二倍體細胞狂犬疫苗及純化狂犬疫苗，劑型凍幹及水針的製作方法
2023-05-14 23:19:36
專利名稱：二倍體細胞狂犬疫苗及純化狂犬疫苗，劑型凍幹及水針的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種狂犬病純化疫苗，特別是在人用二倍體細胞上接種狂犬病毒毒種得到的狂犬病純化疫苗。
背景技術：
目前世界大量生產的狂犬疫苗有四種第一種以美國為代表的二倍體細胞，經過濃縮超離製備的狂犬疫苗；第二種以法國為代表的Vero細胞為培養基質的，生產凍幹滅活疫苗，但不能保證細胞基質的致瘤和細胞的DNA。第三種和第四種以中國為代表的地鼠腎和日本的雞胚、鴨胚這幾種疫苗細胞來源於普通動物無法保證細胞不攜帶外源因子也不能保證細胞基質的致瘤性和細胞的DNA。
人二倍體細胞疫苗(HDCV)1964年Wiktor在Wistar研究所首次描述HDCV，並進一步通過比較度驗最終將來源於Semple疫苗生產用PM狂犬病毒株適應到WI-38人二倍體細胞株(後來又適應到MRC-5細胞株)。培養病毒經澄清、加熱和β-丙內酯滅活、凍幹製備成疫苗。該疫苗於1974年首次獲準生產，並於1978年開始商品化。HDCV不含任何神經毒因子，並不含任何外源動物雜質，因而可以解釋它在重複注射後較好的耐受。採用NIH法檢測疫苗的穩定性證實，疫苗在4℃和37℃放置一個月後，無明顯差異。進一步將5批效價4.3～5.6的疫苗4℃存放3年半，所有批號滴度均大於2.5IU/劑。
早期調查發現，HDCV預防接種後1月或3月達到抗體峰值(10IU左右)，隨後便逐漸降低，但1～2年內滴度始終大於0.5IU，通過1～3年內加強免疫後，抗體滴度迅速增加10～15倍，肌肉注射和皮下注射途徑相近。
HDCV的問世使人們對傳統疫苗免疫原性的評價有了根據。Shah等證實2～4針HDCV接種人體後獲得的抗體反應與14針Semple疫苗相當，Cost-Berger通過志願者分別注射3針HDCV和SMBV，發現前者誘生的抗體反應是後者的5倍。通過HDCV和DEV比較也證實後者僅具有限的效力。Bahmanyar在當時得出的結論是，在人體試驗中所使用的任何疫苗的免疫原性都無法和HDCV相比。人二倍體細胞(HDC)為正常核型細胞，無致癌性，並且由於HDCV所具有的高免疫原性和良好的耐受性，目前在美國、加拿大、大多數歐洲國家和幾個亞洲國家使用，這使其成為評價任何一種人用新疫苗的標準疫苗。
HDCV的缺點在於HDC不太容易培養，而且狂犬病毒在HDC上培養的病毒滴度相對較低，僅能在空間有限的細胞瓶內培養，這使得疫苗的價格非常昂貴。在美國，用HDCV暴露後處理一個療程費用高達一千多美元；而在巴基斯坦，用Semple疫苗進行全療程處理只需2.5美元，這樣就限制了該疫苗在發展中國家的使用。同時用該方法製備狂犬病疫苗的詳細描述未見報導。由於狂犬病疫苗的特殊性和複雜性，製備該疫苗具有相當的難度，特別是在分離和純化方面。原代細胞培養疫苗地鼠腎細胞疫苗(PHKCV)用地鼠腎細胞組織培養狂犬病毒發展滅活疫苗首先由Kissling提出並由Fenje進一步發展，將SAD狂犬病毒固定毒適應到地鼠腎細胞(PHKC)上生產滅活的疫苗，並獲得成功。1968年該疫苗在加拿大批准用於人體加強和暴露前接種。
