病毒濃縮方法

2023-05-14 23:28:06 2

專利名稱：病毒濃縮方法
技術領域：
本發明涉及能夠在保持其感染能力的同時對病毒、病毒載體進行濃縮的新方法， 以及用於進行該方法的試劑盒。本發明涉及逆轉錄病毒載體、皰疹病毒載體等、對基因治 療、疫苗等有用的載體的安全且簡便的濃縮技術。
背景技術：
目前為止，出於基因治療、疫苗治療目的，開發出了各種病毒載體，其成果值得期 待。但是，如果病毒載體濃度低，則無法充分地獲得期望的效果，因而有調整濃度的必要。在 基因治療領域中，針對細胞的基因導入效率左右著治療的成敗，因此，使用基因導入效率高 的病毒載體。但是，對於包括慢病毒載體在內的逆轉錄病毒載體等而言，尚未獲得效價高的 病毒，因而無法獲得充分的基因導入效率。因此，開發出了各種病毒濃縮技術、以及利用該 技術得到的製品，但現狀是在實用方面還存在多種問題。作為提高溶液中病毒的濃度、對病毒進行濃縮的方法，可以列舉出例如超離心分 離法。但是，該方法需要昂貴的儀器和漫長的分離時間，且作業中需要大量的勞力。此外， 還有用硫酸銨、聚乙二醇等沉澱病毒來進行濃縮的方法，但這些方法中，由於使用的試劑或 進行沉澱的其它成分對感染細胞有害等原因，存在阻礙後續操作的隱患。因此，存在的問題 是病毒沉澱後必須對試樣進行純化，需要大量的勞力。此外，還開發出了使用抗體來濃縮 病毒粒子本身的方法(特開2002-78485)。但是，該方法抑制病毒表面的蛋白質功能，存在 對病毒的感染性造成影響的隱患。例如，將病毒粒子從抗體分離時，必須要使用強酸性條件 (例如PH2 3)，這就存在給病毒粒子造成不適的隱患。作為其它的病毒濃縮方法，公開了例如使用結合有甘露糖結合型凝集素的磁性粒 子的方法(特開2002-165591)。而且，作為提高逆轉錄病毒的效價、或者從待檢物樣品分離逆轉錄病毒的方法，還 公開了利用鏈黴抗生物素蛋白與生物素化凝集素的方法(W02001/079456)。但是，在上述的 任何文獻中，病毒均是以與載體結合的形式使用，無法分離出病毒本身。因此，採用這些方 法濃縮的病毒的用途受到了限制。現有技術文獻專利文獻1特開2002-078485號公報專利文獻2特開2002-165591號公報專利文獻3國際申請公開第W02001/079456號小冊子

發明內容
發明所要解決的問題在對體液中的病毒進行定量時，如果濃度低至現有方法的檢測限以下，則有時無 法進行定量。此外，在將病毒載體應用於基因治療、疫苗治療等時，如果病毒載體濃度小，則 無法獲得期望的效果，因此存在調整濃度的必要。
本發明的目的是提供一種能夠以簡潔的方法濃縮溶液中的病毒、病毒載體的方 法。此外，本發明的目的還在於提供從濃度低的病毒溶液中在保持病毒、病毒載體的感染 能力的同時，簡單容易地對病毒、病毒載體進行濃縮，並以已分離的狀態獲取病毒、病毒載 體的方法。本發明的目的還在於提供安全且簡便地對逆轉錄病毒載體、皰疹病毒載體等在 基因治療、疫苗等中有用的病毒載體進行濃縮的技術。解決問題的方法為解決上述課題，本發明人等進行了深入研究，結果開發出了能夠以簡潔的方法 對溶液中的病毒、病毒載體進行濃縮的技術。更具體地，本發明人等通過使凝集素與含目標 病毒液結合、再使病毒-凝集素複合體與載體結合，然後分離並回收結合了病毒的該載體， 並加入糖，僅將對象病毒從該載體洗脫到適量的溶液中，而不使其失去感染能力，從而成功 製備使其濃度高於最初的含病毒液的濃度。此外，本發明人等發現對於人皰疹病毒，通過使用SBA(大豆來源，結合糖鏈含 N-乙醯半乳糖胺(N-acetylgalactosamine) (GalNAc)的糖鏈)、SSA (無梗接骨木(二水> 二 7卜二，Sambucus racemosa)來源，結合糖鏈含α 2-6鍵的唾液酸(α 2-6結合 〉7 卟酸)(Siaa 2_6)的糖鏈)、DSA(白曼陀羅(手3々七寸辦才，Datura metel)來源， 結合糖鏈含N-乙醯葡糖胺(N-acetylglucosamine) (GlcNAc)的糖鏈)、WGA (小麥胚芽來 源，結合糖鏈含N-乙醯葡糖胺(GlcNAc)或唾液酸的糖鏈)作為凝集素，病毒載體的回收 率顯著提高。此外，還發現對於慢病毒載體，通過使用WGA或SBA作為凝集素，病毒載體的回收
率顯著提高。而且，本發明人等通過用合適的糖對採用上述方法回收的結合了病毒、病毒載體 的載體進行處理，成功地從結合了病毒載體的載體洗脫了病毒載體。令人驚訝的是，這樣 分離出的病毒能夠保持感染能力。此外，本發明人等發現作為這樣的用於洗脫病毒、病毒 載體的糖，當凝集素是WGA時優選使用殼寡糖(chito-oligosaccharide)；當凝集素是SBA 時，優選使用N-乙醯基-D-半乳糖胺或含N-乙醯基-D-半乳糖胺的糖。基於以上認識，本發明提供對於病毒、病毒載體，能夠在保持其感染能力的同時， 簡單容易地對其進行濃縮的新濃縮方法。SP，本發明如下。實施方式1 一種濃縮病毒的方法，該方法包括以下步驟(1)通過使凝集素與含病毒液接觸並使病毒與凝集素結合，從而(i)該凝集素與 能夠與載體結合的分子相連接，進而通過該分子結合於載體，從而與凝集素結合的病毒間 接地結合於載體，或者(ii)該凝集素直接結合於載體，由此與凝集素結合的病毒結合於載 體；(2)從含病毒液分離載體；(3)用含糖的洗脫液處理回收的載體，並從該載體洗脫病毒，其中，該洗脫液的量 少於(1)的含病毒液的容積；以及(4)從(3)的洗脫液分離載體，從而得到病毒濃縮液。實施方式2 —種濃縮病毒的方法，該方法包括以下步驟(1)在含病毒液中混合生物素化凝集素，並使病毒與生物素化凝集素接觸，添加結
5合有生物素結合蛋白質載體，使與生物素化凝集素結合的病毒結合於載體；(2)從含病毒液分離載體；(3)用含糖的洗脫液處理回收的載體，從該載體洗脫病毒，其中，該洗脫液的量少 於(1)的含病毒液的容積；以及(4)從(3)的洗脫液分離載體，從而得到病毒濃縮液。實施方式3 根據實施方式1或2所述的方法，其中，所述病毒是具有包膜的病毒 或從具有包膜的病毒來源的病毒。實施方式4 根據實施方式1或2所述的方法，其中，所述病毒是慢病毒或皰疹病實施方式5 根據實施方式1或2所述的方法，其中，所述凝集素是與包含N-乙醯 半乳糖胺(GalNAc)、α 2-6鍵的唾液酸(Siaa 2-6)、Ν_乙醯葡糖胺(GlcNAc)中的至少一種 的糖結合的凝集素。實施方式6 根據實施方式5所述的方法，其中，所述凝集素選自SBA (大豆來源)、 SSA(無梗接骨木來源)、DSA(白曼陀羅來源)和WGA(小麥胚芽來源)。實施方式7 根據實施方式1或2所述的方法，其中，所述凝集素是WGA(小麥胚芽 來源)，用於病毒的洗脫的糖是殼寡糖；或者，所述凝集素是SBA(大豆來源)，用於病毒的洗 脫的糖是N-乙醯基-D-半乳糖胺或含N-乙醯基-D-半乳糖胺的糖。實施方式8 根據實施方式1或2所述的方法，其中，所述病毒是慢病毒，所述凝 集素是WGA(小麥胚芽來源)，用於病毒的洗脫的糖是殼寡糖；或者，所述病毒是慢病毒，所 述凝集素是SBA (大豆來源)，用於病毒的洗脫的糖是N-乙醯基-D-半乳糖胺或含N-乙醯 基-D-半乳糖胺的糖。實施方式9 一種濃縮病毒的方法，該方法包括以下步驟(1)使直接結合於直徑IOnm IOOnm的納米珠的凝集素與含病毒液接觸，並使病 毒結合於納米珠；(2)從含病毒液分離納米珠；(3)用含糖的洗脫液處理回收的納米珠，並從該納米珠洗脫病毒，其中，該洗脫液 的量少於(1)的含病毒液的容積；以及(4)從(3)的洗脫液分離納米珠，從而得到病毒濃縮液。實施方式10 —種用於通過實施方式2所述的方法濃縮病毒的試劑盒，該試劑盒 包含生物素化凝集素、生物素結合蛋白質珠和用於從載體洗脫病毒的糖。實施方式11 一種用於通過實施方式2所述的方法濃縮病毒的試劑盒，該試劑盒 包含(a)生物素化WGA、生物素結合蛋白質和殼寡糖；或(b)生物素化SBA、生物素結合蛋白質和N-乙醯基-D-半乳糖胺或含N-乙醯 基-D-半乳糖胺的糖。發明效果根據本發明，對於溶液中的病毒、病毒載體，能夠在保持其感染能力的同時，簡單 容易地對其進行濃縮。


