一種細胞培養試劑及其用途的製作方法
2023-05-14 08:06:41
專利名稱：一種細胞培養試劑及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥技術領域，具體地說涉及一種培養試劑及其用途，更具體地說涉及一種細胞培養試劑及其用途。
背景技術：
幹細胞是一種未分化細胞，有兩個基本特性，一是具有自我複製能力，二是能分化成一種以上的功能細胞。根據分化潛能的大小，幹細胞一般分成三類。第一類是全能幹細胞(totipotent stem cell)，即受精卵在受精後的第1小時內，能分裂為功能一致的全能細胞，將其中的任一細胞置於女性子宮內均可發育為胎兒；第二類是胚胎幹細胞(Embryonic stemcell)，它具有廣泛的分化潛能，能生成除胎盤外的機體所有的組織細胞；第三類是成體幹細胞(adult stem cells)，是一種具有終生自我複製(identical copies)或自我更新(self-renewal)能力的未分化細胞，它分布於不同的組織，並可演變成為各種類型的組織細胞。
幹細胞的培養分離方法可分為三種①有明確定位的幹細胞，往往具有獨特的生長方式，可以直接取其用於研究，或取其聚集區在培養試劑(也稱培養基或培養液)中進行體外培養後進行分離和純化。例如，骨髓中存在造血幹細胞和骨髓間質幹細胞兩種幹細胞，在骨髓的體外培養中，造血幹細胞和骨髓呈懸浮集落生長，而骨髓間質幹細胞則貼壁生長，這兩種幹細胞就很容易進行區分，而且也很容易通過更換培養試劑把兩者分開。②有分子標記的幹細胞。如外周血幹細胞具有表面特異抗原，一般利用帶有標記的抗體與之結合，然後用流式細胞儀(FACS)、磁珠分選儀(MACS)等分選設備進行分選，然後在培養試劑中進行體外培養，再用於治療血液病或作進一步研究。③未發現有特異分子標記的幹細胞，可利用條件培養試劑篩選。例如，神經幹細胞需要在低血清、成纖維生長因子(FGF)及轉換生長因子β(TGFβ)等多種因子存在的培養試劑中進行培養時才能生長，而大部分細胞對血清是依賴的，長期的培養結果使大部分的其他細胞死亡，而神經幹細胞則得到了純化和擴增。
有關幹細胞培養所用的試劑，目前主要有來自於美國Stem cell公司的MesencultTM培養試劑(間質幹細胞培養的專用試劑，間質幹細胞即Mesenchymal stem cells，簡稱MSC)、美國GIBICO公司的高糖DMEM(即H-DMEM)培養試劑、低糖DMEM(即L-DMEM)培養試劑、α-MEM培養試劑、F12培養試劑和RPMI 1640培養試劑等。文獻報導，骨髓MSC多用L-DMEM培養試劑培養，臍血MSC使用MesencultTM培養試劑或α-MEM培養試劑培養，成人外周血單核細胞(Monocytes)來源的多潛能幹細胞(Pluripotent stem cells，簡稱PSC)使用的培養試劑是RPMI 1640培養試劑。這些培養試劑的基礎培養試劑的主要成分包括胺基酸(amino acid)類、維生素或脂類、無機鹽類、核酸類、葡萄糖類以及其他成分等，在此基礎上再加上血漿、血清或細胞因子，得到該試劑的完全培養試劑。
成體幹細胞是人體自身的PSC，是具有相同或相似的細胞表型、多系分化能力的亞全能幹細胞群體，存留在多種組織中並能夠分離出來，而且在適合的微環境(nich)下能分化產生具有特定形態和功能的細胞(特化細胞)，實現跨系統分化，即能夠分化成多種組織細胞，例如，骨髓MSC、外周血單核細胞來源的PSC等。所謂微環境是指存在於幹細胞所處的細胞基質中，對幹細胞命運(是增殖還是分化)起調控作用的各種信號分子(生長因子及其受體、激素及介導分子)的總稱(Watt FM，Hogana-Brigid LM.A bipotential precursor populationfor pancreas and liver within the embryonic endoderm.Science，2000，128871～811)。例如，骨髓MSC具有向骨細胞、軟骨細胞、神經膠質細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞、肝細胞、血管內皮細胞和肺基質等組織細胞轉化的能力(Goodell MA，Jackson KA，Majika SM，et al.Stem cell plasticity in muscle and bone marrow.Ann NY Acad Sci，2001，938208，和Almeida-Porada G，Zanjani ED，Adult stem cell plasticity and methods of detection.Rev ClinExp Hematol，2001，526)，肌組織衛星細胞能在特定的環境下造血，神經幹細胞能分化為肝、血液和骨骼肌等多種組織。但是，成體幹細胞在分化為特化細胞之前常產生一種或幾種祖細胞，然後由祖細胞再分化產生特化細胞。