我國的PHKCV由衛生部武漢生物製品研究所林放濤領導的小組研製而成。開始實驗所用毒種為北京株兔腦固定毒，經″混合細胞培養法″在PHKC上適應，連續傳50～60代適應成功；再經豚鼠腦和PHKC交替3次傳代的毒株稱為aG株。aG株病毒在PHKC上培養收穫，福馬林滅活，加Al(OH)3佐劑。疫苗規定效價為1.3～2.5IU，經超濾濃縮後，濃縮疫苗效價須≥2.5IU。經臨床試驗證明，各種劑型的PHKCV在人體中的抗體反應均優於羊腦Semple疫苗。
該疫苗於1980年在我國獲得國家衛生部批准的生產文號，取代Semple疫苗。在過去的十多年裡，我國生產的PHKCV是世界上累計生產量最大的狂犬病疫苗，高峰年份每年此類疫苗的產銷量超過500萬人份。目前，我國各生產單位正逐步採用改進的濃縮-精製PHKCV。
雞胚細胞疫苗Kando 1965年將Flay HEP株適應到雞胚細胞，培養病毒經β-丙內酯滅活、濃縮、凍幹(後採用區帶離心純化加以改進)製備成疫苗並在日本商品化生產。1983年Barth等從上述日本疫苗分化出一種用Flary LEP株適應到雞胚細胞上的純化雞胚細胞疫苗(PCECV)。培養病毒採用β-丙內酯滅活、並經蔗糖梯度區帶離心純化和濃縮。該疫苗目前由德國Chiro Behring GmbH公司生產。人體暴露前後的臨床試驗結果表明，疫苗的免疫效果和HDCV相當，並且不會誘生針對雞細胞蛋白的抗體，使用該疫苗僅產生輕微的局部反應。PCECV現已在歐、亞、非、南美20多個國家獲準使用。1997年10月FDA批准該疫苗進入美國市場。
上述原代細胞培養疫苗具有的一個優點是不必冷凍保存細胞種。但每批疫苗檢查培養器官源的雜質(細菌、支原體、病毒)，並且動物器官的可用量是限制工業化生產的因素。
傳代細胞系疫苗Vero細胞疫苗1984年由法國Merieun研究所研製成功。製備過程中採用了使細胞貼附在微載體上懸浮培養的微載體技術以便進行工業化大罐培養。該疫苗使用的病毒株與HDCV相同，為PM1503-3M。收穫的病毒經超濾濃縮、密度梯度離心、β-丙內酯滅活製成凍幹疫苗。早期研究證實，在100個接種的實驗動物體內沒有腫瘤和轉移，每劑疫苗的殘餘細胞DNA量小於50pg，疫苗的穩定性極好，和HDCV相似。80年代和最近的大量實驗證實無論用作暴露前人體免疫或暴露後處理，Vero疫苗均獲得很好的免疫效果。
由於該疫苗進口價相對較高，因此，我國從1995年開始進行色譜純化的人用Vero細胞疫苗的研製。製備過程中使用的病毒株是適應到Vero細胞的狂犬病毒(CTN-1V)。目前已有包括衛生部上海生物製品研究所在內的多家生物製品研究所研製成功，並得到生產文號，以逐步取代我國現行的PHKCV。
Vero細胞較HDC能生產較高的狂犬病毒滴度，並可利用微載體技術進行工業化大罐培養，因而其價格較HDCV便宜。目前使用Vero細胞已累積生產1億劑脊髓灰質炎疫苗，2000萬劑狂犬病疫苗和100萬劑口服脊髓灰質炎疫苗，證實該細胞疫苗的安全性。但是用Vero細胞製備疫苗須在低細胞代數使用以確保無致瘤性，且殘餘細胞DNA量須小於100pg/劑。
