一種可視化檢測鹼性磷酸酶的方法
2023-05-14 22:27:06
一種可視化檢測鹼性磷酸酶的方法
【專利摘要】本發明涉及一種可視化檢測鹼性磷酸酶的方法，包括步驟：利用鹼性磷酸酶催化其底物氨基磷酸酚（p-APP）產生具有強還原性的物質對氨基苯酚（p-AP），而p-AP能在納米金的存在下將Ag+還原成Ag0沉積到納米金表面形成Au/Ag納米顆粒，從而利用膠體金溶液的顏色變化及紫外可見吸收光譜的變化實現對酶活性的檢測。將酶促金屬化和納米金誘導銀沉積相結合，建立了一種超高靈敏的可視化檢測鹼性磷酸酶的方法，該方法具有操作簡單，特異性強，靈敏度高，且不需要複雜儀器等特點。
【專利說明】一種可視化檢測鹼性磷酸酶的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種可視化檢測酶活性的方法，屬於分析檢測領域。
【背景技術】
[0002]可視化檢測由於其對儀器要求低、操作簡單，作為一種快速檢測的有效方法而在臨床診斷方面被廣泛應用。基於金屬納米顆粒的比色分析法由於其簡單、方便以及金屬納米顆粒獨特的光學性質而受到人們的廣泛關注。但是基於金屬納米顆粒聚集的比色法在實際應用中仍然存在一些缺陷，例如:金屬納米顆粒容易受到一些外部因素的影響，例如高的離子強度，實際樣品中的複雜物質等，從而導致金屬納米顆粒的非特異性聚集；另外這些檢測方法的靈敏度也有待於進一步提聞。
[0003]據報導，有眾多類型的酶，如氧化酶，羥化酶，水解酶，或NAD (P) +依賴的酶等，都可以作為生物催化劑合成金屬納米粒子，從而發生酶促金屬化反應。文獻中已經有利用酶催化金的沉積應用到酶的底物的可視化檢測。但是由於氯金酸具有比較強的氧化性，即使在具有弱還原性的溶液中也能夠被還原(例如葡萄糖溶液)，因此該檢測方法很容易受到幹擾。另外該方法的靈敏度也有待於進一步提高。
[0004]基於此我們將酶促金屬化和納米金誘導銀沉積相結合，建立了一種超高靈敏且抗幹擾能力強的非聚集的金屬納米顆粒比色法，該方法結合了酶催化反應的專一性和催化放大性及金屬納米顆粒獨特的光學性質等優點，大大增加了檢測的靈敏度及特異性。
【發明內容】
[0005]本發明所要解決的技術問題在於提供一種快速、高靈敏、可視化檢測鹼性磷酸酶的方法。
[0006]該方法包括如下步驟:將鹼性磷酸酶加入到含有對氨基磷酸酚、硝酸銀、納米金的二乙醇胺緩衝液中孵育，利用緩衝液的顏色變化及紫外可見吸收光譜的變化實現對鹼性磷酸酶的檢測。
[0007]上述鹼性磷酸酶可以催化檢測液中對氨基磷酸酚(p-APP)磷酸基團的水解，產生具有強還原性的對氨基苯酹(p-AP),而p-AP能在納米金的存在下將Ag+還原成Ag單質沉積在納米金表面形成Au/Ag納米顆粒，從而導致檢測液的顏色變化及其紫外可見吸收光譜的變化。
[0008]所述二乙醇胺緩衝液為0.5mol/L pH9.8的二乙醇胺緩衝液，其中含有8mmol/L的對氨基磷酸酹、2mmol/L的硝酸銀和15nmol/L的納米金。
[0009]本發明方法將酶促金屬化和納米金誘導銀沉積相結合，通過膠體金顏色的變化對鹼性磷酸酶的濃度進行檢測，步驟非常簡單，無需進行納米金的標記，而且靈敏度高，特異性好。通過紫外可見分光光度計進行定量檢測，在孵育時間為30分鐘時，檢測限為12fmol/L，相當於50μ L體系中可以檢測到0.6amol的鹼性磷酸酶，而且增加孵育時間可以進一步提高檢測的靈敏度。通過將吸光度隨時間的變化同鹼性磷酸酶的濃度作圖，得到很好的定量關係，線性範圍50fmol/?20pmol/L，R2=0.998。檢測過程非常簡單，且靈敏度高，特異性強。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0010]圖1檢測鹼性磷酸酶的原理示意圖。