臍血中的細胞成分一部分來源於新生兒機體，一部分來源於胎盤組織，其早期細胞含量遠遠高於成人外周血，因此理論上除已報導的CD34+造血幹細胞和MSC外，應該還存在其它的成體幹細胞，只是用目前所報導的細胞培養試劑及方法不易培養。如果改變目前所使用的試劑，在臍血中發現、分離出新的成體幹細胞將變為可能。
此外，成體幹細胞如骨髓MSC和外周血單核細胞來源的PSC在自身的移植過程中不存在排斥反應的問題，但骨髓的抽取勢必造成組織損傷和病人的痛苦，而且其含量非常低，105～106個細胞中含有1個骨髓MSC；提取外周血單個核細胞(主要包括單核細胞、淋巴細胞和少量的其它細胞等)來源的PSC時，用血量較大，一般在500ml左右，對於多數患者顯然是不可行的；更重要的是，不管是骨髓MSC，還是外周血單核細胞來源的PSC，分離純化時間均較長(21～24天)，對於急需PSC治療的患者，如果使用自身的骨髓或外周血，更是無法實現。因此，儘管成體幹細胞移植是目前治療血液系統疾病、先天性遺傳疾病以及多發性和轉移性惡性腫瘤疾病的有效方法之一，但其在臨床治療與研究方面的應用根本無法滿足要求。所以尋找新的細胞培養試劑，用於發現、分離與體外大量擴增高純度的成體幹細胞，就顯得非常重要。
但是，迄今為止，尚未見新的細胞培養試劑方面的報導。
發明內容
本發明的目的之一是提供一種新的細胞培養試劑，目的之二是公開其用途。
本發明的技術構思如下1.細胞作為有機體的最小組成單位，在其生長和增殖過程中需要必須的營養成分如胺基酸、維生素、無機鹽以及某些細胞因子等，不同的細胞對某些營養成分的需求也不盡相同。目前常用的細胞培養試劑(如L-DMEM培養試劑、α-MEM培養試劑或RPMI 1640培養試劑等)的營養成分能夠滿足絕大多數細胞生長的需要，但對於某些細胞來講，其中某些營養成分有可能不足甚至缺乏。如果調整(增加或補加)細胞培養試劑的某些基礎營養成分，就有可能發現和培養出新的細胞。
2.常規的細胞培養是採用等滲的培養試劑，在原代細胞培養過程中往往幾種細胞同時增長，不易獲得較純的目的細胞。研究表明，滲透壓的改變可導致細胞容積的改變，激活細胞膜上的離子通道(Robert W，Wei G，Scott H.Blocking swelling-activated chloridecurrent inhibits mouse liver cell proliferation.J Physio 2001，532661和Shen MR，Droogmans G，Eggmont J，et al.Differential expression of volume-regulated anion channel during cell cycleprogression of human cervical cancer cells.J Physio.2000，529385)，這些改變與細胞增殖的調控密切相關。對造血幹細胞的研究發現，滲透壓對集落形成細胞有影響，當滲透壓低於正常的17％或高於正常的23％時對集落的形成明顯的影響，並提示低滲透壓對造血細胞體外培養更有害(張孝兵等，影響臍血造血細胞體外培養與檢測的因素，華東理工大學學報1999，2532)。因此，如果改變培養試劑的滲透壓，就有可能實現對一些細胞增殖，而抑制另外一些細胞的生長或促進其凋亡，從而達到篩選細胞的目的。
本發明通過調整現有培養試劑的組分和含量，配製新的培養試劑，對以上構思進行了逐一實驗驗證。一是添加某些缺少的營養成分，如某些胺基酸、維生素或核苷酸等；二是在所培養細胞必需營養成分的基礎上，再適當增加其含量；三是通過提高某些成分的含量，來提高培養試劑的滲透壓，例如增加無機鹽等的含量，可高出正常值的60％。下文所述的實驗數據和結果均證實本發明的構思是正確的。為便於敘述，將該細胞培養試劑暫定名Potentculture培養試劑。
這裡所述的Potentculture培養試劑是指Potentculture基礎培養試劑，也就是說還可以加入血漿或血清類組分，配製成Potentculture完全培養試劑。
