獲得青蒿單倍體植株的方法

2023-05-14 08:19:26 1

專利名稱：獲得青蒿單倍體植株的方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，特別涉及一種獲得青蒿單倍體植株的方法。
背景技術：
青蒿(Artemisia annua L.)為菊科蒿屬一年生草本植物。青蒿素(artemisinin) 是從其植株地上部分提取的一種含有過氧橋結構的倍半萜內酯化合物，是目前最有效的治療瘧疾的藥物。世界衛生組織推薦的最有效的治療瘧疾的方法就是青蒿素聯合療法。隨著近年來對青蒿素藥理研究的逐步深入，科學家還發現青蒿素及其衍生物具有抗血吸蟲、抗炎、抗腫瘤以及免疫調節等功能，是一種極具潛力的天然藥物。目前青蒿素的主要來源是從青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低(0. 01%-1%)，使得這種藥物的大規模商業化生產受到了限制。由於青蒿素結構複雜，人工合成青蒿素的難度大，產量低，成本高，不具備可行性。因此，通過傳統育種和基因工程育種手段培育青蒿素高產品系具有重要的實際應用價值。青蒿為嚴重自交不親和植物，因此高產植株很難通過自交等傳統育種手段在短期內獲得純合品系。通過轉基因技術，如過量表達青蒿素合成途徑上的關鍵酶基因亦可以有效提高青蒿素含量，但是這同樣面臨由於自交不親和導致的高產性狀無法在轉基因後代中穩定遺傳的難題。通過花葯培養培育單倍體進而通過施用秋水仙素等染色體加倍劑使染色體倍性恢復到正常水平是育種學家經常採用且技術相對較為成熟的手段。該技術自上世紀50年代以來已被廣泛地應用於很多植物，包括蔬菜、花卉和糧食作物。基於青蒿的自交不親和性，對於性狀優良、青蒿素含量高的青蒿植株，通過花葯培養培育成單倍體，然後採用染色體加倍劑使單倍體青蒿植株染色體恢復到正常水平進而培育成純合品系是青蒿育種的一個優良方法，通過該方法可以在較短時間內培育出青蒿素含量高的青蒿純合品系。然而，到目前為止，國內外還沒有關於通過花葯培養培育青蒿單倍體植株的報導。

發明內容
本發明的目的在於克服目前尚無培育青蒿單倍體植株方法的現狀，提供一種通過花葯培養培育青蒿單倍體植株的方法。本發明的目的是通過以下技術方案來實現的本發明提供了一種獲得青蒿單倍體植株的方法包括如下步驟(1)選取青蒿花葯中小孢子發育處於單核期的青蒿花蕾；(2)採集小孢子處於單核晚期的花蕾，消毒後將花葯分離出來接種於愈傷誘導培養基上，黑暗培養一段時間後繼續見光培養；(3)將步驟( 長出的愈傷組織轉移至愈傷分化培養基培養至分化出芽；(4)將分化出芽的健壯小苗轉移至生根培養基進行生根培養；
(5)將生根後的茁壯幼嫩青蒿苗移出培養灌，移栽入土 ；(6)對步驟( 獲得的花培植株進行倍性鑑定，篩選出單倍體青蒿植株。優選地，步驟(1)所述小孢子發育時期為單核晚期，即單核靠邊期。優選地，步驟⑵所述花葯接種密度為10 50枚/皿，更優選地為30枚/皿。優選地，步驟(2)所述黑暗培養為25°C下黑暗培養15 50天，更為優選地，為 15 30天。優選地，步驟( 所述見光培養的條件為溫度為25°C、光照強度為20001x、光照周期為16/8(光照/黑暗時間比)；所述見光培養的時間為5 15天，更為優選地，為5 10天。優選地，步驟⑵所述愈傷誘導培養基為MS+6-BA+NAA，其中，6-BA(6-苄氨基嘌呤)濃度優選為0. 5 1. 5mg/L,更優選地為1. Omg/L ；NAA(萘乙酸)濃度優選為0. 1
0.8mg/L，更優選地為 0. 3mg/L0優選地，步驟(3)所述愈傷分化培養基為MS+6-BA+NAA，其中，6-BA濃度優選為