圖1為螢光顯微鏡照片，顯示了針對HHV-6對tamavidin珠的非特異性吸附進行 試驗的結果。發綠色光的點表示EGFP重組HHV-6感染作為指示細胞(indicator cell)的 MT-4細胞，1個點表示1個感染性病毒粒子(各點的亮度差異是由感染後病毒基因表達的 差異引起的)。左側照片表示使HHV-6病毒液(原液)作用於MT-4細胞的情況。右側照片 表示在不存在凝集素的條件下使HHV-6病毒液(原液)與tamavidin珠接觸、並使吸附於 tamavidin珠的病毒作用於MT-4細胞的情況。圖2為螢光顯微鏡照片，顯示了針對ABA、DSA、Lotus、MAM和PHA-E4各凝集素的 HHV-6濃縮效果進行試驗的結果。發綠色光的點表示EGFP重組HHV-6感染作為指示細胞的 MT-4細胞，1個點表示1個感染性病毒粒子(各點的亮度差異是由感染後病毒基因表達的 差異引起的)。圖3為螢光顯微鏡照片，顯示了針對PHA-L4、UEA-I、SBA、和SSA各凝集素的HHV-6 濃縮效果進行試驗的結果。發綠色光的點表示EGFP重組HHV-6感染作為指示細胞的MT-4 細胞，1個點表示1個感染性病毒粒子(各點的亮度差異是由感染後病毒基因表達的差異引 起的)。圖4為圖表，顯示了利用凝集素和tamavidin珠對唾液中的HHV-6進行濃縮的程度。圖5為圖表，顯示了使用凝集素和tamavidin珠對唾液中的HHV-6進行濃縮以及 利用糖進行洗脫時的HHV-6的濃縮程度。圖6為螢光顯微鏡照片，顯示了利用凝集素和tamavidin珠對慢病毒載體進行濃 縮的試驗結果。發綠色光的點表示EGFP重組慢病毒載體感染作為指示細胞的293細胞，1 個點表示1個感染性病毒粒子(各點的亮度差異是由感染後病毒基因表達的差異引起的)。圖7為圖表，顯示了利用凝集素和tamavidin珠對慢病毒載體進行濃縮的程度。發明的
具體實施例方式以下，對本發明進行更具體的說明。1.濃縮病毒的方法本發明提供一種濃縮病毒的方法，該方法包括以下步驟(1)通過使凝集素與含病毒液接觸並使病毒與凝集素結合，其中，(i)通過使該凝 集素與能夠和載體結合的分子相連接，進而通過該分子結合於載體，從而與凝集素結合的 病毒間接地結合於載體，或者(ii)該凝集素直接結合於載體，由此與凝集素結合的病毒結合於載體；(2)從含病毒液分離載體；(3)用含糖的洗脫液處理回收的載體，並從該載體洗脫病毒，其中，該洗脫液的量 少於(1)的含病毒液的容積；以及(4)從(3)的洗脫液分離載體，從而得到病毒濃縮液。以下，對本發明的方法的各要素進行具體說明。病毒在本發明的方法中作為濃縮對象的病毒是具有包膜的病毒或該病毒來源的病毒 載體。在優選的實施方式中，濃縮對象病毒可以選自痘病毒(poxvirus)、痘病毒來源載體、
7披膜病毒(toga virus)、披膜病毒來源載體、冠狀病毒(Coronavirus)、冠狀病毒來源載體、 黃病毒(flaVivirus)、黃病毒來源載體、逆轉錄病毒(retrovirus)、逆轉錄病毒來源載體、 皰疹病毒(Herpesvirus)以及皰疹病毒來源載體。在其它優選的實施方式中，濃縮對象病 毒可以是慢病毒(Lentivirus)、慢病毒來源載體、人皰疹病毒(human herpes virus)6(人 皰疹病毒6的變體A和B 以下合稱HHV-6)、HHV-6來源載體、人皰疹病毒7 (以下記作 HHV-7)、HHV-7來源載體、巨細胞病毒(Cytomegalovirus)(別名人皰疹病毒5)、HHV_5來源 載體、愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein Barrvirus) (EBV)或EBV來源載體，更優選為慢病毒、 慢病毒來源載體、HHV-6、HHV-6來源載體、HHV-7或HHV-7來源載體。含病毒液在本說明書中，「含病毒液」是指含有在本發明的方法中作為濃縮對象的病毒的 材料。因此，含病毒液可以是例如，緩衝液中包含作為濃縮對象的病毒或病毒載體而得到的 液體，或者可以是體液。在本說明書中，有些情況下也將「含病毒液」簡記為試樣。包含作為濃縮對象的病毒或病毒載體的液體，可以採用本領域技術人員公知的方 法來製備。在本說明書中，並非限定，體液可以選自唾液、血液、血清、精液、腦脊髓液、咽喉擦 出液(pharyngeal swab)、母乳、腹水、汗、淚和尿。體液可以採用本領域技術人員公知的方 法採集。此外，對於採集的體液，在不影響病毒粒子的感染能力的前提下，也可以視需要進 行處理。凝集素在本說明書中，「凝集素」是指識別糖鏈並與之結合的糖結合性蛋白質。就與凝集 素結合的糖鏈而言，各種凝集素具有特異性。在本發明的方法中所用的凝集素只要是能夠結合病毒即可，沒有特殊限制。優選 的凝集素的例子是與包含N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)、α 2-6鍵的唾液酸(Sia α 2-6)、Ν_乙 醯葡糖胺(GlcNAc)中的至少一種的糖鏈結合的凝集素，更優選可以列舉出SBA(大豆來源 凝集素。結合糖鏈含N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)的糖鏈)、SSA (無梗接骨木來源凝集素。 結合糖鏈含α2-6鍵的唾液酸(Siaa2-6)的糖鏈)、DSA (白曼陀羅來源凝集素。結合糖 鏈含N-乙醯葡糖胺(GlcNAc)的糖鏈)、或WGA (小麥胚芽來源凝集素。結合糖鏈含N-乙 醯葡糖胺(GlcNAc)或唾液酸的糖鏈)等凝集素。特別是，為了濃縮人皰疹病毒或人皰疹病毒來源載體，更優選使用SBA、SSA、DSA 或WGA。為了濃縮慢病毒或慢病毒來源載體，更優選使用SBA或WGA。在本發明的一類實施方式中，凝集素可以與載體直接結合併使用。在其它實施方式中，凝集素可以間接與載體結合併使用。作為間接結合的例子，可 以是生物素-生物素結合性蛋白質的結合介導的凝集素與載體的結合。更具體地，通過將 凝集素生物素化，並在載體表面結合生物素結合性蛋白質，使生物素與生物素結合性蛋白 質結合，可以實現凝集素與載體的間接結合。在本發明中，載體只要是固體或不溶性材料(例如，能夠通過過濾、沉澱、磁性分 離等從反應混合物分離的材料)的載體即可，沒有特殊限制。