1000ml的Potentculture培養試劑主要包括1000～2000mg胺基酸類、8000～18000mg無機鹽類、10～90mg維生素及脂類、30～100mg核酸類、800～1500mg葡萄糖類和100～200mg其它成分，各組分分別優選1400～1800mg、10000～15000mg、30～60mg、40～70mg、1000～1400mg和120～170mg，分別特別優選1682.9mg、12479.9mg、54.7mg、48mg、1200mg和147.1mg。
與1000ml的Potentculture培養試劑配套使用的血漿或血清類組分是指200～600ml的血漿，或200～600ml血漿和血清的混合物，優選使用400ml的血漿，或300ml血漿和100ml血清的混合物。
這裡所述的胺基酸(amino acid)類包括必需胺基酸(essential amino acid)和非必需胺基酸(nonessential amino acid)，必需胺基酸是包括異亮氨酸(L-isoleucine)、亮氨酸(L-leucine)、賴氨酸(L-lysine·HCL)、蛋氨酸(L-methionine)、苯丙氨酸(L-phenylalanine)、色氨酸(L-tryptophan)、蘇氨酸(L-threonine)或纈氨酸(L-valine)等；非必需胺基酸是包括丙氨酸(L-alanine)、精氨酸(L-arginine)、天冬醯胺(L-asparagine)、天冬氨酸(L-aspartic acid)、半胱氨酸(L-cysteine·HCL·H2O)、胱氨酸(L-cysteine)、穀氨酸(L-glutamic acid)、甘氨酸(glycine)、穀氨醯胺(L-glutamic)、組氨酸(L-histidine)、脯氨酸(L-proline)、絲氨酸(L-serine)或酪氨酸(L-tyrosine)等。
這裡所述的無機鹽類是包括CaCl2、Fe(NO3)3·9H2O、KCl、MgSO4·7H2O、NaCl、NaHCO3或NaH2PO4·2H2O等。
這裡所述的維生素和脂類是包括抗壞血酸(L-ascorbic acid)、生物素(biotin)、偏多酸鈣(D-Ca pantothenate)、氧化膽鹼(choline chloride)、葉酸(folic acid)、肌醇(I-inositol)、菸醯胺(nicotinamide)、吡哆醛(pyridoxal-HCL)、核黃素(riboflavin)、硫氨酸(thiamine HCL)或維生素B12(vitamin B12)等。
這裡所述的核酸類是包括腺苷(adenosine)、胞嘧啶核苷(cytidine)、脫氧腺苷(deoxyadenosine)、脫氧胞嘧啶核苷(deoxycytidine)、脫氧鳥嘌呤核苷(dexyguanosine)、鳥苷(guanosine)、胸腺嘧啶(thymidine)或尿嘧啶(uridine)等。
這裡所述的葡萄糖類是包括葡萄糖(glucose)等。
這裡所述的其它成分是包括硫辛酸(lipoic acid)、酚紅(sodium phenol red)或丙酮酸鹽(pyruvate)等。
這裡所述的血漿或血清類組分是血漿或血漿和血清的混合物。這裡所述的血漿是包括多個健康成人的混合血漿或多份臍血血漿的混合物等中的一種；優選三個以上健康人的混合血漿，或三份以上臍血血漿的混合物；進一步優選三個B肝、C肝、愛滋病病毒陰性的健康人的混合血漿，或三份臍血血漿的混合物。這裡所述的血清是包括馬血清、牛血清或人血清中的一種，優選新生馬血清或胎牛血清。
Potentculture培養試劑對現有細胞培養試劑進行改進①與目前常用的單一細胞培養試劑相比較，添加了更豐富的營養成分，並且部分營養成分的含量也更高，有營養成分互補或疊加的作用，有利於目的細胞的生長；②作為一種篩選細胞的培養試劑，Potentculture培養試劑的滲透壓要比等滲培養試劑高出40％～80％，有利於篩選目的細胞；③Potentculture完全培養試劑含有高濃度的血漿或血清成分如臍血漿，使細胞所處的培養環境更接近細胞自然生長環境，有利於目的細胞的快速擴增；④在大多數情況下，使用Potentculture完全培養試劑不需要額外添加細胞因子，因此使用Potentculture完全培養試劑培養細胞的成本低廉，與目前專用的幹細胞培養試劑相比，便宜2～5倍。