[0011]圖2透射電鏡及紫外可見光譜表徵:㈧為納米金的透射電鏡圖；⑶為納米金的紫外可見吸收光譜圖；(C)和(E)分別是在不同濃度的鹼性磷酸酶的存在下進行酶促金屬化反應以後所得到的Au/Ag納米顆粒的透射電鏡圖；(D)和(E)分別是他們的紫外可見吸收光譜圖；內部插圖為對應的納米金及Au/Ag納米顆粒的放大透射電鏡圖。
[0012]圖3不同濃度鹼性磷酸酶檢測的顏色變化照片(A)，紫外可見光譜圖(B)(孵育時間為 30min)。
[0013]圖4檢測液370nm處的吸光度隨時間的變化。
[0014]圖5 (A)不同孵育時間條件下檢測液370nm處吸光度與ALP濃度的關係曲線；(B)檢測液每分鐘370nm處吸光度的變化與ALP濃度的關係曲線。
[0015]圖6檢測鹼性磷酸酶方法的特異性柱狀圖，插圖為其對應的紫外可見吸收光譜圖。
【具體實施方式】
[0016]以下實施例僅用於進一步說明本發明，但不應理解為對本發明的限制。
[0017]實施例1鹼性磷酸酶的檢測
[0018]下面以鹼性磷酸酶為例，對基於酶促金屬化的可視化檢測酶的方法進行詳細的說明。
[0019]一、方法
[0020]1、納米金的製備
[0021]稱取7.5mg穀胱甘肽，溶於0.1mL超純水中，攪拌狀態下加入到lmLl%氯金酸溶液中，混勻後用10mol/L NaOH調節pH值至2.5-3.0，產生淺黃色沉澱。離心(7000rpm，3分鐘)收集沉澱得到Au(I)配合物。
[0022]將上述Au (I)配合物用lmL5mmol/L氫氧化鈉溶液溶解，得到金前體溶液。將金前體溶液用9mL超純水稀釋，並調節pH至5.5左右。然後向反應體系中加入4mg還原型輔酶II (NADPH)和2個單位的穀胱甘肽還原酶(GR)，室溫下攪拌反應2小時。反應產物用Amicon超濾管(MWC030kD)純化，除去溶液中多餘的物質，最後分散在超純水中，4°C保存。
[0023]2、鹼性磷酸酶的檢測
[0024]將40 μ L不同濃度的鹼性磷酸酶加入到0.5mol/L 二乙醇胺檢測液中(pH9.8，且含有8mmol/L對氨基磷酸酹,2mmol/L AgNO3和15nmol/L納米金),在37°C孵育一定的時間後觀察其顏色變化或者用紫外可見光譜儀測定其吸收光譜。
[0025]3、特異性實驗
[0026]採用一定濃度的葡萄糖、尿素、抗壞血酸、細胞色素和凝血酶作為對照，分別按照步驟2進行實驗。
[0027]4、血清樣品中ALP的檢測[0028]取I μ L的人新鮮血清，用ρΗ9.8的二乙醇胺溶液稀釋40倍後直接採用步驟2檢測人血清中的ALP。另外還將一定量的ALP加入到人血清中測定其標準回收率。
[0029]二、結果
[0030]1、酶促金屬化的表徵
[0031]檢測鹼性磷酸酶的原理如圖1所示，在鹼性磷酸酶的催化作用下，銀離子能夠被還原沉積到納米金表面，通過檢測溶液的顏色變化及紫外可見吸收光譜變化而對鹼性磷酸酶進行定性和定量的檢測。該發明中所製備的納米金平均粒徑約為6nm，具有良好的分散性和穩定性，且在520nm處具有納米金的SPR特徵峰(圖2B)。當將鹼性磷酸酶加入到含有納米金、對氨基磷酸酚和硝酸銀的檢測液中時，就能發生如圖1B所示的酶促金屬化的反應，
其反應方程式為:
[0032]
【權利要求】
1.一種檢測鹼性磷酸酶的方法，其特徵在於，將鹼性磷酸酶加入到含有對氨基磷酸酚、硝酸銀、納米金的二乙醇胺緩衝液中孵育，利用緩衝液的顏色變化及紫外可見吸收光譜的變化實現對鹼性磷酸酶的檢測。
2.根據權利要求1所述的檢測鹼性磷酸酶的方法，其特徵在於，所述二乙醇胺緩衝液為0.5 mo I/L pH 9.8的二乙醇胺緩衝液，其中含有8 mmol/L的對氨基磷酸酚、2 mmol/L的硝酸銀和15 nmol/L的納米金。
【文檔編號】G01N21/78GK103645185SQ201310692746
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月17日 優先權日:2013年12月17日
【發明者】張志凌, 周川華, 趙靜雅, 龐代文 申請人:武漢大學