構成固體載體的材料包括纖維素、特氟隆(teflon)(註冊商標)、硝酸纖維素(nitrocellulose)、瓊脂糖、高交聯球形瓊脂糖、葡聚糖、殼聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯醯胺、聚 酯、聚碳酸酯、聚醯胺、聚丙烯、尼龍、聚偏二氟乙烯(polydivinylidene difluoride)、膠 乳、二氧化矽、玻璃、玻璃纖維、金、鉬、銀、銅、鐵、不鏽鋼、鐵氧體、矽晶片(silicon wafer)、 聚乙烯、聚乙烯亞胺、聚乳酸、樹脂、多糖類、蛋白質(白蛋白等)、碳以及它們的組合等，但 不限於此。固體載體的形狀包括但不限於珠子、磁珠、薄膜、微細管、濾膜、板、微板、碳納米 管、傳感器晶片等。正如本技術領域公知的那樣，薄膜或板等平坦的固體載體上可以設置凹 坑、溝槽、濾膜底部等。在本發明的一類實施方式中，磁珠可以具有約IOnm 約Imm範圍的球體直徑。在 優選的實施方式中，磁珠具有約25nm 約1mm、約50nm 約IOOym範圍的直徑。磁珠的尺 寸可以根據特定的用途來進行選擇。在本發明的一類實施方式中，由S^harose等高交聯球形瓊脂糖製成的珠子可以 具有約24μπι 約165μπι範圍的直徑。在優選的實施方式中，高交聯球形瓊脂糖珠具有約 24 μ m 約44 μ m範圍的直徑。高交聯球形瓊脂糖珠的尺寸可以根據特定的用途來進行選 擇。具有疏水性表面的固體載體的例子包括可從Polysciences公司或Spherotech公 司購買的製品等聚苯乙烯膠乳珠。二氧化矽(SiO2)處理或二氧化矽(SiO2)基的固體載體的例子包括可從 Polysciences公司購買的超常磁性二氧化矽珠等。或者，還可以使用可從Dynal Biotech 公司購買的M-280等。作為具有親水性表面的磁珠的例子，可以列舉出Polysciences公司銷售的名稱 為Biomag (註冊商標)羧基的珠子、或者Bangs Laboratory公司的珠子(MC02N/2928)等。 或者，可以使用Dynal Biotech公司銷售的M-270等。凝集素ijjH本的盲接結合在本發明的一類實施方式中，凝集素與載體可以直接結合來使用。這種情況下， 從提高病毒與結合有凝集素的載體的結合可能性的觀點出發，載體可以是能夠做布朗運動 程度大小的納米珠。納米珠的優選球體直徑的範圍是IOnm IOOnm的球體直徑、更優選 30nm 70nm的球體直徑。此外，這種情況下，優選包含能夠用磁鐵簡便回收的磁體，例如 可以列舉出但不限於Miltenyi Biotech公司的MACS MicroBeads (直徑50nm)等磁性納米 珠。凝集素與載體的連接可以採用本領域技術人員公知的蛋白質與載體的偶聯方法 來進行。例如，對載體表面進行修飾，使得羧基露出來，然後使該羧基與蛋白質的氨基在交 聯試劑1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)的存在下進行偶聯反應，從而 將蛋白質與載體連接起來。或者，例如，通過在不含伯氨基的PH6. 5 9的緩衝液中混合載 體表面的羧基被N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)活性酯化後的載體與蛋白質，可以將載體表面的 羧基與蛋白質的氨基連接起來。或者，可以使用交聯試劑BS3(雙[磺基琥珀醯亞胺基]辛二酸鹽)或DSS(雙 琥珀醯亞胺基辛二酸酯(Disuccinimidyl suberate))，將載體表面的氨基與蛋白質的氨 基連接起來，或者使用交聯試劑SPDP(N-琥珀醯亞胺基3-[2_吡啶基二硫]丙酸酯)或GMBS (N-(4-馬來醯亞胺丁醯基氧)琥珀醯亞胺)將載體表面的氨基與蛋白質的硫醇基(千 才一>基)連接起來。_粘謝本_■合在本發明的其它實施方式中，凝集素可以間接與載體結合來使用。例如，通過將凝 集素生物素化，並在載體表面結合生物素結合性蛋白質，使生物素與生物素結合性蛋白質 結合，可以實現凝集素與載體的間接結合。這種情況下，作為載體，可以優選使用珠子，珠子的優選球體直徑的範圍是 0. 1 μ m 100 μ m的球體直徑，更優選0. 5 μ m 10 μ m的球體直徑，更優選1 μ m 5 μ m的
球體直徑。在本說明書中，「生物素」是指D-[⑴-Cis-六氫-2-氧代-IH-噻吩並_ (3，4)-咪 唑-4-戊酸]的通用名。生物素是屬於B族維生素的一種水溶性維生素，也稱作維生素B7、 維生素H或輔酶R。生物素是卵清中包含的一種糖蛋白質，其非常強烈地結合抗生物素蛋 白。在本說明書中，「生物素」除了上述的生物素以外，還包括亞氨基生物素 (iminobiotin) (Hofmann, et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 :4666_4668)、脫硫生 物素(desthiobiotin) (Hirsch, et al.，(2002) Anal. Biochem.，308 :343_357)、生物胞素 (biocytin)或生物素亞碸(biotin sulfoxide)等生物素類似物。在對凝集素進行生物素化時，可以列舉出使用生物素化試劑的方 法。作為生物素化試劑，可以利用例如=PIERCE公司製造的EZ-Link(註冊商 標)SUlf0-NHS-Bi0tin(13. 5 A、伯胺)(括號內依次為接頭長度、反應基團)、 EZ-Link (註冊商標)Sulfo-NHS-LC-Biotin (22. 4 A、伯胺)、EZ-Link (註冊商標) Sulfo-NHS-LCLC-Biotin (30. 5 A、伯胺)、EZ-Link (註冊商標)PFP-Biotin (9. 6 A、胺)、 EZ-Link(註冊商標)Maleimide-PEO2-Biotin(29. 1 A、硫醇基)、EZ-Link(註冊商標) Biotin-PEO2 Amine (20. 4 A、羧基)、EZ_Link (註冊商標)Biotin-PEO3-LC Amine (22. 9 A、 羧基)、EZ-Link (註冊商標)Biotin-Hydrazide (15. 7 A 、醛基)、EZ-Link (註冊商標) Biotin-LC-Hydrazide (24. 7 A 、醛基)、EZ_Link (註冊商標)NHS-Iminobiotin (13. 5 A、 伯胺)等，但不限於此。使用這樣的生物素化試劑，可以通過公知方法使生物素結合於凝集素。例如，在使用含NHS酯的生物素化試劑的情況下，通過用DMSO ( 二甲基亞碸)這樣 的有機溶劑或PH7-9的磷酸緩衝液進行溶解、並添加凝集素，可以結合生物素。此外，例如， 在使用含氨基的生物素化試劑的情況下，通過使用EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基) 碳化二亞胺鹽酸鹽)這樣的碳化二亞胺，在將凝集素的羧基轉換為活化酯後，添加用PH5附 近的緩衝液溶解的生物素化試劑，可以結合生物素。此外，結合有生物素的凝集素例如可以從J-Oil Mills公司以生物素標記凝集素 的形式購入。此外，還可以通過使用生物素標記試劑盒(例如但不限於Pierce公司製造的 EZ-Link(註冊商標)NHS-Lc-Biotin、Dojindo MolecularTechnologies 公司製造的 Biotin Labeling Kit_NH2等)，使生物素結合於期望的凝集素來製作。