本發明Potentculture培養試劑既能夠用於現有細胞的一般培養，也能夠專門用於目的細胞的篩選培養，特別是能夠用於幹細胞的一般培養和篩選培養；如果選擇合適的細胞培養方法，還能夠用於分離與體外大量擴增高純度的成體幹細胞，或者用於發現、分離新的成體幹細胞。
具體實施例方式
本發明公開一種新的細胞培養試劑及其用途，以滿足人們疾病治療、科學研究、藥物開發等方面的需要。
下面通過實施例來具體說明本發明的內容，所述的實施例是為了更好地闡述本發明，並不是用來限制本發明的範圍。
實施例1、Potentculture培養試劑配方之一1000ml的Potentculture培養試劑的具體組成和含量如下①胺基酸類1682.9mg以下所述的胺基酸產品未標記來源的，均來自美國Gibico公司。
A.8種必需胺基酸 592.4mg包括94.4mg的L-異亮氨酸(貨號22405013，純度＞99％)、94.4mg的L-亮氨酸(貨號12424016，純度＞99％)、131.6mg的L-賴氨酸(貨號12407011，純度＞99％)、26.9mg的蛋氨酸(美國Sigma公司，貨號9625，純度98％)、59.4mg的L-苯丙氨酸(貨號12409017，純度＞99％)、15.7mg的L-色氨酸(貨號12432019，純度＞99％)、85.7mg的L-蘇氨酸(貨號12410015，純度＞99％)和84.3mg的L-纈氨酸(貨號12413019，純度＞99％)。
B.非必需胺基酸 1090.5mg包括15mg的L-丙氨酸(貨號21002019，純度＞99％)、126.2mg的L-精氨酸(貨號12401014，純度＞99％)、30mg的L-天冬醯胺(貨號12416012，純度＞99％)、18mg的L-天冬氨酸(貨號12417010，純度＞99％)、60mg的L-半胱氨酸(貨號11033016，純度＞99％)、43.2mg的L-胱氨酸(貨號12402012，純度＞99％)、45mg的L-穀氨酸(貨號11048014，純度＞99％)、48mg的L-甘氨酸(貨號12421012，純度＞99％)、525.6mg的L-穀氨醯胺(貨號21051024，純度＞99％)、50.4mg的L-組氨酸(貨號12422010，純度＞99％)、24mg的L-脯氨酸(貨號21096029，純度＞99％)、40.2mg的L-絲氨酸(貨號22430011，純度＞99％)和64.9mg的L-酪氨酸(貨號12412011，純度＞99％)。
②無機鹽類 12479.9mg包括240mg的CaCl2(中國天津登峰化學試劑廠，分析純，純度≥98％)、0.06mg的Fe(NO3)3·9H2O(中國大港億中化工廠，分析純，純度＞98％)、480mg的KCl(中國天津市四通化工廠，分析純，純度≥99.5％)、240mg的MgSO4·7H2O(中國天津登峰化學試劑廠，分析純，純度≥98％)、7920mg的NaCl(中國天津市四通化工廠，分析純，純度≥99.5％)、3420mg的NaHCO3(中國河南焦作化工三廠，分析純，純度≥99％)和179.8mg的NaH2PO4·2H2O(中國上海化學試劑總廠所屬上海試劑二廠，優級純，純度≥99.9％)。
③維生素和脂類 54.7mg以下所述的維生素和脂類產品未標記來源的，均來自美國Sigma公司。
30mg的抗壞血酸(貨號7631，純度＞99％)、0.06mg的D-生物素(貨號4501，純度＞99％)、0.8mg的維生素B12(美國Gibico公司，貨號13100011，純度＞99％)、3mg的吡哆醛(貨號9755，純度＞99％)、0.3mg的核黃素(貨號4500，純度＞99％)、3mg偏多酸鈣(貨號2625)、3mg氧化膽鹼(貨號7527，純度＞98％)、3mg葉酸(貨號8758，純度98％)、5.5mg肌醇(貨號7508，純度99％)、3mg菸醯胺(貨號0636，純度95％)、3mg硫氨酸(貨號3902，純度97％)。
④核酸類 48mg以下所述的核酸類產品未標記來源的，均來自美國Sigma公司。
包括6mg的腺苷(貨號9251，純度＞99％)、6mg的胞嘧啶核苷(貨號4654，純度≥99％)、6mg的脫氧腺苷(貨號8668，純度99％～100％)、6mg的脫氧胞嘧啶核苷(貨號0776，純度95％～98％)、6mg的脫氧鳥嘌呤核苷(貨號0991，純度99％～100％)、6mg的鳥苷(貨號6264，純度98％)、6mg的胸腺嘧啶(美國Gibico公司，貨號16495038，純度＞99％)和6mg的尿嘧啶(貨號3750，純度＞99％)。
⑤葡萄糖 1200mg來源中國天津登峰化學試劑廠，分析純，純度≥98％。