在發展中國家常常發生停電或難以保證液氮供應，保存細胞種源比較困難。因而限制了這種疫苗的使用，發展新型的人用狂犬病疫苗以降低成本，特別是找到難以解決的純化工藝，是一項重要課題，本發明經過研究，找到了一種在人用二倍體細胞上接種狂犬病毒毒種得到的狂犬病純化疫苗，這些人用二倍體細胞是WI-38、CCC-HPF-1P5、MRC-5，所得到的疫苗，價格低廉，使用方便，純度高，適合大規模生產和大規模應用。
發明內容
本發明提供一種人用二倍體細胞狂犬病純化疫苗，該疫苗是在人用二倍體細胞上接種狂犬病毒毒種得到的狂犬病純化疫苗。
本發明還提供本發明的狂犬病純化疫苗的製備方法及其應用。
本發明採用的人用二倍體細胞是WI-38、CCC-HPF-1P5、MRC-5，優選的是WI-38。經過全面的研究鑑定，WI-38、CCC-HPF-1P5、MRC-5細胞具有胞核學穩定，沒有外源因子汙染和致瘤性對病毒敏感的優點，符合中國藥典2005版關於生物製品的傳代細胞的規程要求。
本發明提供一種人用二倍體細胞狂犬病純化疫苗，該疫苗是在人用二倍體細胞上接種狂犬病毒種，經分離純化得到的狂犬疫苗。所述疫苗病毒毒種選自狂犬毒種SNK-CTN株或SNK-aG株，優選的是SNK-CTN株。本發明的疫苗是凍幹注射劑或水針劑。
本發明的純化疫苗的製備方法，包括以下步驟(1)、人用二倍體細胞的復甦；(2)、人用二倍體細胞的培養擴增；(3)、在人用二倍體細胞上接種狂犬病毒毒種；(4)、收穫病毒液；(5)、病毒液的滅活；(6)、澄清超濾；(7)、純化；(8)、稀釋分裝。
所述純化可以包括以下步驟病毒液先經過超濾純化除去部分雜蛋白，再經過DEAE-SepharoseFF陰離子交換或區帶超速離心，然後經過Sepharose4FF柱或其他凝膠柱層析。所述人用二倍體細胞的培養擴增是在細胞營養液中進行的，細胞營養液由199培養液加入2-10％牛血清配製而成。細胞營養液在必要時還可加入適量的卡那黴素和慶大黴素。所述人用二倍體細胞的培養擴增是在轉瓶內培養。本發明的製備方法，還包括佐劑吸附步驟或/和加保護劑人血白蛋白的步驟。其中加入人血白蛋白的量優選的是使其濃度為0.2-0.5％。
本發明的狂犬病純化疫苗的製備工藝中，細胞培養所用的培養基是199培養基，採用超濾純化初步純化，蔗糖密度梯度離心法和Sepharose4FF凝膠過濾層析進行更純提純。測試結果表明，經過本發明的三步提純後，可使疫苗總蛋白含量減少約99％以上，牛血清殘餘量均符合中國藥典2005版關於生物製品規程的要求，加入氫氧化鋁佐劑後使疫苗的效價提高20％，穩定性同時大大提高，接種時減緩病毒釋放的速度，保持良好的抗體水平。通過純化疫苗加入佐劑能增加疫苗的持久性，疫苗能夠持久刺激機體產生抗體。
純化工藝包括以下步驟(1)、滅活病毒後製成粗疫苗；(2)、澄清過濾；(3)、超濾純化；(4)、蔗糖密度梯度離心；(或採用DEAE-SepharoseFF)陰離子交換)(5)、Sepharose4FF柱層析純化；(6)、佐劑吸附加保護劑人血白蛋白(或不加佐劑吸附)；(7)、稀釋分裝。
本工藝使用的人用二倍體細胞種來源於中國疾病預防控制中心，首先建立人用二倍體胞種子庫和人用二倍體細胞工作庫，並對細胞庫細胞進行系統的檢定。在製備疫苗之前，需先進行細胞的復甦、培養和擴增，以達到生產批量的需要。可使用動物細胞培養液加入牛血清配製而成的細胞營養液，所說的培養液可以選擇199培養液、平恆鹽培養液等，其中以使用199培養液效果較為理想，細胞營養液中最好含有2-10％的牛血清，PH7.0-7.6，在37±0.5℃進行培養擴增。
