一種基於流式細胞術的高通量篩選金黴素高產菌株的方法與流程

2023-05-14 14:44:21

本發明涉及一種基於流式細胞術的高通量篩選金黴素高產菌株的方法，屬於高通量篩選技術領域。

背景技術：

金黴素(Chorotetracycline，即CTC)屬於四環素類的一種廣譜抗生素。金黴素能夠抑菌、促生長、飼料利用率高、在肌體內殘留量低。其生產技術已經較為成熟，生產成本也較低，成為目前飼料工業中用量最大的抑菌促生長劑。目前國內工廠金黴素的產率還較低(效價在18000μg/mL左右)，因此提高金黴素的產率很有必要。金黴素是由金色鏈黴菌(Streptomyces aureofaciens)發酵得到的次級代謝產物，其產量合成性狀受多基因決定，代謝網絡複雜。影響金黴素發酵過程的因素也很多，如種子的質量、培養基的組成、工藝條件以及發酵過程的代謝控制等。目前微生物育種技術已經從誘變、推理、重組技術發展到代謝工程、系統生物學和異源生物合成等方法。但傳統誘變育種仍具有諸多優勢。如不需要知道生物遺傳背景、代謝模型，只需要獲得有效突變庫和定向篩選。高通量篩選與常規誘變結合，適用於以提高次級代謝產物產量為目標的工業生產菌株選育，儘可能減少漏篩現象。

目前的經典誘變結合高通量篩選方法，由於經典誘變會存在大量死細胞而可能導致後續可培養無法實現，同時經典誘變後的菌株要進一步分離純化、擴大培養之後才能進行後續酶標板等高通量篩選而存在篩選周期長等問題。

技術實現要素：

為了解決上述問題，本發明聯合經典誘變、流式細胞術、高通量孔板篩選、固液聯合培養，提供了一種基於流式細胞術的高通量篩選金黴素高產菌株的方法。本發明基於流式細胞術對金黴素高通量篩選，可在短時間內對大量有效菌株進行分析，從而分選目的活孢子，進而進行高通量培養檢測。

本發明的基於流式細胞術的高通量篩選金黴素高產菌株的方法，主要包括步驟如下：

(1)獲得金色鏈黴菌的多個含量死孢子在內的待篩選的孢子；

(2)利用PI染料對步驟(1)的待篩選的孢子進行染色；

(3)使用流式細胞儀檢測孢子活性；

(4)利用流式細胞儀分選有活性孢子，直接將單個有活性的孢子分選到裝有固體培養基的高通量孔板中；

(5)待高通量孔板的固體培養基上培養2～3天，直接添加液體種子培養基繼續培養得到種子液；將培養好的種子液轉接入含有發酵培養基的新的高通量孔板中，發酵培養；

(6)配置一定濃度梯度的金黴素標準品，吸取Tris-HCl緩衝溶液、Sm(NO)3溶液、各濃度標準品溶液，震蕩混勻至顯色完全，用酶標儀檢測，得到金黴素與405nm下的吸光值OD的關係；發酵培養結束後，取發酵液上清，在合適的濃度下加入到含有Tris-HCl緩衝溶液和釤溶液的孔板中，震蕩混勻至顏色變為淡黃色，然後用酶標儀測定405nm下的吸光值OD，進而得知待篩選菌株產金黴素含量的相對高低；

(7)選取上一步得到的金黴素含量相對較高的菌株多株，進行復篩。

在本發明的一種實施方式中，所述步驟(1)的待篩選孢子可以是不同活性的孢子，包括死孢子。

在本發明的一種實施方式中，所述步驟(1)的待篩選孢子是將金色鏈黴菌進行誘變後得到的。

在本發明的一種實施方式中，所述步驟(1)的待篩選的孢子中，死孢子含量達90％以上，優選地達95％以上更優選地達99％以上。

在本發明的一種實施方式中，所述誘變，可以是物理誘變或者化學誘變，比如常壓室溫等離子體(ARTP)誘變、紫外誘變、甲基磺酸乙酯(EMS)誘變、亞硝基胍(NTG)誘變、硫酸二乙酯(DES)誘變等等。。

在本發明的一種實施方式中，所述步驟(2)的染色，具體是：將待篩選的孢子調整至濃度105～106個孢子/mL的懸浮液，將等體積懸浮液與10μg/mL PI染色劑混合，避光放置4℃冰箱孵育20min。

在本發明的一種實施方式中，所述步驟(3)和步驟(4)具體是：以沒有標記任何螢光素的樣品為陰性對照、將完全無活性的與PI染色劑結合的樣品設置為陽性對照，確定陰性與陽性孢子群體；取染色後的金色鏈黴菌孢子懸浮液，重新過濾，稀釋一定倍數，上流式細胞儀分析，用FL3通道((610±15)nm)檢測，將無螢光區域最集中部分設門分選至裝有固體培養基的高通量孔板中，每孔分選設定為單個孢子。