⑥其它成分 147.1mg包括0.12mg的葡萄糖硫辛酸(美國Sigma公司，貨號1395，純度99％)、15mg的酚紅(美國Gibico公司，貨號11160025，純度＞99％)和132mg的丙酮酸鹽(美國Sigma公司，貨號5194)。
Potentculture培養試劑還可以添加血漿或血清類組分400ml，即400ml由三份臍血混合成的血漿，配成Potentculture完全培養試劑。
將本發明所配置的Potentculture培養試劑與其他的細胞培養試劑進行比較，能夠發現在組分和含量方面均有明顯差異(表1)，組分更加全面，並調整了組分的含量，使其滲透壓明顯高於其他的細胞培養試劑的滲透壓(表2)，從而達到了所期望的篩選細胞的目的。
表1、Potentculture培養試劑與其他部分細胞培養試劑在組分和含量方面的比較
表2、Potentculture培養試劑與其他部分細胞培養試劑在滲透壓方面的比較吸光度實際測定值(單位A)滲透勢毫滲壓組 別第1次 第2次 第3次 均值(單位Pma) (單位mosmol/L)Potentculture培養試劑 0.489 0.483 0.482 0.484 1.205 480L-DMEM培養試劑0.302 0.307 0.305 0.305 0.757 300A-MEM培養試劑 0.303 0.308 0.302 0.304 0.750 298RPMI 1640培養試劑 0.301 0.300 0.301 0.301 0.747 296MesencultTM培養試劑 0.302 0.305 0.306 0.305 0.750 299實施例2、Potentculture培養試劑配方之二1000ml的Potentculture培養試劑的具體組成和含量如下①胺基酸類 1682.9mg以下所述的胺基酸產品未標記來源的，均來自美國Gibico公司。
A.7種必需胺基酸576.7mg
包括94.4mg的L-異亮氨酸(貨號22405013，純度＞99％)、94.4mg的L-亮氨酸(貨號12424016，純度＞99％)、131.6mg的L-賴氨酸(貨號12407011，純度＞99％)、26.9mg的蛋氨酸(美國Sigma公司，貨號9625，純度98％)、59.4mg的L-苯丙氨酸(貨號12409017，純度＞99％)、85.7mg的L-蘇氨酸(貨號12410015，純度＞99％)和84.3mg的L-纈氨酸(貨號12413019，純度＞99％)。
B.非必需胺基酸 1090.5mg包括15mg的L-丙氨酸(貨號21002019，純度＞99％)、126.2mg的L-精氨酸(貨號12401014，純度＞99％)、30mg的L-天冬醯胺(貨號12416012，純度＞99％)、18mg的L-天冬氨酸(貨號12417010，純度＞99％)、60mg的L-半胱氨酸(貨號11033016，純度＞99％)、43.2mg的L-胱氨酸(貨號12402012，純度＞99％)、45mg的L-穀氨酸(貨號11048014，純度＞99％)、48mg的L-甘氨酸(貨號12421012，純度＞99％)、525.6mg的L-穀氨醯胺(貨號21051024，純度＞99％)、50.4mg的L-組氨酸(貨號12422010，純度＞99％)、24mg的L-脯氨酸(貨號21096029，純度＞99％)、40.2mg的L-絲氨酸(貨號22430011，純度＞99％)和64.9mg的L-酪氨酸(貨號12412011，純度＞99％)。
②無機鹽類 12479.9mg包括240mg的CaCl2(中國天津登峰化學試劑廠，分析純，純度≥98％)、0.06mg的Fe(NO3)3·9H2O(中國大港億中化工廠，分析純，純度＞98％)、480mg的KCl(中國天津市四通化工廠，分析純，純度≥99.5％)、240mg的MgSO4·7H2O(中國天津登峰化學試劑廠，分析純，純度≥98％)、7920mg的NaCl(中國天津市四通化工廠，分析純，純度≥99.5％)、3420mg的NaHCO3(中國河南焦作化工三廠，分析純，純度≥99％)和179.8mg的NaH2PO4·2H2O(中國上海化學試劑總廠所屬上海試劑二廠，優級純，純度≥99.9％)。
③維生素和脂類 54.7mg以下所述的維生素和脂類產品未標記來源的，均來自美國Sigma公司。