此外，通過將凝集素基因與編碼含生物素化序列的肽的DNA相融合，構建表達 該融合基因的載體，並在任意宿主中以與生物素化序列的融合蛋白質的形式進行表達(Schwarz et al.，(1988). J. Biol. Chem. 263 :9640_9645)，也可以製作生物素化凝集素。這 樣的載體可以列舉出但不限於例如Invitrogen公司的含BioEase (商標)標籤的載體。 這其中，哺乳類細胞表達用的有PcDNA (商標)6載體，大腸桿菌表達用的有PET104載體，或 者果蠅(Drosophila)表達用的有pMT/BioEase載體。在本發明中，作為生物素結合性蛋白質，只要是抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋 白、中性抗生物素蛋白(NeutrAvidin)、AVR 蛋白質(Biochem. J.，(2002)，363 :609_617)、 Bradavidin (J. Biol. Chem.，(2005)，28013250-13255)、Rhizavidin (Biochem. J.，(2007)， 405 :397-405)、tamavidin或它們的突變體等，與生物素和生物素/抗生物素蛋白結 合的蛋白質，均可以適宜使用。特別是，可以優選使用tamavidin及其突變體。而且， tamavidin是在食用蘑菇白黃側耳(pleurotus cornucopiae)中發現的生物素結合性蛋白 質(W002/072817 ；Takakura et al.，(2009) FEBS J.，276 1383-1397)。作為 tamavidin 的 突變體，可以列舉出例如高結合能力/低非特異性結合tamavidin (如本特願2008-208766， 未公開)等。本發明中的「tamavidin」是指tamavidin 1(胺基酸序列SEQ ID NO :5、編碼其 的核酸序列=SEQ ID NO 4) ,tamavidin 2 (胺基酸序列=SEQ ID NO :7、編碼其的核酸序列 SEQ ID NO :6)或它們的突變體。具體地，本發明的tamavidin典型地可以是包含SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :7的胺基酸序列的蛋白質，或者可以是由包含SEQ ID NO :4或SEQ ID NO 6的鹼基序列的核酸編碼的蛋白質。或者，本發明的tamavidin可以是包含SEQ IDNO 5或SEQ ID NO 7的胺基酸序列的蛋白質，或由包含SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 6的鹼基 序列的核酸編碼的蛋白質的突變體、且具有與tamavidin 1或2相同的生物素結合活性的 蛋白質或具有高結合能力/低非特異性結合的活性的蛋白質。在本說明書中，有些情況下 也簡單地將tamavidinl、tamavidin 2以及它們的突變體統稱為tamavidin。tamavidin 1或2的突變體可以是包含在SEQ ID NO :5或7的胺基酸序列中包含 1個或多個胺基酸的缺失、取代、插入和/或添加的胺基酸序列而形成的蛋白質、並且具有 與tamavidin 1或2等同的生物素結合活性的蛋白質。取代可以是保守取代，即將特定的 胺基酸殘基替換為具有相似物理化學特徵的殘基。保守取代的非限定性例子包括含脂肪族 基團的胺基酸殘基之間的取代(例如lie、Val, Leu或Ala間的相互取代)、極性殘基之間 的取代(例如Lys和Arg、Glu和Asp、Gln和Asn之間的相互取代)等。胺基酸缺失、取代、插入和/或添加而產生的突變體可以通過對編碼野生型蛋白 質的DNA實施例如作為公知技術的定點誘變(例如參見NucleicAcid Research, Vol. 10， No. 20,p. 6487-6500，1982，通過引用將其全文弓丨入到本說明書中)來製作。在本說明書中， 「一個或多個胺基酸」是指通過定點誘變方法能夠缺失、取代、插入和/或添加的程度的氨基 酸。此外，在本說明書中，「一個或多個胺基酸」根據情況也可以指1個或數個胺基酸。tamavidin 1或2的突變體還可以是包含與SEQ ID NO :5或7的胺基酸序列具有 至少60%以上、優選65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95% 以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上、更優選99. 3%以上的胺基酸同一性的氨 基酸序列的蛋白質，並且該蛋白質具有與tamavidin 1或2等同的生物素結合活性或者具 有高結合能力/低非特異性結合的活性。兩個胺基酸序列的同一性％可通過目測和數學計算來確定。或者，兩個蛋白質
11序列的同一性百分比可以通過使用以Needleman，S. B.及Wunsch，C. D. (J. Mol. Bol. ,48 443-453,1970)的算法為基礎的、可從威斯康星州大學遺傳學計算機組(UWGCG)獲得的GAP 電腦程式進行序列信息比較來確定。GAP程序優選的默認參數包括= (I)Henikoff, S.以 R Henikoff, J. G. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 10915-10919,1992)所記載的得分 / 矩 陣、bloSUm62; (2) 12分的空位罰分；(3) 4分的空位長度罰分；以及(4)末端空位不罰分。也可使用該領域技術人員使用的進行序列比較的其它程序。關於同一性百分 比，例如:Altschul 等(Nucl. Acids. Res.，25，p. 3389-3402，1997)中記載的使用 BLAST 程序可以對序列信息進行比較和確定。該程序可於網絡上在Nantional Center for Biotechnology Information(NCBI) DNA Data Bankof Japan(DDBJ)網立佔i^ffi。 $才目同 站點，對利用BLAST程序進行同一性檢索的各種條件(參數)進行了詳細記載，可對部分設 定進行適當變更，但檢索通常使用默認值來進行。此外，兩個胺基酸序列的同一性％也可用 遺傳信息處理軟體GENETYX Ver. 7 (GENETYX制)等程序或FASTA算法等來確定。此時，也 可用默認值檢索。兩個核酸序列的同一性％可通過目測和數學計算來確定，此外，該比較更優選使 用電腦程式對序列信息進行比較。具有代表性的優選電腦程式為遺傳學計算機組 (GCG ；威斯康星州Madison)的威斯康星·軟體包、10. O版「GAP」程序(Devereux等，1984， Nucl. Acids Res. ,12 :387)。使用該「GAP」程序，不僅可對兩個核酸序列進行比較，還可比 較兩個胺基酸序列，並可對核酸序列和胺基酸序列進行比較。在本發明中，優選的tamavidin包含以下的tamavidin修飾體(日本特願 2008-208766，未公開)。