在本發明的一種實施方式中，所述步驟(4)中，裝有固體培養基的高通量孔板中固體培養基的體積為50μL/孔。

在本發明的一種實施方式中，所述步驟(5)中，是培養至長出可見孢子後添加液體種子培養基。

在本發明的一種實施方式中，所述步驟(5)中液體種子培養基的添加量為150μL/孔。

在本發明的一種實施方式中，所述步驟(5)中發酵培養液的添加量為900μL/孔。

在本發明的一種實施方式中，所述步驟(6)，在線性濃度範圍內，目標物濃度越大，OD值越大。

在本發明的一種實施方式中，所述步驟(6)的一定濃度梯度是0～360μg/mL。

在本發明的一種實施方式中，所述步驟(6)，是繪製金黴素與405nm下的吸光值OD的標準曲線；發酵培養結束後，發酵上清液稀釋至合適濃度，加入到提前添加了Tris-HCl緩衝溶液和釤溶液的孔板中，震蕩混勻至顏色變為淡黃色，然後用酶標儀測定405nm下的吸光值OD，將吸光值OD代入標準曲線，得到相應的金黴素含量。

在本發明的一種實施方式中，所述步驟(6)，是將20μL Tris-HCl緩衝溶液、60μL Sm(NO)3溶液、120μL各濃度標準品金黴素溶液或者稀釋後的發酵液震蕩混勻。

在本發明的一種實施方式中，所述Tris-HCl緩衝溶液的pH為6.7，Sm(NO)3溶液的濃度為5×10-4mol/L。

在本發明的一種實施方式中，所述高通量孔板可以是96深孔板、96淺孔板、48深孔板、24深孔板、12深孔板等任意一種具有高通量篩選作用的培養器皿。優選地，裝有固體培養基的高通量孔板為96淺孔板，裝有發酵培養基的高通量孔板為48深孔板。

本發明的有益效果：

本發明方法結合了常壓室溫等離子體(ARTP)、PI染色法、流式細胞術分析分選法、酶標儀檢測、固液結合的培養方法和高通量篩選技術，對分選有活性金色鏈黴菌孢子培養提供了一種精確快速的方法。本發明方法基於流式細胞儀能夠在短時間內對單孢子檢測，從而建立龐大的分析目標群體，流式細胞術高通量的分選培養減少了在平板上生長的過程，不漏篩每個孢子，分選速度和篩選效率得以提高。此外，利用固液結合的培養方法直接提高了單個金色鏈黴菌孢子的生長率，解決了單個孢子在液體培養基中生長困難的問題。

具體實施方式

培養基：

(1)固體培養基(g/L)：蔗糖20g，進口酵母粉0.5g，KH2PO40.8g，瓊脂18g。

(2)種子培養基(g/L)：蔗糖30g，進口酵母粉5g，MgSO40.5g，(NH4)2SO43g，NaCl4g，KH2PO41g，CaCO30.2g。

(3)孔板發酵培養基(g/L)：蔗糖30g，MgSO40.5g，CaCO30.33g，檸檬酸2.55g，(NH4)2SO43g，1mL混合液(0.3％CuSO4·5H2O、0.5％ZnSO4·7H2O、0.25％MnSO4`4H2O)。

螢光染料配製：稱取0.01g PI，用PBS(pH 7.4)緩衝溶液定容至10mL。梯度稀釋至10μg/mL。4℃避光保存。

PI染料對金色鏈黴菌孢子染色：

取等體積金色鏈黴菌孢子懸液和10μg/mLPI染料混合，避光放置4℃冰箱染色20min。

流式細胞儀檢測：

取染色後的金色鏈黴菌孢子懸浮液，重新過濾，稀釋一定倍數，上流式細胞儀(MoFlo XDP)分析。根據染色劑發射螢光選擇合適通道檢測。所得數據用Summit 5.4軟體分析。

實施例1 ARTP誘變或其他誘變獲得不同活性孢子

出發菌株金色鏈黴菌斜面菌種在34℃條件下，培養4天，直至孢子成熟，斜面菌落呈鼠灰色。刮取適量成熟斜面孢子於裝有2mL PBS緩衝液的試管中，震蕩器震勻製成菌懸液後，無菌濾紙過濾。吸取10μL合適濃度的菌懸液均勻塗布於無菌的載片表面，將載片置於載臺上，用ARTP誘變儀進行誘變。條件：入射功率為100W、氦氣流量為10SLM、分別照射一定時間獲得不同活性的孢子。分別照射一定時間獲得不同活性的孢子。其他物理、化學誘變也可獲得不同活性的孢子。