30mg的抗壞血酸(貨號7631，純度＞99％)、0.06mg的D-生物素(貨號4501，純度＞99％)、0.8mg的維生素B12(美國Gibico公司，貨號13100011，純度＞99％)、3mg的吡哆醛(貨號9755，純度＞99％)、0.3mg的核黃素(貨號4500，純度＞99％)、3mg偏多酸鈣(貨號2625)、3mg氧化膽鹼(貨號7527，純度＞98％)、3mg葉酸(貨號8758，純度98％)、5.5mg肌醇(貨號7508，純度99％)、3mg菸醯胺(貨號0636，純度95％)、3mg硫氨酸(貨號3902，純度97％)。
④核酸類 48mg以下所述的核酸類產品未標記來源的，均來自美國Sigma公司。
包括6mg的腺苷(貨號9251，純度＞99％)、6mg的胞嘧啶核苷(貨號4654，純度≥99％)、6mg的脫氧腺苷(貨號8668，純度99％～100％)、6mg的脫氧胞嘧啶核苷(貨號0776，純度95％～98％)、6mg的脫氧鳥嘌呤核苷(貨號0991，純度99％～100％)、6mg的鳥苷(貨號6264，純度98％)、6mg的胸腺嘧啶(美國Gibico公司，貨號16495038，純度＞99％)和6mg的尿嘧啶(貨號3750，純度＞99％)。
⑤葡萄糖 1200mg來源中國天津登峰化學試劑廠，分析純，純度≥98％。
⑥其它 147.1mg包括0.12mg的葡萄糖硫辛酸(美國Sigma公司，貨號1395，純度99％)、15mg的酚紅(美國Gibico公司，貨號11160025，純度＞99％)和132mg的丙酮酸鹽(美國Sigma公司，貨號5194)。
Potentculture培養試劑還可以添加血漿或血清類組分400ml，即300ml血漿(三個B肝、C肝、愛滋病病毒陰性的健康成人的混合血漿)、50ml胎牛血清(杭州四季青公司)和50ml新生馬血清(美國GIBICO公司)，配成Potentculture完全培養試劑。
表3、Potentculture培養試劑與其他部分細胞培養試劑在組分和含量方面的比較
實施例3、使用Potentculture培養試劑篩選培養新的目的細胞使用本發明Potentculture完全培養試劑(見實施例2)培養細胞，能夠進行篩選培養目的細胞，現把使用Potentculture完全培養試劑篩選培養目的細胞的具體方法敘述如下其他主要試劑的來源新生馬血清、無鈣鎂Hank’s液均購自美國GIBCO公司，胎牛血清來源於杭州四季青公司，淋巴細胞分離液購自上海試劑二廠。
①臍血單個核細胞的分離無菌條件下採集正常人新鮮臍血50～100ml(婦產科健康產婦)，肝素(50U/ml)抗凝；臍血收集後2h內進行處理新鮮臍血2500r·min-1離心15min，取白膜層(白細胞層)；再用含有2％胎牛血清的無鈣鎂Hank’s液按1∶3進行稀釋，疊加在Ficoll-paque上層，3000r·min-1離心15min，取單個核細胞層，用含有2％胎牛血清的無鈣鎂Hank’s液洗滌備用。
②目的細胞的純化及擴增培養將單個核細胞配成適當濃度的細胞溶液，並接種到Potentculture完全培養試劑中，接種濃度1×106～1×108個細胞/cm2；置於37℃、5％CO2、80％相對溼度的培養箱中培養5～7天，首先貼壁的為成熟的單核細胞，其形態主要為圓形或不規則形，棄去該貼壁的細胞；將未貼壁的懸浮細胞移種到24孔塑料培養板中，更換Potentculture完全培養試劑繼續培養2～3天，所得的貼壁細胞中的成纖維樣細胞即是所要篩選的目的細胞。該細胞經以後的進一步驗證，被證明是一種新的成體幹細胞。
從以上內容可以看出，使用Potentculture培養試劑培養細胞具有以下優點①本培養試劑具有篩選作用對貼壁的條梭狀細胞具有促進作用，而對其他貼壁細胞具有明顯的抑制作用，並促進其凋亡，能夠得到非常均一的條梭狀細胞，有可能得到新的成體幹細胞。
②分離成功率高每份臍血均能夠分離出PSC。而國外報導，大約只有25％的臍血中能夠分離出MSC。
實施例4、使用Potentculture培養試劑篩選培養和大量擴增新的目的細胞使用本發明Potentculture完全培養試劑(見實施例1)培養細胞，能夠進行篩選培養目的細胞，現把使用Potentculture完全培養試劑篩選培養目的細胞的具體方法敘述如下其他主要試劑的來源新生馬血清、無鈣鎂Hank’s液均購自美國GIBCO公司，胎牛血清來源於杭州四季青公司，淋巴細胞分離液購自上海試劑二廠。
①臍血單個核細胞的分離無菌條件下採集正常人新鮮臍血50～100ml(婦產科健康產婦)，肝素(50U/ml)抗凝；臍血收集後2h內進行處理新鮮臍血2500r·min-1離心15min，取白膜層(白細胞層)；再用含有2％胎牛血清的無鈣鎂Hank’s液按1∶3進行稀釋，疊加在Ficoll-paque上層，3000r·min-1離心15min，取單個核細胞層，用含有2％胎牛血清的無鈣鎂Hank’s液洗滌備用。