在包含SEQ ID NO 7所述的胺基酸序列、或者在該序列中具有1 數個胺基酸突 變的胺基酸序列、或者與該序列具有80%以上同一性的胺基酸序列，且顯示生物素結合活 性的蛋白質中，選自下組中的1或多個殘基被取代成酸性胺基酸殘基或中性胺基酸殘基而 得到的修飾型生物素結合蛋白質1) SEQ ID NO 7的104位的精氨酸殘基；2) SEQ ID NO 7的141位的賴氨酸殘基；3) SEQ ID NO :7的26位的賴氨酸殘基；以及4) SEQ ID NO 7的73位的賴氨酸殘基。更優選選自下組中的修飾型生物素結合蛋白質在SEQ ID NO 7中，104位的精氨酸殘基被取代成穀氨酸殘基、且141位的賴氨酸 殘基被取代成穀氨酸殘基而得到的修飾型生物素結合蛋白質(R104E-K141E)；在SEQ ID NO :7中，40位的天冬氨酸殘基被取代成天冬醯胺殘基、且104位的精 氨酸殘基被取代成穀氨酸殘基而得到的修飾型生物素結合蛋白質(D40N-R104E)；在SEQ ID NO :7中，40位的天冬氨酸殘基被取代成天冬醯胺殘基、且141位的賴 氨酸殘基被取代成穀氨酸殘基而得到的修飾型生物素結合蛋白質(D40N-K141E)；以及在SEQ ID NO :7中，40位的天冬氨酸殘基被取代成天冬醯胺殘基、且104位的精 氨酸殘基被取代成穀氨酸殘基、且141位的賴氨酸殘基被取代成穀氨酸殘基而得到的修飾 型生物素結合蛋白質(D40N-R104E-K141E)。生物素結合性蛋白質與載體的連接可以採用本領域技術人員公知的蛋白質與載
12體的偶聯方法來進行。例如，對載體表面進行修飾，使得羧基露出來，然後使該羧基與蛋白 質的氨基在交聯試劑1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)的存在下進行偶 聯反應，從而可以將蛋白質與載體連接起來。或者，例如，通過在不含伯氨基的PH6. 5 9 的緩衝液中混合載體表面的羧基被N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)活性酯化後的載體與蛋白質， 可以將載體表面的羧基與蛋白質的氨基連接起來。或者，可以使用交聯試劑BS3(雙[磺基琥珀醯亞胺基]辛二酸鹽)或DSS(雙琥 珀醯亞胺基辛二酸酯)將載體表面的氨基與蛋白質的氨基連接起來，或者使用交聯試劑 SPDP (N-琥珀醯亞胺基3- [2-吡啶基二硫]丙酸酯)或GMBS (N- (4-馬來醯亞胺丁醯基氧) 琥珀醯亞胺)將載體表面的氨基與蛋白質的硫醇基連接起來。在利用諸如上述的結合將生物素結合性蛋白質固定於載體時，表面配置有各種 官能團的各種載體是商品化的，因此可以優選使用這些載體。可以列舉出但不限於例如 在表面配置有官能團的微板方面，作為馬來酸酐板有例如Reacti-BincK商標)Maleic Anhydride Activated Polystyrene 96-WellPlates (PIERCE 公司)，作為活性型氨基板有 例如Immobilizer -AminoModules/Plates (Nunc公司)，作為羧基板有例如ELISA用平板 MS-8796F(96孔.C型 平底 羧基)(Sumitomo Bakelite公司)。此外，在表面配置有官能團 的微珠方面，作為高交聯瓊脂糖珠有例如S印harose (商標)(GE HealthcareBio-Science 公司)，作為磁珠有例如Dynabeads (商標)(Dynal公司)等，但不限於此。生物素結合性蛋 白質與固體載體的連接可以按照載體附帶的說明書來進行。此外，作為固定有生物素結合性蛋白質的載體，還可以列舉出例如Reacti-Bind Streptavidin Coated Plates (PIERCEE 公司)、Nunc StreptavidinCoated 96 Micro Well Plates (Nalge Nunc 公司)等微板類，或者 DynabeadsM-280 Streptavidin (Dynal 公司)、 MagnaBind Streptavidin Beads (PIERCE公司)等磁珠類等市售品，但不限於此。在不使用生物素與生物素結合性蛋白質的情況下，例如，可以在凝集素上結合組 氨酸標籤、FLAG 標籤或穀胱甘肽硫轉移酶(GST)，並在載體上分別結合Ni-NTA (氮川三乙 酸)、抗FLAG抗體或穀胱甘肽，通過它們之間的結合，也可以使凝集素與載體間接結合。含病毒液ij 疑集素的接角蟲本發明的方法包括使含病毒液與凝集素相接觸的步驟。對於使含病毒液與凝集素 相接觸的條件沒有特殊限制，只要是含病毒液中的病毒與凝集素結合的條件即可。作為接 觸條件的要素，包括含病毒液的組成、溫育溫度和溫育時間。對於含病毒液的組成沒有特殊限制，只要能夠保持含病毒液中的病毒與凝集素結 合的條件即可。優選的含病毒液可以是以PH7 8的緩衝液、例如Tris/EDTA(TE)、PBS、 HEPES、TBS等為基礎的緩衝液。此外，含病毒液的pH可以是6 9、優選7 8。如果含病毒液是體液，則可以直接與凝集素接觸，或者可以在該體液中加入期望 的緩衝液等，然後再與凝集素接觸。溫育溫度的下限可以是4°C或10°C，上限可以選自50°C、45°C、4(TC、37°C、3(rC、 25°C和20°C。作為優選的溫育溫度，可以列舉出10°C 37°C、10°C 25°C、10°C 20°C、 15°C。溫育時間的下限可以選自1分鐘、3分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘和30分 鍾，上限可以選自一夜、10小時、8小時、5小時、3小時、2小時、1. 5小時和1小時。作為優選的溫育時間，可以列舉出5分鐘 一夜、5分鐘 5小時、10分鐘 2小時。在本發明的方法中的凝集素與載體間接結合的實施方式中，在使凝集素與含病毒 液接觸前、或接觸的同時、或接觸後，通過能夠與載體結合的分子使凝集素與載體相接觸並 結合。對於使凝集素與載體相接觸的條件沒有特殊限制，只要是凝集素通過能夠與載體結 合的分子可以充分地結合於載體的條件即可。作為接觸條件的要素，包括溫育溫度和溫育 時間。可以適宜地選擇與上述的使病毒與凝集素相接觸的條件相同的條件，作為特別優選 的溫育時間，可以列舉出1分鐘 2小時、3分鐘 1小時、5分鐘 30分鐘。載體的分離通過凝集素而捕捉到作為濃縮對象的病毒的載體，可以根據該載體的性質，採用 本領域技術人員公知的方法，從作為試樣的含病毒液中分離、回收。例如，對於珠子等粒狀載體，通過離心分離並進而除去上清，可以實現將載體從試 樣分離。在載體為磁珠的情況下，通過使用磁鐵收集載體並除去上清，可以將載體從試樣分 離。在載體為薄膜、濾膜等形狀的情況下，通過將載體從試樣中撈起來、或者使試樣通過載 體後，可以將載體從試樣分離。當載體被設計成由病毒來填充孔結構的內部(例如微板等) 時，簡單通過將試樣從孔中除去，即可將載體從試樣分離。此外，視需要為了除去非特異性結合在從試樣分離的載體上的物質，可以增加對 分離出的載體進行洗滌的步驟。對於洗滌步驟中採用的洗滌液、溫度的條件沒有特殊限制， 只要維持病毒與凝集素間的結合和/或凝集素與載體間的結合的條件得以保持即可。