1.O 4. Omg/L,更優選地為4. Omg/L ；NAA濃度優選為0. 01 0. lmg/L,更優選地為0. 05mg/ L0 優選地，步驟(4)所述生根培養基為1/2MS+NAA，其中，NAA濃度優選為O 1. Omg/ L，更優選地為0. 5mg/L。優選地，步驟(6)所述倍性鑑定方法為流式細胞法。與現有技術相比，本發明具有的有益效果為首次實現了通過花葯培養培育出青蒿花培植株，並從其中鑑定出了單倍體青蒿苗，填補了青蒿單倍體育種領域的技術空白，為青蒿純系育種平臺的構建以及以青蒿單倍體為材料的如單倍體轉基因技術等實驗的開展奠定了基礎。


圖1為青蒿小孢子發育時期鑑定圖；其中，(a)為四分體時期小孢子；(b)為單核期小孢子；圖2為青蒿花培植株通過流式細胞術鑑定倍性的結果圖；其中，(a)為對照正常二倍體植株，(b)為檢測到的單倍體青蒿花培植株。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照本領域常規技術條件。實施例1第一步、青蒿小孢子發育時期的鑑定當青蒿進入生殖生長期後，在短日照條件刺激下即進入開花周期。選取直徑在 1 2cm的花蕾，在解剖鏡下用醫用解剖鑷(產品編號WA3030，購於上海醫療器械有限公司)分離出花葯，置於載玻片上，用傳統壓片染色方法製片鏡檢，染色劑採用醋酸洋紅，鑑定出小孢子發育時期，選取發育處於單核晚期即單核靠邊期的青蒿花葯。鏡檢結果如圖1所示其中，(a)顯示小孢子發育處於四分體時期，在該時期，由同一個小孢子母細胞通過減數分裂形成的四個小孢子被共同的胼胝質壁包圍在一起；(b)顯示小孢子發育處於單核期，在四分體時期的小孢子經過一段時間的發育之後，包被在其外面的胼胝質壁逐漸溶解， 四個小孢子從裡面游離出來，即進入單核期，單核期小孢子的體積相比較之前的四分體時期迅速增大，並形成一定形狀和厚度的壁。第二步、青蒿花葯的分離接種通過鏡檢觀察後根據結果選取發育處於單核晚期的青蒿花蕾，採集後置於2. OmL 離心管，在超淨臺上完成分離和接種操作，包括如下步驟(1)將花葯分離和接種整個過程中用到的所有器械放入超淨臺紫外殺菌30min， 包括解剖鏡、醫用解剖鑷(產品編號WA3030，購於上海醫療器械有限公司)、針灸針(市售可得，規格為0. 25mm X 40mm)等。(2)用70%乙醇對花蕾進行外部消毒lmin，接著用15%次氯酸鈉對花蕾進行外部消毒lOmin，最後用滅菌水清洗花蕾5次。(3)將經步驟⑵消毒過的花蕾置於解剖鏡下方，用解剖鑷分離出花蕾內部的花。 青蒿有兩種花，包括排列於花蕾外輪的單性花(雌性花)和排列於內部的數輪兩性花(包括雌蕊和雄蕊)。用解剖鑷繼續割裂分離出的兩性花，將其內部的花葯剝離出來。(4)將分離出來的青蒿花葯用針灸針挑起接種於愈傷誘導培養基上，接種密度為每皿30枚左右。培養基配方為MS+1. Omg/L 6-BA+O. 3mg/L NAA，裝於90mm常規培養皿。第三步、愈傷誘導和分化培養將第二步中接種過花葯後的培養皿置於25°C下黑暗培養20天，以誘導出愈傷，之後進行見光培養，培養條件為25°C、光照強度為20001x、光照周期為16/8 (光照/黑暗時間比)，見光培養時間為7天。之後將白色稍泛綠色的胚性愈傷轉移至愈傷分化培養基進行分化培養。愈傷分化培養基裝於90mm常規培養皿，培養基配方為MS+4. 0mg/L6-BA+0. 05mg/L NAA，培養條件同愈傷誘導見光培養的條件。愈傷分化培養時間為25天。第四步、生根壯苗愈傷分化後，剪取茁壯嫩芽接種於生根培養基。生根培養基裝於150mL三角瓶，每瓶盛裝50mL，培養基配方為1/2MS+0. 5mg/L NAA。生根培養20天後，將再生的花培植株移入珍珠巖煉苗3天。煉苗後將健康幼嫩的青蒿花培植株移栽入土。