尼古丁處理後樹突狀細胞用於預防和治療腫瘤的製作方法

2023-05-14 19:32:16

專利名稱：尼古丁處理後樹突狀細胞用於預防和治療腫瘤的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術和醫學領域。具體而言，本發明涉及用尼古丁處理樹 突狀細胞的方法，還涉及通過該方法得到的可用於預防和治療腫瘤的樹突狀細 胞及其組合物和用途。
背景技術：
腫瘤，是當前威脅人類健康的主要疾病之一。據WTO統計，2002年全世界 因惡性腫瘤死亡人數達710.6萬。我國2000年癌症發病人數180-200萬，死亡人 數140-150萬。因此，腫瘤發生及其預防和治療已成為生命科學領域研究的重點 和熱點。
腫瘤發生是一個極為複雜的過程，它涉及機體外部多因素、機體內部多系 統，由外部因素通過內部因素髮揮交互作用而進行的過程，即是一個系統性疾 病的過程。
免疫系統在機體內發揮著免疫防禦、免疫調節、免疫監視的功能，該功能 的發揮主要依賴於機體固有免疫應答和適應性免疫應答。現在的研究表明，樹 突狀細胞(Dendritic ce仏DC)啟動適應性免疫應答的啟始階段(即啟動對抗原的 攝取和遞呈)，並對固有性免疫應答的主要成分自然殺傷細胞(Nature Killer cell， NK)的功能具有調節作用。因此，樹突狀細胞已成為腫瘤免疫治療的研究熱點。
多個實驗系統證實，經腫瘤抗原、腫瘤裂解物、腫瘤抗原肽負載的樹突狀 細胞能夠在機體內誘導針對腫瘤的免疫應答，並導致腫瘤的消退。此方法在人 體臨床實驗中也已獲得初步成功，並由此證實了在腫瘤發生前建立針對腫瘤的 特異性免疫可以預防腫瘤的形成，該理論成為腫瘤疫苗研製的理論基礎。基於 腫瘤抗原誘導特異性免疫應答的腫瘤免疫治療方法成為手術、化療、放療的有 益補充和替代治療手段。
樹突狀細胞是介導機體產生抗腫瘤免疫的關鍵細胞。增強樹突狀細胞的誘 導免疫應答的能力成為腫瘤免疫治療的關鍵，其方法包括腫瘤抗原負載、抗原基因轉染、腫瘤總RNA負載、細胞因子刺激等。然而，細胞因子刺激或分子轉
染中刺激物的穩定性相對較差，其還存在價格昂貴、及使用不便的缺點。
乙醯膽礆、膽鹼酯酶和乙醯膽礆菸鹼樣受體(nicotinic acetylcholine receptor, nAchR)在神經系統和非神經細胞(如免疫細胞、內皮細胞和上皮細胞) 中有廣泛的表達。nAchR配體一一尼古丁，是由芳族六元環(吡啶)和脂族五元環 (吡咯烷)通過單鍵連接而形成的天然化合物。提純後的尼古丁是一種味苦、無色 透明的油質液體，揮發性強，在空氣中極易氧化成暗灰色，能迅速溶於水及酒 精中，通過口鼻支氣管黏膜很容易被機體吸收，粘在皮膚表面的尼古丁亦可被 吸收滲入體內。它具有性質穩定、易於獲得和價廉的優點。
目前，尼古丁作為藥物已廣泛應用於神經退行性疾病和潰瘍性結腸炎的治 療，但尚未有關於用尼古丁處理樹突狀細胞，並將處理後的樹突狀細胞用於腫 瘤的預防和治療的文獻報導。
本領域迫切需要找到可簡單、經濟、安全、有效地增強樹突狀細胞誘導免 疫應答的能力的方法和試劑，並需要開發出可有效用於腫瘤免疫治療的樹突狀 細胞及其組合物。
本發明的目的正是提供一種通過尼古丁刺激，可用於預防和治療腫瘤的樹 突狀細胞及其組合物，以及該細胞或組合物在製備預防和治療腫瘤的藥物中的 用途。
在本發明的第一方面中，提供了一種製備樹突狀細胞方法，所述方法包括以 下步驟
(1) 在摩爾濃度為lX10力 lX10^摩爾/升的尼古丁或其鹽存在的條件下，培
養未成熟的樹突狀細胞；
(2) 收集處理後的樹突狀細胞。
在本發明的一個優選例中，步驟(l)中的培養時間為6-72小時，更優選8-48
(-)-尼古丁
發明內容小時，更優選10-24小時，最優選12-14小時。
在本發明的一個優選實施方式中，所述方法還包括步驟在步驟(1)和(2)之
間，使步驟(l)中所得的尼古丁處理後的細胞與腫瘤抗原接觸。
在本發明的一個優選例中，所述腫瘤抗原是腫瘤細胞的裂解物、溶解物或人 工合成的腫瘤抗原。
在本發明的另一優選例中，所述接觸時間為l-24小時，更優選2-12小時，更 優選3-8小時，最優選4小時。
在本發明的另一優選例中，所述腫瘤抗原的濃度為0.1-10mg/ml，優選 0.5-5mg/ml，最優選l-2mg/ml。
在本發明的一個優選實施方式中，所述尼古丁或其鹽的濃度為l X 10'8 1 X 10—4摩爾/升。
在本發明的一個優選例中，所述尼古丁或其鹽的濃度為l X 10—7 1 X 10'5摩爾/ 升，最優選lX10々摩爾/升。