優選地，洗滌液具有緩衝能力，可以是以pH7 8的緩衝液、例如Tris/EDTA(TE)、 PBS、HEPES、TBS等為基礎的緩衝液。此外，洗滌液的pH可以為6 9、優選7 8。對於洗滌溫度沒有特殊限制，洗滌溫度的下限可以是4°C或10°C，上限可以選自 50 V、45°C、40 V、37°C、30 V、25°C和20 V。作為優選的洗滌溫度，可以列舉出10°C 37°C、 10°C 25°C、10°C 20°C、15°C。使用糖講行的洗脫本發明的方法包括使用含糖的洗脫液，將通過凝集素而被載體捕捉的病毒從載體 上洗脫的步驟。可以設想，因病毒的種類而異，有些情況下，凝集素與病毒結合的狀態會對 病毒的感染能力產生不良影響。而且，在對基因治療中使用的病毒載體進行濃縮時，從載體 洗脫並分離病毒載體是不可或缺的。在本說明書中，從載體洗脫病毒是指對於被載體捕捉的病毒，通過使糖鏈-凝集 素結合解離，從而使病毒從該載體脫離，成為游離於該載體的狀態。此外，在本說明書中，從 載體洗脫病毒是指成為至少一部分被載體捕捉的病毒從載體上脫離而游離出來的狀態； 並非一定是指成為全部被載體捕捉的病毒均游離出來的狀態。此外，在本說明書中，從載體洗脫並分離病毒中的詞語「分離」是指使被載體捕 捉的病毒從該載體脫離，而成為游離於該載體的狀態，且成為除去該載體的成分的狀態。因 此，在本說明書中，「分離的病毒」是指至少不含載體的成分，並不一定對病毒純度的程度進 行規定。本發明人等發現通過將與凝集素結合的病毒用合適的含糖的溶液進行處理，可 以將其從載體洗脫並分離，而不喪失病毒的感染能力。因而，在本發明的方法中，通過使用 糖，可以洗脫與凝集素結合的病毒。可從結合有病毒的凝集素洗脫病毒的糖選自具有該凝集素所結合的糖的單糖類、二糖類、寡糖或糖苷。作為用於從捕捉了病毒的凝集素洗脫病毒的糖的具體例子，可以列舉出例如，針 對SBA使用N-乙醯基-D-半乳糖胺，針對SSA使用乳糖，針對DSA使用殼寡糖，針對WGA使 用殼寡糖或N-乙醯基-D-葡糖胺，可以分別優選加以利用。含糖的洗脫液可以是以pH7 8的緩衝液、例如Tris/EDTA(TE)、PBS、HEPES, TBS 等為基礎的緩衝液。此外，含糖的洗脫液的ρΗ可以是5 9、優選7 8。含糖的洗脫液中的糖的濃度可以是0.01 1Μ、優選0.05Μ 0. 5Μ、更優選0. IM 0. 3Μ。或者，可以是0. 5% (w/v)、更優選0. 5% 2% (w/v)。對於洗脫處理的溫度沒有特殊限制，可以是室溫，或者洗滌溫度的下限可以是4°C 或10°C，上限可以選自50°C、45°C、40°C、37°C、30 V、25°C和20 V。作為優選的洗滌溫度，可 以列舉出室溫、10°C 37°C、10°C 25°C、10°C 20°C、15°C。對於洗脫處理的時間沒有特殊限制，可以是30秒 1日、優選5分鐘 2小時、更 優選1分鐘 30分鐘。此外，對於出於洗脫病毒的目的而使用的洗脫液的量沒有特殊限制，只要是少於 本發明的方法中最初使用的含病毒液的容積的量即可。優選地，可以是最初的含病毒液的 量的 1/2、1/3、1/4、1/5、1/10、1/20、1/50、1/100 或 1/500。而且，在不使用糖從載體進行洗脫時，通過使洗脫液的ρΗ為酸性(優選pHl 5) 或鹼性(優選PH9 11)，也可以洗脫病毒。病毒濃縮液的獲得在使洗脫液作用於載體後，通過除去載體可以獲得病毒濃縮液。在用洗脫液進行處理後，洗脫液中的載體可以根據該載體的性質，採用本領域技 術人員公知的方法從洗脫液中分離、除去。例如，對於珠子等粒狀載體，通過離心分離並進 而回收上清，可以獲得病毒濃縮液。在載體為磁珠的情況下，通過使用磁鐵收集載體並回收 上清，可以獲得病毒濃縮液。在載體為薄膜、濾膜等形狀的情況下，通過將載體從洗脫液中 撈起來、或者使試樣通過載體後，也可以將載體分離。當載體被設計成由病毒來填充孔結構 的內部(例如微板等)時，簡單通過從孔中回收洗脫液，即可獲得病毒濃縮液。2.試劑盒此外，本發明提供基於本發明的方法用於濃縮含病毒液中的病毒的試劑盒。在一類實施方式中，本發明的試劑盒至少包含生物素化凝集素、結合有生物素結 合蛋白質的載體、和用於洗脫的糖。凝集素、生物素結合蛋白質、載體和洗脫用的糖如上述定義。在其它實施方式中，本發明的試劑盒至少包含結合有凝集素的納米珠、和洗脫用 的糖。凝集素、納米珠和用於洗脫的糖如上述定義。本發明的試劑盒中還可以包含本發明的方法中的、用於病毒與凝集素的結合的緩 衝液、用於洗滌分離出的病毒結合載體的緩衝液、和/或用於從載體洗脫病毒的緩衝液。本發明的試劑盒中，各種試劑可以封裝在合適的容器中。此外，本發明的試劑盒還 可以包含用於對其中所含的試劑等進行適當捆包的包裝。此外，本發明的試劑盒還可以包含合適的使用說明資料。使用說明資料包括但 不限於包裝上記載的使用方法或印刷品、電子記錄媒體(例如磁碟、磁帶、盒式存儲器(cartridge)、晶片)和光學媒體(例如CD ROM)等，可向使用者傳達本發明的試劑盒的使 用方法的媒體。此外，連接至提供使用說明資料的網際網路站點的地址的記載也包含在使用 說明資料中。
實施例以下，通過實施例對本發明進行具體說明，但這些並不是對本發明的技術範圍的 限定。本領域技術人員可以基於本說明書的記載容易地對本發明加以修飾、變更，這些也包 含在本發明的技術範圍內。t施例1能夠濃縮HHV-6的凝集素的探索使生物素化的15 種凝集素(Con A, DBA, LCA, ΡΗΑ-Ε4，PNA, RCA120, UEA-I, WGA, ΑΒΑ, DSA, Lotus, MAM, PHA-L4, SBA, SSA)與培養的HHV-6溶液反應，研究了是否能夠通過結 合於結合了 tamavidin的磁珠來濃縮HHV-6。1.從培養T細胞製作HHV-6溶液使表達EGFP的重組HHV-6 (專利第3923505號)感染人臍帶血來源培養T細胞， 製作了 EGFP型HHV-6溶液。2. tamavidin 磁珠的製作將表面用羧基包覆的磁珠(DynabeadsM-270 Carboxylic Acid, Dynal 公 司)300 μ 1用0. OlN氫氧化鈉300 μ 1洗滌10分鐘後，再用超純水300 μ 1洗滌3次，每次 10分鐘。對於洗滌完畢的磁珠，添加用冷超純水溶解的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基) 碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC) (PIERCE公司)使得最終濃度為0. 2M，室溫振蕩30分鐘。然後， 用冷超純水300 μ 1、再用50mM MES緩衝液(pH5. 0) 300 μ 1洗滌磁珠，用混合0. 6mg/ml的 tamavidin 300 μ 1 (180 μ g)來替代50mM MES緩衝液(pH5. 0)。通過室溫振蕩30分鐘，使 tamavidin與磁珠通過共價鍵結合。用磁鐵回收磁珠，除去上清。接下來，用50mM TRIS緩 衝液(pH7. 0)300 μ 1除去珠子的未反應羧基，然後用含0. 5% BSA、0. 1% Tween20的PBS緩 衝液300 μ 1封閉磁珠。