各種用於製備疫苗的哺乳動物細胞均為附著依賴性細胞，細胞在一定的載體上生長，本工藝中細胞的培養方式為轉瓶培養。
為防止細菌汙染，在配製細胞營養液的同時可加入適量的卡那黴素和慶大黴素。
培養過程中，細胞分種率根據生產批量的需要確定，一般可以是1∶2～1∶4當細胞長成緻密單層後，即可接種狂犬病毒，細胞維持液中最好加入0.4～0.5％(W/W)的人血白蛋白，同時調整PH7.2～7.8，培養溫度32～37℃，並可加入適量的胺基酸和抗生素，可供使用的培養液包括199液、平恆鹽液等，接種過程包括先用培養液如Earle氏液等衝洗細胞表面，去除殘留的牛血清，然後在已經生長成緻密單層的人用二倍體細胞上接種狂犬病毒毒種MOL0.1～0.01及上述細胞維持液，培養72小時左右，即可收穫病毒。
本工藝在人用二倍體細胞上接種的狂犬病毒為在傳代的人用二倍體狂犬病毒種，實驗結果顯示，狂犬病毒在人用二倍體細胞上能夠很好地生長繁殖，在人用二倍體細胞傳代狂犬病毒10代以內很穩定，並且製備人用二倍體細胞狂犬疫苗方面，10代以內的細胞傳代毒種的免疫原性沒有明顯改變，而10代以後的毒種的免疫原性則有明顯的下降，也就是說，製備疫苗最好選用10代以內的傳代毒種，10代以後的毒種不宜用於製備純化疫苗。至於毒種則優選狂犬毒種SNK-CTN株在人用二倍體細胞的傳代毒種。
狂犬病毒在人用二倍體細胞上的生長繁殖可維持較長時間，因此病毒的收穫可採取多次收取的方式，最好是第3～4天收穫一次，對收穫的病毒液及時測定病毒滴度，要求每批所收穫病毒液病毒滴度均應在105.0LD50/ml以上，因為只有高滴度的病毒液才能保證疫苗的高效力。
收穫的病毒液用β-丙內酯滅活病毒得到的是粗疫苗。
滅活後的粗疫苗需要進行濃縮提純製備成純疫苗製品，本工藝選用超濾濃縮的方法對得到的粗疫苗進行濃縮，一般是用截留10萬～30萬分子量的超濾器濃縮疫苗，濃縮至20倍以上，然後純化疫苗。
以人用二倍體細胞製備生物製品安全性的關鍵是殘餘牛血清殘留量的含量。按中國藥典2005版有關生物製品的規程要求，疫苗的牛血清殘留量必須小於50ng/ml。有關疫苗的純化方法包括化學方法和物理方法等可以有多種，經反覆試驗和研究，本工藝提出純化方法超濾純化、超離純化和Sepharose 4FF柱層析純化。另外採用無血清培養基培養可以直接排除血清對製品的影響。
超濾純化疫苗即把疫苗超濾濃縮到一定倍數，然後加入適量的PBS衝洗，再濃縮到原倍數，再加入適量的PBS衝洗如此反覆5～6次，牛血清殘留量可以去除93％以上，再經過蔗糖密度梯度離心法參考石慧穎1998年發表的大規模區帶離心純化的方法純化人用二倍體細胞乙腦疫苗的方法，用36％和45％(W/W)的蔗糖密度梯度，23000rpm超速離心4小時，經過對紫外吸收峰的抗原含量，蛋白濃度的分析，確定了病毒所在的位置。然後再經過Sepharose 4FF純化，而凝膠過濾層析是層析技術中最簡單，條件最溫和，對保持生物大分子的活性最有利的方法，適合分離分子量懸殊的物質，狂犬病毒的分子量在400萬以上，與疫苗中的雜蛋白分子量相差較大，故使用凝膠柱層析可以非常方便有效地去除濃縮疫苗中殘留的小分子雜質，該凝膠過濾柱可以是Sepharose 4FF柱或其他凝膠，而檢測結果表明，經三步層析柱純化後，疫苗總蛋白含量減少約99％以上，牛血清的殘餘量均符合中華人民共和國藥典的有關規程要求，而且比規程所要求的含量更低。