花培植株移栽入土後施以常規水分和養料，培養45天後，即可採用流式細胞術對花培植株進行倍性鑑定。第五步、花培植株倍性檢測本實施例採用流式細胞術對所得花培植株進行倍性鑑定，該方法快捷靈敏，已被廣泛應用於植物的倍性鑑定。流式細胞術的檢測原理為當植株細胞的細胞核攜帶有螢光素標記物，並通過雷射照射區時，將受雷射激發，產生代表細胞核內不同物質、不同波長的螢光信號。這些螢光信號的強度與細胞核的DNA含量成正比。螢光信號經光電倍增管接收後可轉換為電信號， 再通過模/數轉換器，將連續的電信號轉換為可被計算機識別的數位訊號，最後即可通過計算機輸出結果判定被檢測細胞的DNA含量。流式細胞法的檢測方法為
(1)配製實驗所需溶液，包括MgSO4緩衝液、提取液A和提取液B。MgSO4 緩衝液0. 246g(IOmM)MgSO4 · 7H20+0. 370g(50mM)KC1+0. 120g(5mM) HEPES (準確稱取HEPES1. 1915g，加入ddH20定容至1L。過濾除菌，分裝後4°C保存)。以 ddH20 定容至 IOOmLdM pH 至 8. 0。提取液A :MgS04緩衝液中附加(w/v)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)-30，貯藏於4°C 中備用；提取液B :MgS04 緩衝液附加 0. 40mg/mL 碘化丙錠(propidium iodide, PI)和 0. 04mg/mL RNase (DNase free)，現配現用。配製 DNase free 的 RNA 酶時，將 RNA 酶 A 溶於 IOmM Tris · HCl (pH 7. 5)、15mMNaCl 中，配成 10mg/mL 的溶液，於 100°C 中加熱 15min，緩慢冷卻至室溫後分裝成小份，保存於-20°C冰箱中。(2)樣品製備剪取幼嫩青蒿葉片放入培養皿中，加入ImL的提取液A，在培養皿裡用鋒利的刀片快速將其切碎，對照和花培植株均做一份。溶液用200目尼龍布過濾至1. 5mL離心管中，以 IOOOrpm的轉速離心5min，棄去上清液至0. ImL刻度處；再加入ImL提取液A於沉澱中，充分混勻，以IOOOrpm的轉速離心5min，棄去上清液至0. 1刻度處(重複三次)。加入500 μ L 提取液B，以錫箔紙包住離心管以避光保存，充分混勻後於37°C染色30min。⑶倍性檢測步驟( 染色後即可進行上樣檢測。將對照和花培植株樣本進行流式細胞儀檢測並通過與之連接的電腦軟體BD FACS Calibur Software Package分析檢測結果，繪製成圖。結果如圖2所示其中，(a)為對照正常二倍體植株流式細胞術檢測結果圖，圖中結果顯示在200通道處有單峰；(b)為單倍體花培植株流式細胞術檢測結果圖，圖中結果顯示在 100通道處有單峰。結果顯示，本實施例的方法通過花葯培養獲得了青蒿單倍體植株。實施例2本實施例同實施例1，所不同之處在於第二步的步驟中，所述接種密度為10枚/皿；所述愈傷誘導培養基配方為 MS+0. 5mg/L 6-BA+O. lmg/L NAA ；第三步中，所述接種過花葯後的培養皿是置於25°C下黑暗培養15天；所述見光培養時間為5天；所述愈傷分化培養基配方為MS+1. 0mg/L6-BA+0. 0lmg/L NAA。第四步中，所述生根培養基配方為1/2MS。實施例3本實施例同實施例1，所不同之處在於第二步的步驟中，所述接種密度為20枚/皿；所述愈傷誘導培養基配方為 MS+0. 8mg/L 6-BA+O. 5mg/L NAA ；第三步中，所述接種過花葯後的培養皿是置於25°C下黑暗培養30天；所述見光培養時間為10天；所述愈傷分化培養基配方為MS+2. 0mg/L6-BA+0. 08mg/L NAA。