用PBS緩衝液300 μ 1懸浮磁珠，從而完成了磁珠的製作。對於鏈 黴抗生物素蛋白，也同樣製作了磁珠。3.重組HHV-6溶液的濃縮利用1中製作的EGFP型HHV-6溶液，以重組HHV-6的感染效價為指標，確認了是 否進行了病毒濃縮。生物素化凝集素使用了 J-OIL MILLS公司製造的15種凝集素(Con A, DBA, LCA, ΡΗΑ-Ε4, PNA, RCA120, UEA-I，WGA, ΑΒΑ, DSA, Lotus, MAM, PHA-L4, SBA, SSA)。首先，在進行凝集素的探索之前，進行了作為背景的tamavidin的非特異性吸附 的確認。首先，混合EGFP 重組 HHV-6 液 100 μ 1 (病毒濃度 104/mlTE)與 PBS 500 μ 1，15°C 溫育1小時(顛倒混合)。接著，將上述2中製作的tamavidin磁珠添加到反應液中，再次 15°C溫育1小時(轉倒混合)。然後，將裝有反應液的埃芬道夫管立於Dynabeads用磁鐵臺 後，用PBS 2mM EDTA 0. 5% BSA 200 μ 1洗滌2次。接著，將其懸浮於培養液(RPMI1640+10% 胎牛血清)500 μ 1後，將全部與0.5ml的指示細胞(MT4細胞)一起懸浮。可以認為如果 存在EGFP型HHV-6，則EGFP型HHV-6感染指示細胞，HHV-6的DNA進入細胞中，其中重組到 病毒中的EGFP基因得以表達，從而發出GFP螢光。而且，在本實驗中，處於結合有珠子的狀
16態的病毒與感染細胞一起沉入液體底部，因此，通常會成為問題的病毒與感染細胞之間的 結合概率的降低已經不再是問題，反而局部的病毒濃度變得非常高，並因此可以認為感染 效率提高。上述實驗的結果如圖1所示，可以確認基本上沒有HHV-6針對tamavidin珠子的 非特異性吸附。接下來，考察了使用各種凝集素進行病毒濃縮是否是可行的。 首先，混合EGFP重組HHV-6液100 μ 1 (病毒濃度104/mlTE)與PBS 500 μ 1,生物 素化凝集素 ο μ g，15°C溫育1小時(顛倒混合)。接著，將上述2中製作的tamavidin磁 珠添加到反應液中，再次15°C溫育1小時(轉倒混合)。然後，將裝有反應液的埃芬道夫管 立於Dynabeads用磁鐵臺後，用PBS 2mM EDTA0. 5% BSA 200μ1洗滌2次。接著，將其懸 浮於培養液(RPMI1640+10%胎牛血清)500 μ 1後，將全部與0. 5ml的指示細胞(MT4細胞) 一起懸浮，觀察了 EGFP的表達。而且，可以認為如果能夠濃縮EGFP型HHV-6，則通過凝集 素_生物素-tamavidin與磁珠結合在一起的EGFP型HHV-6感染指示細胞，重組到病毒中 的EGFP基因得以表達，從而發出GFP螢光。作為實驗結果，在使用SBA、SSA、DSA、WGA時，觀察到了比病毒原液更多的EGFP的 表達。部分結果示於圖2、圖3。該事實表明，使用這些凝集素能夠有效率地濃縮HHV-6。實施例2睡液中HHV-6的濃縮對於唾液中的HHV-6，嘗試了利用凝集素化生物素、tamavidin磁珠進行濃縮。1.睡液的採集使用唾液收集管(Salivette Cotton、Sarstedt公司製造)採集來自受試者的唾 液。在即將進行唾液採集之前，受試者用蒸餾水漱口 2次，然後將唾液收集管的棉芯含於口 腔內2分鐘，採集了唾液。2. HHV-6 的定量首先，對唾液中的HHV-6濃度進行定量。對於如上述項目1那樣採集的唾液400 μ 1，使用BioRobot EZl (QIAGEN公司)與 EZl Virus Mini Kit v2. 0 (QIAGEN 公司)，按照 EZl Virus MiniHandbook (QIAGEN 公司) 的規程，對唾液中的HHV-6DNA進行了純化。將所得DNA用於定量PCR。在定量PCR中，採用實時PCR法對HHV-6TO5/66區域進 行了定量。PCR中使用的引物和探針的序列是引物5' -GACAATCACATGCCTGGATAATG-3『 (SEQ ID NO :1)；和引物5' -TGTAAGCGTGTGGTAATGGACTAA-3 『 (SEQ ID NO 2)；以及TaciMan 探針FAM 5' -AGCAGCTGGCGAAAAGTGCTGTGC-3 『 TAMRA (SEQ ID NO 3)使用 FastStart Universal Probe Master (Rox) (Roche 公司)進行了 反應溫度 950C 10分鐘1次，95°C 5秒+60°C 31秒的循環45個的實時PCR。而且，本試驗中病毒實驗由極熟練的實驗者來進行。其結果，唾液11111中的冊￥-60嫩是14616拷貝/1111。因此，可以計算出唾液5 μ 1 中所含的HHV-6是73. 08拷貝(圖4 純化前)。3.利用生物素化凝集素、tamavidin磁珠進行的HHV-6的濃縮在如上述項目1那樣採集的唾液400 μ 1中混合44 μ 1的10倍濃度PBS、生物素化SBA lnmol, 15°C溫育1小時(顛倒混合)。接著，將實施例1中製作的tamavidin磁珠 ΙΟΟμΙ添加到反應液中，再次於15°C溫育1小時(顛倒混合)。然後，將裝有反應液的埃芬 道夫管立於Dynabeads用磁鐵臺上後，用PBS 500 μ 1洗滌3次。向其中加入10 μ 1的ΤΕ， 98 V處理10分鐘後，在磁鐵臺上回收上清，將其中的5 μ 1用於定量PCR。定量PCR中，像本 實施例的上述項目2那樣對HHV-6TO5/66區域採用實時PCR法進行了定量。
作為以上實驗的結果，在利用生物素化SBA與tamavidin磁珠的情況下，經測定， 用於定量PCR的洗脫液5μ1中的HHV-6量為2934拷貝(圖4)。與本實施例的上述項目 2的結果相比較，通過使用生物素化SBA與tamavidin磁珠，HHV-6溶液能夠濃縮約40倍。 相似地，在使用生物素化SSA的情況下，濃縮效率為約15倍。另一方面，未加入生物素化凝 集素的試驗區中所含的HHV-6量是40拷貝以下，其未得到濃縮(圖4)。 _0] 4.利用牛物素化凝集素和tamavidin磁珠講行的HHV-6 _農縮以及利用糖鏈講行 的洗脫在如上述項目1那樣採集的唾液Iml中添加100 μ g的生物素化SBA或生物素化 WGA後，將實施例1中製作的tamavidin磁珠50μ 1添加到反應液中，室溫顛倒混合15分鐘， 從而使之結合。將其立於Dynabeads用磁鐵臺上後，加入0. 5%牛血清白蛋白、2mM EDTA，用 PBS洗滌2次後，用20μ 1的洗脫液(在PBS+2%胎牛血清中加入洗脫用糖鏈而得)進行了 洗脫處理。洗脫液中的洗脫用糖，在使用生物素化SBA的體系中使用了 N-乙醯基-D-半乳 糖胺(0. 2M)，在使用生物素化WGA的體系中使用了殼寡糖(1% )。然後，將裝有進行過洗脫 處理的洗脫液的試管立於Dynabeads用磁鐵臺上，收集tamavidin磁珠，並回收上清。將這 樣獲得的回收液5 μ 1用於定量PCR。定量PCR中，像上述項目2那樣對HHV-6TO5/66區域 採用實時PCR法進行了定量。作為以上實驗的結果，在利用生物素化SBA與tamavidin磁珠來收集HHV-6、並用 N-乙醯基-D-半乳糖胺進行洗脫的情況下，與純化前的病毒濃度相比較，濃縮效率為2. 