②目的細胞的純化及擴增培養將單個核細胞配成適當濃度的細胞溶液，並接種到Potentculture完全培養試劑中，接種濃度1×106～1×108個細胞/cm2；置於37℃、5％CO2、80％相對溼度的培養箱中培養5～7天，首先貼壁的為成熟的單核細胞，其形態主要為圓形或不規則形，棄去該貼壁的細胞；將未貼壁的懸浮細胞移種到24孔塑料培養板中，更換Potentculture完全培養試劑繼續培養2～3天，所得的貼壁細胞中的成纖維樣細胞即是所要篩選的目的細胞；再將該培養過程中的未貼壁細胞移種到另一培養器皿，留下的PSC3445繼續培養。如此反覆4～7次，可獲得更大量的、高純度的目的細胞。
③待目的細胞佔培養面積的70％～80％左右時，用含有0.1g％EDTA的0.125％胰酶消化，按1∶2傳代，這樣能夠得到更高純度的目的細胞。該細胞經以後的進一步驗證，被證明是一種新的成體幹細胞。
從以上內容可以看出，使用Potentculture培養試劑培養細胞具有以下優點①本培養試劑具有篩選作用對貼壁的條梭狀細胞具有促進作用，而對其他貼壁細胞具有明顯的抑制作用，並促進其凋亡，能夠得到非常均一的條梭狀細胞。而我們對報導的其他方法進行重複，從實驗結果看，所得到的細胞至少在兩種以上，並非常有可能得到新的成體幹細胞。
②分離成功率高每份臍血均能夠分離出PSC。而國外報導，大約只有25％的臍血中能夠分離出MSC。
③細胞的得率高利用該試劑得到PSC的量是常規方法分離得到PSC的量的8～12倍。
④得到高純度PSC的時間短使用該試劑和本方法能夠得到高純度的PSC，而且時間短，一般在15天左右，報導的時間為21～24天，比目前報導的時間縮短了4～8天，對於治療急性病更有利。
權利要求
1.一種細胞培養試劑，其特徵在於，該細胞培養試劑的組分和配比是1000ml的該細胞培養試劑包括1000～2000mg胺基酸類、8000～18000mg無機鹽類、10～90mg維生素及脂類、30～100mg核酸類、800～1500mg葡萄糖類和100～200mg其它成分。
2.根據權利要求1所述的細胞培養試劑，其特徵在於，所述各組分的配比是1000ml的該細胞培養試劑包括1400～1800mg胺基酸類、10000～15000mg無機鹽類、30～60mg維生素及脂類、40～70mg核酸類、1000～1400mg葡萄糖類和120～170mg其它成分。
3.根據權利要求2所述的細胞培養試劑，其特徵在於，所述各組分的配比是1000ml的該細胞培養試劑包括1682.9mg胺基酸類、12479.9mg無機鹽類、54.7mg維生素及脂類、48mg核酸類、1200mg葡萄糖類和147.1mg其它成分。
4.根據權利要求1～3任一項所述的細胞培養試劑，其特徵在於，所述的胺基酸類包括必需胺基酸和非必需胺基酸。
5.根據權利要求4所述的細胞培養試劑，其特徵在於，所述的必需胺基酸是包括異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蘇氨酸或纈氨酸中的一種。
6.根據權利要求4所述的細胞培養試劑，其特徵在於，所述的非必需胺基酸是包括丙氨酸、精氨酸、天冬醯胺、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、穀氨酸、甘氨酸、穀氨醯胺、組氨酸、脯氨酸、絲氨酸或酪氨酸中的一種。
7.根據權利要求1～3任一項所述的細胞培養試劑，其特徵在於，所述的無機鹽類是包括CaCl2、Fe(NO3)3·9H2O、KCl、MgSO4·7H2O、NaCl、NaHCO3或NaH2PO4·2H2O中的一種。
8.根據權利要求1～3任一項所述的細胞培養試劑，其特徵在於，所述的維生素和脂類是包括抗壞血酸、生物素、偏多酸鈣、氧化膽鹼、葉酸、肌醇、菸醯胺、吡哆醛、核黃素、硫氨酸或維生素B12中的一種。
9.根據權利要求1～3任一項所述的細胞培養試劑，其特徵在於，所述的核酸類是包括腺苷、胞嘧啶核苷、脫氧腺苷、脫氧胞嘧啶核苷、脫氧鳥嘌呤核苷、鳥苷、胸腺嘧啶或尿嘧啶中的一種。
10.根據權利要求1～3任一項所述的細胞培養試劑，其特徵在於，所述的葡萄糖類是葡萄糖。
11.根據權利要求1～3任一項所述的細胞培養試劑，其特徵在於，所述的其它成分是包括硫辛酸、酚紅或丙酮酸鹽中的一種。