純化疫苗製成成品(即水針劑型)，加入保護劑人血白蛋白和氫氧化鋁佐劑。用人用二倍體細胞作為疫苗的生產基質，並且以人用二倍體細胞的傳代毒種代替現有的地鼠腎細胞和Vero細胞毒種，通過相應的工藝方法生產製備出高質量的狂犬疫苗。用本工藝製備的狂犬病純化疫苗中不含外源因子，純度高，免疫效果大大提高，使用安全性高，並能實現狂犬疫苗的大規模工業化生產。
本工藝與目前使用的來自地鼠腎細胞或Vero細胞疫苗相比，最主要的優點如下(1)人用二倍體細胞已被證明不含任何汙染因子和致瘤性，作為生產疫苗的基質，明顯優於現行疫苗的地鼠腎細胞和Vero細胞；(2)人用二倍體細胞狂犬疫苗的毒種是人用二倍體細胞培養的毒種，從根本上更新了地鼠腎提純疫苗和Vero細胞疫苗；(3)用人用二倍體細胞生產疫苗工藝，適用於工業化生產批量的均質疫苗，這是現行的地鼠腎細胞疫苗和Vero細胞疫苗辦不到的，(4)本工藝製備的疫苗經提純後抗原活性明顯提高，雜蛋白減少99％以上，疫苗的純度大大提高。
圖1為本發明製備方法的方框流程圖。
具體實施例方式以下通過實施例進一步說明本發明。
實施例1二倍體細胞來自中國疾病預防控制中心，細胞營養液為199培養基中含有2-10％牛血清和25IU/ml慶大黴素和25IU/ml卡那黴素，並調整PH到7.2，用3L轉瓶37℃培養成緻密單層後按照12分種率擴增，擴增到生產批量時，經過4天左右，當細胞長成緻密單層，棄去細胞營養液，用PH7.2的Earl’s液衝洗細胞面，接種二倍體細胞狂犬病毒，使用狂犬毒種SNK-CTN株在二倍體細胞上傳代的第二代工作毒種，毒種濃度MOI0.05，細胞維持液為含0.4-0.5％(W/W)人血白蛋白的199培養液，PH7.6，35℃下培養，24小時後換以新鮮細胞維持液繼續培養2天，開始收穫病毒，每3-4天收穫一次，共收3次，每批病毒液均取樣進行病毒滴定和無菌試驗，要求收穫病毒液的病毒液的病毒滴度達到105.0LD50/ml以上；合併病毒液加入β-丙內酯(終濃度1/4000)置於4±1℃，24小時滅活病毒，得到粗疫苗，用截留30萬分子量的超濾器濃縮成60倍濃縮疫苗。
超濾純化的濃縮疫苗過蔗糖密度梯度離心法和凝膠過濾柱Sepharose4FF，經三步純化，得到純化疫苗，加入人血蛋白保護劑和氫氧化鋁佐劑製成純化疫苗成品，分裝，製成狂犬病純化疫苗為水針劑型5ml規格。
檢定疫苗效力達到了中國狂犬疫苗參考品和美國狂犬疫苗參考品要求，其他各項檢定均合中華人民共和國藥典2005版生物製品規程的疫苗要求。
實施例2二倍體細胞來自中國疾病預防控制中心，細胞營養液為199培養基中含有2-10％牛血清和25IU/ml慶大黴素和25IU/ml卡那黴素，並調整PH到7.2，用3L轉瓶37℃培養成緻密單層後按照1∶2分種率擴增，擴增到生產批量時，經過4天左右，當細胞長成緻密單層，棄去細胞營養液，用PH7.2的Earl’s液衝洗細胞面，接種二倍體細胞狂犬病毒，使用狂犬毒種SNK-CTN株在二倍體細胞上傳代的第二代工作毒種，毒種濃度MOI0.05，細胞維持液為含0.4-0.5％(W/W)人白蛋白的199培養液，PH7.6，35℃下培養，24小時後換以新鮮細胞維持液繼續培養2天，開始收穫病毒，每3-4天收穫一次，共收3次，每批病毒液均取樣進行病毒滴定和無菌試驗，要求收穫病毒液的病毒液的病毒滴度達到105.0LD50/ml以上；合併病毒液加入β-丙內酯(終濃度1/4000)置於4±1℃，24小時滅活病毒，得到粗疫苗，用截留30萬分子量的超濾器濃縮成60倍濃縮疫苗。