7 倍。此外，在利用生物素化WGA與tamavidin磁珠來收集HHV-6、並用殼寡糖進行洗脫的情 況下，與純化前的病毒濃度相比較，濃縮效率為4. 7倍(圖5)。^mm 3 itmmmmmf ^mmmmmm(1)濃縮作為慢病毒，使用了在具有HIV base的基因和VSV-G的包膜的慢病毒載體中重組 入EGFP基因而得到的慢病毒(獨立行政法人理化學研究所三好浩之先生惠贈)。生物素化 凝集素使用的是J-OIL MILLS公司製造的15種生物素化凝集素(Con A, DBA, LCA, PHA-E4, PNA, RCA120, UEA-I, WGA, ΑΒΑ, DSA, Lotus, MAM, PHA-L4, SBA, SSA)。首先，混合EGFP重組慢病毒液100 μ 1 (病毒濃度102/ml TE，而且為了觀察濃縮效 果，使用了效價低的病毒。)、PBS 500 μ 1、生物素化凝集素10 μ g，15°C溫育1小時(顛倒混 合)。接著，將實施例1中製作的tamavidin磁珠添加到反應液中，再次於15°C溫育1小時 (顛倒混合)。然後，將裝有反應液的埃芬道夫管立於Dynabeads用磁鐵臺上後，用PBS 2mM EDTA 0. 5% BSA200 μ 1洗滌2次。接著，將其用培養液(RPMI1640+10%胎牛血清)500 μ 1 懸浮後，用全部感染指示細胞(293細胞)，通過EGFP表達測定了病毒的感染效價。其結果，可知在利用WGA或SBA的情況下，具有VSV-G包膜的慢病毒載體能夠得 到充分濃縮，且不損失感染性(圖6)。而且，使用原液的病毒，基本上未見EGFP表達細胞。
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(2)濃縮率的定量接著，進行了濃縮率的定量。在Iml的EGFP重組慢病毒溶液(效價103/ml)中 添加200 μ g的生物素化SBA或生物素化WGA後，添加100 μ 1的tamavidin磁珠，室溫顛倒 混合15分鐘，從而使之結合。將其立於Dynabeads用磁鐵臺上後，用含0. 5%牛血清白蛋 白、2mM EDTA的PBS洗滌2次後，用100 μ 1的洗脫液(在PBS+2%胎牛血清中加入洗脫用 糖而得)進行了洗脫處理。洗脫液中的洗脫用糖，對於SBA使用了 N-乙醯基-D-半乳糖胺 (0. 2M)，對於WGA使用了殼寡糖(1%)。然後，將裝有進行過洗脫處理的洗脫液的試管立於 Dynabeads用磁鐵臺上，收集tamavidin磁珠，並回收上清。對於這樣獲得的回收液，通過使 其37°C吸附於指示細胞(HeLa細胞)1小時而進行感染，並通過1日後的EGFP表達細胞數 測定了感染病毒效價作為病毒效價。其結果，能夠回收病毒，且使用生物素化SBA的體系的回收率是56%，使用生物素 化WGA的體系的回收率是98%。濃縮率分別為5. 6倍和9. 8倍(圖7)。工業實用性本發明提供能夠更簡便地對低濃度的病毒溶液中的病毒、病毒載體進行濃縮的新 方法，以及用於進行該方法的試劑盒。本發明的方法能夠使在保持病毒、病毒載體的感染能 力的同時進行濃縮變得容易，因此，可以期待其作為例如使用病毒載體的基因治療、疫苗治 療等領域中的、安全且簡便的載體濃縮技術應用。更具體地，本發明的方法是一種不需要傳 統方法那樣的麻煩的柱操作、超離心等的簡便方法，因而也可以期待其應用於自動化、高通 量的系統中。
權利要求
一種濃縮病毒的方法，該方法包括以下步驟(1)通過使凝集素與含病毒液接觸、並使病毒與凝集素結合，並且，(i)該凝集素與能夠與載體結合的分子相連接，並通過該分子結合於載體，從而與凝集素結合的病毒間接地結合於載體，或者(ii)該凝集素直接結合於載體，從而使與凝集素結合的病毒結合於載體；(2)從含病毒液分離載體；(3)用含糖的洗脫液處理回收的載體，並從該載體洗脫病毒，其中，該洗脫液的量少於(1)的含病毒液的容積；以及(4)從(3)的洗脫液分離載體，從而得到病毒濃縮液。
2.一種濃縮病毒的方法，該方法包括以下步驟(1)在含病毒液中混合生物素化凝集素，並使病毒與生物素化凝集素接觸，進一步添加 結合有生物素結合蛋白質的載體，使與生物素化凝集素結合的病毒結合於載體；(2)從含病毒液分離載體；(3)用含糖的洗脫液處理回收的載體，從該載體洗脫病毒，其中，該洗脫液的量少於 (1)的含病毒液的容積；以及(4)從(3)的洗脫液分離載體，從而得到病毒濃縮液。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中，所述病毒是具有包膜的病毒或從具有包膜的 病毒來源的病毒。
4.根據權利要求1或2所述的方法，其中，所述病毒是慢病毒或皰疹病毒。
5.根據權利要求1或2所述的方法，其中，所述凝集素是與包含N-乙醯半乳糖胺 (GalNAc)、α 2-6鍵的唾液酸(Siaa 2-6)、Ν_乙醯葡糖胺(GlcNAc)中的至少一種的糖結合 的凝集素。
6.根據權利要求5所述的方法，其中，所述凝集素選自SBA(大豆來源)、SSA(無梗接 骨木來源)、DSA(白曼陀羅來源)和WGA (小麥胚芽來源)。
7.根據權利要求1或2所述的方法，其中，所述凝集素是WGA(小麥胚芽來源)，用於 病毒的洗脫的糖是殼寡糖；或者，所述凝集素是SBA (大豆來源)，用於病毒的洗脫的糖是 N-乙醯基-D-半乳糖胺或含N-乙醯基-D-半乳糖胺的糖。
8.根據權利要求1或2所述的方法，其中，所述病毒是慢病毒，所述凝集素是WGA(小 麥胚芽來源)，用於病毒的洗脫的糖是殼寡糖；或者，所述病毒是慢病毒，所述凝集素是 SBA (大豆來源)，用於病毒的洗脫的糖是N-乙醯基-D-半乳糖胺或含N-乙醯基-D-半乳 糖胺的糖。
9.一種濃縮病毒的方法，該方法包括以下步驟(1)使直接結合於直徑IOnm IOOnm的納米珠的凝集素與含病毒液接觸，並使病毒結 合於納米珠；(2)從含病毒液分離納米珠；(3)用含糖的洗脫液處理回收的納米珠，並從該納米珠洗脫病毒，其中，該洗脫液的量 少於(1)的含病毒液的容積；以及(4)從(3)的洗脫液分離納米珠，從而得到病毒濃縮液。
10.一種用於通過權利要求2所述的方法濃縮病毒的試劑盒，該試劑盒包含生物素化凝集素、生物素結合蛋白質珠和用於從載體洗脫病毒的糖。
11. 一種用於通過權利要求2所述的方法濃縮病毒的試劑盒，該試劑盒包含(a)生物素化WGA、生物素結合蛋白質和殼寡糖；或(b)生物素化SBA、生物素結合蛋白質和N-乙醯基-D-半乳糖胺或含N-乙醯基-D-半 乳糖胺的糖。
全文摘要
本發明提供能夠更簡便地濃縮低濃度的病毒溶液中的病毒、病毒載體的新方法，以及用於進行該方法的試劑盒。從低濃度的病毒液高效率地濃縮病毒，傳統上需要麻煩的操作、昂貴的儀器或者熟練的技術。本發明的方法能夠使在保持病毒載體的感染能力的同時使進行濃縮變得容易，因此，適於在使用病毒載體的基因治療、疫苗治療等領域中作為安全且簡便的載體濃縮技術應用。
文檔編號C12N7/02GK101983238SQ200980112158
公開日2011年3月2日 申請日期2009年3月31日 優先權日2008年3月31日
發明者市川雅子, 清水昭宏, 近藤一博, 高倉由光 申請人:日本菸草產業株式會社