯片層上修飾的大量氧化基團使其具有了活性的表面及邊緣性質，它們不僅促使片層在水中完全分離，而且賦予了它們與水溶性材料相互吸附的能力；在電中性溶液中，氧化石墨烯與溶菌酶蛋白帶有相反電荷，二者之間的靜電吸附作用促進了這種吸附的發生，因此它們在母溶液中將以「結合體」的形式存在。溶劑揮發過程中，隨著濃度的增加，氧化石墨烯挾裹著上面吸附的蛋白分子自組裝成層狀結構，層間的水由中心向邊緣流動，水流給片層帶來了一個切應力，促使片層的取向平行於基底。隨著溶劑的完全揮發，最終形成了穩定的、多層的、複合的結構。5、功能檢測及應用實例5. 1氧化石墨烯/溶菌酶抗菌納米複合薄膜材料的抗菌功能檢測實施方法培養蠟樣芽孢桿菌溶液，取第二代培養液待用。將新製備的複合薄膜表面暴露在新培養的蠟樣芽孢桿菌溶液中，在37°C下培養 10個小時，之後用氮氣吹乾，噴金後用掃描電子顯微鏡觀察。作為對照，我們同樣處理了裸矽片及純氧化石墨樣品。5. 2掃描電子顯微鏡觀察結果圖14(a_e)是不同樣品表面在細菌溶液中培養10小時後受細菌汙染情況對比的掃描電子顯微鏡照片。其中，(a_b)對應乾淨的矽片表面，(c-d)對應純氧化石墨烯薄膜表面，(e)對應複合薄膜材料表面；(b)和(d)分別是(a)和(c)的局域放大圖。(f)是複合薄膜在細菌溶液中保留20小時之後的結果。圖中以白色箭頭標出的橢圓體和不規則體代表芽孢桿菌，黑色部分代表材料平整或不平整的表面。圖片顯示，在裸矽片和純氧化石墨烯薄膜表面，吸附細菌數量較多；在複合薄膜表面，細菌數量較少，受細菌汙染的面積比例已由純氧化石墨烯薄膜的 35. 6%下降到 5.9% ；即使延長至20小時，受汙染比例也只是 16. 6%左右；另一方面，相比於前兩者表面吸附的保持原始形貌的細菌而言，複合薄膜表面殘留的細菌發生了明顯的變性。溶菌酶的殺菌原理在於，它能夠促進細菌細胞壁中肽聚糖層的水解，導致細胞的會聚及生存能力的喪失從而殺滅細菌。既然裸矽片及純氧化石墨烯薄膜表面的細菌都沒有發生變化，可以推斷，複合薄膜表面細菌的變性是複合材料中溶菌酶分子抗菌能力的結果。5. 3拓展應用把矽基底上的複合薄膜浸泡在水中，以較低的功率超聲，同時在薄膜附近外加平緩的水流，約1分鐘後薄膜將從基底上脫離下來，漂浮到水面上。如圖15所示，它可以被隨意的轉移到矽片、銅網等其它固體材料的表面，作為覆蓋層使用，起到抗菌的作用。
權利要求
1.一種氧化石墨烯/溶菌酶抗菌納米複合薄膜材料的製備方法，其特徵在於以溶菌酶和氧化石墨烯的混合溶液為原料，用溶液澆鑄法製備得到氧化石墨烯/溶菌酶抗菌納米複合薄膜材料，溶菌酶和氧化石墨烯的混合溶液中溶菌酶與氧化石墨烯的質量比為2 15 1。
2.如權利要求1所述的氧化石墨烯/溶菌酶抗菌納米複合薄膜材料的製備方法，其特徵在於溶菌酶和氧化石墨烯的混合溶液中氧化石墨烯的濃度為0. 1 2. Omg/ml。
3.如權利要求1或2所述的氧化石墨烯/溶菌酶抗菌納米複合薄膜材料的製備方法， 其特徵在於所述氧化石墨烯的製備方法為取1 6g石墨粉，與2 IOg硝酸鈉混合，在攪拌狀態下，緩慢倒入100 300ml濃硫酸，持續攪拌1 3小時令試劑混合均勻，在冰浴條件下，2 6小時內分批次緩慢加入10 30g高錳酸鉀，之後保持在冰浴中繼續攪拌5 15小時；然後撤走冰浴裝置，在25 45°C水浴條件下恆溫攪拌至反應完全，緩慢加入溫水 200 500ml，使體系的溫度不高於50°C ；然後攪拌1 3天，後繼續加入溫水，定容至600 1200ml，再緩慢滴入雙氧水反應掉剩餘的高錳酸鉀，至溶液不再變色為止，溶液最終變成亮黃褐色，即獲得氧化石墨溶液；將反應生成的氧化石墨溶液清洗、除雜後配製成氧化石墨濃度為0. 5 3. Omg/ml的溶液，超聲處理10 60分鐘令氧化石墨片完全分散成單層，得到氧化石墨烯溶液。
4.如權利要求3所述的氧化石墨烯/溶菌酶抗菌納米複合薄膜材料的製備方法，其特徵在於所述石墨粉為50 500目的粉末。
5.權利要求1-4中任一項所述的製備方法所得氧化石墨烯/溶菌酶抗菌納米複合薄膜材料。
6.權利要求1-4中任一項所述的製備方法所得氧化石墨烯/溶菌酶抗菌納米複合薄膜材料作為抗菌材料的應用。
7.如權利要求6所述的氧化石墨烯/溶菌酶抗菌納米複合薄膜材料作為抗菌材料的應用，其特徵在於所述菌為蠟樣芽孢桿菌。
8.如權利要求6或7所述的氧化石墨烯/溶菌酶抗菌納米複合薄膜材料作為抗菌材料的應用，其特徵在於使用超聲的方法，將氧化石墨烯/溶菌酶抗菌納米複合薄膜材料從其附著的基底上剝離下來並轉移到待保護固體的表面，起抗菌保護的作用。
全文摘要
本發明涉及氧化石墨烯/溶菌酶抗菌納米複合薄膜材料、其製備方法及作為抗菌材料的應用。所述氧化石墨烯/溶菌酶抗菌納米複合薄膜材料的製備方法，以溶菌酶和氧化石墨烯的混合溶液為原料，用溶液澆鑄法製備得到氧化石墨烯/溶菌酶抗菌納米複合薄膜材料，溶菌酶和氧化石墨烯的混合溶液中溶菌酶與氧化石墨烯的質量比為2～15∶1。所述製備方法可以獲得氧化石墨烯/溶菌酶抗菌納米複合薄膜材料。所述氧化石墨烯/溶菌酶抗菌納米複合薄膜材料作為抗菌材料的應用。該複合薄膜可以鋪展在其它固體的表面，起抗菌保護的作用。本發明設計和製備了一種新的、以氧化石墨烯納米片和溶菌酶蛋白為基礎的功能納米複合薄膜材料，它具有高度有序的結構、緩釋的性質和抗菌的功能。
文檔編號A01N63/02GK102165963SQ201010610000
公開日2011年8月31日 申請日期2010年12月29日 優先權日2010年12月29日
發明者元冰, 馬餘強 申請人:南京大學