第四步中，所述生根培養基配方為1/2MS+0. 8mg/L NAA。實施例4本實施例同實施例1，所不同之處在於第二步的步驟中，所述接種密度為50枚/皿；所述愈傷誘導培養基配方為MS+1. 5mg/L6-BA+0. 8mg/L NAA ；第三步中，所述接種過花葯後的培養皿是置於25°C下黑暗培養50天；所述見光培養時間為15天；所述愈傷分化培養基配方為MS+3. Omg/L 6-BA+O. lmg/L NAA。第四步中，所述生根培養基配方為1/2MS+1. Omg/L NAA。綜上所述，本發明首次實現了通過花葯培養培育出青蒿花培植株，並從其中鑑定出了單倍體青蒿苗，填補了青蒿單倍體育種領域的技術空白，為青蒿純系育種平臺的構建以及以青蒿單倍體為材料的如單倍體轉基因技術等實驗的開展奠定了基礎。
權利要求
1.一種獲得青蒿單倍體植株的方法，其特徵在於，包括如下步驟(1)選取青蒿花葯中小孢子發育處於單核期的青蒿花蕾；(2)採集小孢子發育處於單核晚期的花蕾，消毒後將花葯分離出來接種於愈傷誘導培養基上，黑暗培養，之後見光培養；(3)將步驟( 長出的愈傷組織轉移至愈傷分化培養基培養至分化出芽；(4)將分化出芽的健壯小苗轉移至生根培養基進行生根培養；(5)將生根後的茁壯幼嫩青蒿苗移出培養灌，移栽入土；(6)對步驟( 獲得的花培植株進行倍性鑑定，篩選出單倍體青蒿植株。
2.如權利要求1所述的獲得青蒿單倍體植株的方法，其特徵在於，步驟(1)所述的小孢子發育時期為單核晚期，即單核靠邊期。
3.如權利要求1所述的獲得青蒿單倍體植株的方法，其特徵在於，步驟(2)所述花葯接種密度為10 50枚/皿。
4.如權利要求3所述的獲得青蒿單倍體植株的方法，其特徵在於，所述花葯接種密度為30枚/皿。
5.如權利要求1所述的獲得青蒿單倍體植株的方法，其特徵在於，步驟(2)所述黑暗培養具體為在25°C下黑暗培養15 50天。
6.如權利要求1所述的獲得青蒿單倍體植株的方法，其特徵在於，步驟(2)所述見光培養的條件為溫度為25°C、光照強度為20001x、光照周期為光照/黑暗時間比是16/8 ；所述見光培養的時間為5 15天。
7.如權利要求1所述的獲得青蒿單倍體植株的方法，其特徵在於，步驟(2)所述愈傷誘導培養基為MS+6-BA+NAA，其中6-BA濃度為0. 5 1. 5mg/L, NAA濃度為0. 1 0. 8mg/L。
8.如權利要求1所述的獲得青蒿單倍體植株的方法，其特徵在於，步驟(3)所述愈傷分化培養基為MS+6-BA+NAA，其中6-BA濃度為1. 0 4. Omg/L, NAA濃度為0. 01 0. lmg/L。
9.如權利要求1所述的獲得青蒿單倍體植株的方法，其特徵在於，步驟(4)所述生根培養基為1/2MS+NAA，其中NAA濃度為0 1. Omg/L。
10.如權利要求1所述的獲得青蒿單倍體植株的方法，其特徵在於，步驟(6)所述倍性鑑定方法為流式細胞法。
全文摘要
本發明公開了一種獲得青蒿單倍體植株的方法，該方法通過分離小孢子發育時期處於單核晚期的青蒿花葯，依次通過愈傷誘導、愈傷分化和生根培養獲得青蒿花培植株。之後通過流式細胞術檢測所獲得的青蒿花培植株的遺傳物質倍性，結果顯示通過本發明所述方法可以獲得單倍體青蒿植株。本發明填補了青蒿單倍體育種領域的技術空白，為青蒿純系育種平臺的構建和以單倍體青蒿為材料的如單倍體轉基因技術等實驗的開展奠定了基礎。
文檔編號A01H4/00GK102524066SQ20111043080
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月20日 優先權日2011年12月20日
發明者吳韶龑, 唐克軒, 沈乾, 王濤, 陸續, 陳韻斐 申請人:上海交通大學