超濾純化的濃縮疫苗過蔗糖密度梯度離心法和凝膠過濾柱Sepharose4FF，經三步純化，得到純化疫苗，加入人血蛋白保護劑和氫氧化鋁佐劑製成純化疫苗成品，分裝，製成狂犬純化疫苗為水針劑型0.5ml規格。
檢定疫苗效力達到了中國狂犬疫苗參考品和美國狂犬疫苗參考品要求，其他各項檢定均合中華人民共和國藥典2005版生物製品規程的疫苗要求。
實施例3用權利要求1方法製備的狂犬滅活疫苗，給未接種過狂犬疫苗者接種狂犬病純化疫苗14天後，中和抗體陽轉率高於95.0％，且無副反應發生。
權利要求
1.一種人用二倍體細胞狂犬病純化疫苗，其特徵是，該疫苗是在人用二倍體細胞上接種SNK-CTN毒種，經分離純化得到的狂犬疫苗。
2.權利要求1的純化疫苗，其特徵在於，所述狂犬病毒毒種選自狂犬毒種CTN株或aG株，所述人用二倍體細胞是WI-38、CCC-HPF-1P5、MRC-5。
3.權利要求1的純化疫苗，其特徵在於，是凍幹注射劑或水針劑。
4.權利要求1的純化疫苗的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟(1)、人用二倍體細胞的復甦；(2)、人用二倍體細胞的培養擴增；(3)、在人用二倍體細胞上接種狂犬病毒毒種；(4)、收穫病毒液；(5)、病毒液的滅活；(6)、純化。
5.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於，所述純化包括以下步驟(1)、滅活病毒後製成粗疫苗；(2)、澄清過濾；(3)、超濾純化；(4)、蔗糖密度梯度離心或採用DEAE-SepharoseFF陰離子交換；(5)、Sepharose4FF柱層析純化；(6)、佐劑吸附，加保護劑人血白蛋白。
6.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於，所述人用二倍體細胞的培養擴增是在細胞營養液中進行的，細胞營養液由199培養液加入2-10％牛血清配製而成。
7.根據權利要求6所述的製備方法，其特徵在於，細胞培養液中還加入適量的卡那黴素和慶大黴素。
8.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於，所述人用二倍體細胞的培養擴增是在轉瓶內培養。
9.根據權利要求3所述的製備方法，其特徵在於，還包括佐劑吸附步驟或/和加保護劑人血白蛋白的步驟。
10.根據權利要求9所述的製備方法，其特徵在於，加入人血白蛋白使其濃度為0.2--0.5％。
全文摘要
本發明涉及二倍體細胞狂犬病純化疫苗，其劑型為凍幹注射劑及水針劑，該疫苗是在人用二倍體細胞上接種狂犬病毒毒種得到的狂犬病純化疫苗。
文檔編號A61K39/205GK1712068SQ200510080058
公開日2005年12月28日 申請日期2005年6月28日 優先權日2005年6月28日
發明者崔棟 申請人:崔棟