12.根據權利要求1～3任一項所述的細胞培養試劑，其特徵在於，所述的1000ml的該細胞培養試劑包括94.4mg的L-異亮氨酸、94.4mg的L-亮氨酸、131.6mg的L-賴氨酸、26.9mg的蛋氨酸、59.4mg的L-苯丙氨酸、15.7mg的L-色氨酸、85.7mg的L-蘇氨酸、84.3mg的L-纈氨酸、15mg的L-丙氨酸、126.2mg的L-精氨酸、30mg的L-天冬醯胺、18mg的L-天冬氨酸、60mg的L-半胱氨酸、43.2mg的L-胱氨酸、45mg的L-穀氨酸、48mg的L-甘氨酸、525.6mg的L-穀氨醯胺、50.4mg的L-組氨酸、24mg的L-脯氨酸、40.2mg的L-絲氨酸、64.9mg的L-酪氨酸、240mg的CaCl2、0.06mg的Fe(NO3)3·9H2O、480mg的KCl、240mg的MgSO4·7H2O、7920mg的NaCl、3420mg的NaHCO3、179.8mg的NaH2PO4·2H2O、30mg的抗壞血酸、0.06mg的D-生物素、0.8mg的維生素B12、3mg的吡哆醛、0.3mg的核黃素、3mg偏多酸鈣、3mg氧化膽鹼、3mg葉酸、5.5mg肌醇、3mg菸醯胺、3mg硫氨酸、6mg的腺苷、6mg的胞嘧啶核苷、6mg的脫氧腺苷、6mg的脫氧胞嘧啶核苷、6mg的脫氧鳥嘌呤核苷、6mg的鳥苷、6mg的胸腺嘧啶、6mg的尿嘧啶、1200mg葡萄糖、0.12mg的葡萄糖硫辛酸、15mg的酚紅和132mg的丙酮酸鹽。
13.根據權利要求1～3任一項所述的細胞培養試劑，其特徵在於，所述的1000ml的該細胞培養試劑還包括200～600ml血漿或血清類組分。
14.根據權利要求13所述的細胞培養試劑，其特徵在於，所述的200～600ml血漿或血清類組分是包括200～600ml的血漿，或200～600ml血漿和血清的混合物中的一種。
15.根據權利要求14所述的細胞培養試劑，其特徵在於，所述的200～600ml血漿或血清類組分是400ml的血漿，或300ml血漿和100ml血清的混合物中的一種。
16.根據權利要求13所述的細胞培養試劑，其特徵在於，所述的血漿或血清類組分是包括血漿或血漿和血清的混合物中的一種，其中血漿是包括多個健康成人的混合血漿或多份臍血血漿的混合物中的一種，血清是包括馬血清、牛血清或人血清中的一種。
17.根據權利要求16所述的細胞培養試劑，其特徵在於，所述的血漿或血清類組分是包括三個以上健康人的混合血漿，或三份以上臍血血漿的混合物中的一種。
18.根據權利要求17所述的細胞培養試劑，其特徵在於，所述的血漿或血清類組分是包括三個B肝、C肝、愛滋病病毒陰性的健康人的混合血漿，或三份臍血血漿的混合物中的一種。
19.根據權利要求16所述的細胞培養試劑，其特徵在於，所述的血清是包括新生馬血清或胎牛血清中的一種。
20.根據權利要求1～3任一項所述的細胞培養試劑作為現有細胞一般培養的細胞培養試劑的應用。
21.根據權利要求20所述的細胞培養試劑作為幹細胞一般培養的細胞培養試劑的應用。
22.根據權利要求1～3任一項所述的細胞培養試劑作為專門用於目的細胞篩選培養的細胞培養試劑的應用。
23.根據權利要求22所述的細胞培養試劑作為專門用於幹細胞篩選培養的細胞培養試劑的應用。
24.根據權利要求1～3任一項所述的細胞培養試劑作為用於分離與體外大量擴增高純度成體幹細胞的細胞培養試劑的應用。
25.根據權利要求1～3任一項所述的細胞培養試劑作為用於發現、分離新的成體幹細胞的細胞培養試劑的應用。
全文摘要
本發明涉及一種細胞培養試劑及其用途。該細胞培養試劑是現有細胞培養試劑組分和含量的多方改進，添加了現有培養試劑缺少的某些營養成分，並在所培養細胞必需營養成分的基礎上，再適當增加其含量，還通過提高某些成分的含量，來提高該培養試劑的滲透壓，能高達正常值的60％。因此，該培養試劑除了能夠用於現有細胞的一般培養外，還能夠專門用於目的細胞的篩選培養，特別是能夠用於幹細胞的一般培養和篩選培養；若選擇合適的細胞培養方法，還能夠用於分離與體外大量擴增高純度的成體幹細胞，或者用於發現、分離新的成體幹細胞。
文檔編號C12N5/08GK1560236SQ20041001689
公開日2005年1月5日 申請日期2004年3月11日 優先權日2004年3月11日
發明者趙書平, 沈茜, 於麗華, 張軍, 徐玉蓮, 李聞捷, 張俊潔 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學