實施例2 PI染料對金色鏈黴菌孢子染色：

取樣品處理完畢，用無菌鑷子將載片放至裝有PBS(pH 7.4)緩衝溶液的EP管中，充分振蕩1min，將附著在載片上的菌體被徹底洗脫到液PBS中。濾紙過濾，5000×g離心5min，棄去上清，加入PBS重懸。重複此操作步驟2～3次，得到純淨的金色鏈黴菌孢子懸液。用PBS將純淨的金色鏈黴菌孢子懸液稀釋至濃度105～106個孢子/mL。等體積金色鏈黴菌孢子懸液和10μg/mLPI染料混合，避光放置4℃冰箱染色孵育20min。

實施例3流式細胞儀檢測：

檢測要建立對照試驗除去非特異性結合即背景。沒有標記任何螢光素的樣品為陰性對照，代表細胞背景螢光信號。通過陰性對照調節基本電壓，設定陰性與陽性群體界限。將完全無活性，與PI染色劑結合的樣品設置為陽性對照，確定陰性與陽性孢子群體。固定條件後進行樣品檢測。取染色後的金色鏈黴菌孢子懸浮液，重新過濾，稀釋一定倍數，上流式細胞儀(MoFlo XDP)分析。根據PI發射紅色螢光波長，用FL3通道((610±15)nm)檢測。通過調節FSC、SSC、螢光通道坐標參數，電壓以及閾值參數，首先初步獲得分析對象的群體位置。對群體位置大致設門，再次調節FSC、SSC閾值，電壓參數，將大部分的背景噪音去除。所得數據用Summit 5.4軟體分析。從軟體圖示中，可以看出，金色鏈黴菌無活性孢子被PI染色後，發出紅色螢光信號。由於PI不能透過活細胞細胞膜，有活性金色鏈黴菌孢子未能被染色，無螢光信號顯示。從而可以進一步分選出有活性的金色鏈黴菌孢子。

實施例4金黴素顯色反應

根據金黴素與釤離子的顯色反應作為初篩方法。金黴素與釤離子在近中性條件下形成淺黃色配合物，在405nm處有最大光吸收。考慮發酵結束後，培養基中含帶有顏色的原料對測定結果產生一定影響。用生產發酵液配方，同時在孔板中培養與未培養菌體。結果表明，未培養菌體發酵液也有一定的OD值，說明發酵液本身的顏色對OD值得測定確實存在影響，但培養菌體的發酵液OD值大於未培養菌體的發酵液，因此發酵液本身顏色幹擾並不影響篩選金黴素高產菌株。配置濃度在0.5～20mg/L的金黴素標準品溶液，依次吸取20μL Tris-HCl緩衝溶液，60μL Sm(NO)3溶液，120μL各濃度標準品溶液震蕩混勻，10min後顯色完全，酶標儀測定各濃度的OD405值。確定OD405與金黴素濃度C(mg/L)的回歸方程：y＝0.0107x-0.006，R2＝0.99305。x為標準品濃度(μg/mL)，y為OD405nm，標準品濃度範圍為0～360μg/mL。

實施例5高產菌株的培養及篩選

經過流式細胞儀直接將單個金色鏈黴菌孢子分選至96淺孔板中(培養基裝量180μL)。由於金色鏈黴菌孢子體積過小，直接在液體培養基中生長率只有15％左右。為解決此問題，對培養方案進行改進。待裝有50μL的96孔板固體培養基上長出可見孢子之後(約2～3d)，吸取種子培養液150μL於此孔板固體培養基上。在750r/min、30～32℃的孔板搖床上培養23～25h。經此改進後的培養方案，金色鏈黴菌在孔板固體培養基上生長率可達95％左右。以5％(v/v)的接種量，將96孔板中的種子液平行轉接至48孔板(裝有發酵培養液1000μL)中，750r/min，30～31℃發酵培養96～110h。剩餘96孔板中的種子液用40％甘油保存於4℃冰箱。將48孔板獲得的菌體離心後，吸取上清適當稀釋，吸取120μL稀釋液至96孔板(提前加入Tris-HCl緩衝溶液和釤溶液)，搖床震蕩混勻20min，顏色變為淡黃色，利用酶標儀測定OD405值，挑選出金黴素相對含量較高的菌株進行搖瓶復篩實驗。

搖瓶復篩結果顯示，本發明方法準確性很高，能夠從眾多孢子中篩選得到金黴素產量相對較高的菌株。

此外，發明人還對比了本發明的基於流式細胞術與孔板高通量篩選的方法，和傳統誘變與孔板高通量篩選直接結合的方法，發現本發明的方法篩選效果極好，不會漏篩具有活性的孢子，分選速度和篩選效率顯著提高。

雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其並非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和範圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護範圍應該以權利要求書所界定的為準。