在本發明的另一優選例中，所述尼古丁的鹽選自尼古丁的琥珀酸鹽、硫酸 鹽、鹽酸鹽。
在本發明的另一優選例中，所述尼古丁的來源為化學合成、提取自天然 植物。所述天然植物選自菸草、番茄、枸杞子等。
在本發明的另一優選例中，所用尼古丁或其鹽為尼古丁或其鹽在水、培養 基或醇中的溶液，所述醇優選乙醇。
在本發明的一個優選實施方式中，所述樹突狀細胞為獲自哺乳動物的未成熟 樹突狀細胞。
在本發明的一個優選例中，所述樹突狀細胞是大鼠、小鼠或人的樹突狀細胞， 優選為人的樹突狀細胞。
在本發明的第二方面中，提供了一種樹突狀細胞，所述樹突狀細胞是用上文 所述方法中的任一種方法製備得到的。
在本發明的一個優選實施方式中，所述樹突狀細胞細胞表面a7尼古丁受體表 達量與未經處理的樹突狀細胞提高相比提高了 15-60%，且細胞表面共刺激分子 CD80、 CD86、 CD40、 CDllb和CD54的表達量與處理前的樹突狀細胞相比提高了 100-300%。
在本發明的一個優選例中，細胞表面a7尼古丁受體表達量提高了20-5Q/。，最 優選提高了 23-28%。在本發明的另一優選例中，細胞表面共刺激分子CD80、 CD86、 CD40、 CDllb 和CD54的表達量提高了 120-250%，最優選提高了 100-200%。 在本發明的第三方面，提供了一種藥物組合物，其包含
i) 用本發明的方法製得的樹突狀細胞；和
ii) 藥學上可接受的載體。
在本發明的一個優選實施方式中，所述藥物組合物中所述樹突狀細胞的量為 104-108個。
在本發明的一個優選實施例中，所述藥物組合物中含有105-107個樹突狀細 胞，更優選含有106-107個樹突狀細胞。
在本發明的一個優選例中，所述藥物組合物用於預防和/或治療腫瘤。
在本發明的一個優選例中，所述腫瘤選自乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、原發
性肝癌、淋巴瘤。
在本發明的一個優選例中，所述組合物中還含有從脾臟、外周血誘導的T淋 巴細胞或自然殺傷細胞，或在給予本發明的樹突狀細胞之前、之時或之後給予 T淋巴細胞和自然殺傷細胞。
在本發明的另一優選實施例中，所述藥物組合物中還包含選自下組的其它 治療劑或活性成分如TNF-a、 TNF-b、 IFN-a、血管它丁、內皮它丁、甘磷醯 芥、血B卜啉、石蒜鹼內銨鹽、鴉膽子乳、足葉乙甙、脫水衛矛醇、阿黴素、三 苯氧胺、5-氟尿嘧啶、去甲斑螯素、雙呋喃氟尿嘧啶、葫蘆素、三尖杉酯鹼、 冬凌草乙素、馬藺子甲素、雲芝糖肽、阿糖胞苷、卡波鉑、紫杉醇、香菇多糖、 氟他胺、異環磷醯胺、烏苯美司、醋酸亮丙瑞林、脫氧氟尿苷、洛波鉑、依林 諾特肯、來屈唑或替尼泊甙。
在本發明的第四方面中，提供了本發明的樹突狀細胞在製備用於預防和/或治 療腫瘤的藥物中的用途。
在本發明的第五方面中，提供了一種尼古丁的用途，其用於製備具有腫瘤 預防和/或治療功能的樹突狀細胞或具有增強的誘導免疫應答能力的樹突狀細 胞。
在本發明的另一方面，還提供了一種試劑盒，所述試劑盒包含
i) 容器；
ii) 裝於容器中的用本發明的方法製得的樹突狀細胞或本發明的組合物；和
iii) 任選的使用說明書。本發明用尼古丁刺激樹突狀細胞的方法簡單、經濟、安全、有效，其中尼 古丁作為化合物，具有細胞因子刺激或分子轉染所無法比擬的經濟、穩定、方 便的優點。
本發明樹突狀細胞誘導免疫應答的能力提高，具有良好的抑制和治療腫瘤 的效果，其對表達腫瘤非特異性抗原和/或特異性抗原的腫瘤具有預防和治療效 果，可用於各種腫瘤。


圖l所示為ci7 nAchR受體組成性的表達於成熟和未成熟的樹突狀細胞。
imDC:未成熟樹突狀細胞；maDC;成熟的樹突狀細胞；d:培養天數；0t BTX-FITC:以FITC螢光素標記的銀環蛇毒素。
圖2所示為尼古丁對樹突狀細胞表達a7nAchR受體的促進作用。DC:樹突狀細胞；Ni:尼古丁； BTX:銀環蛇毒素。
圖3所示為尼古丁對未成熟樹突狀細胞表達表面共刺激分子和a7 nAchR的促進作用。
圖4所示為尼古丁對未成熟和成熟樹突狀細胞的吞噬能力的增強作用。A: 未成熟DC和成熟DC的流式細胞分析；B:未成熟DC流式細胞分析；C:成熟 DC的流式細胞分析；D:柱狀圖，顯示尼古丁和拮抗劑比較有明顯的統計學差 異。
圖5所示為尼古丁對抗原依賴性的殺傷性T細胞增殖的促進作用。A:尼古 丁促進雞卵白蛋白依賴性的殺傷性T細胞增殖；B:尼古丁促進雞卵白蛋白特異 性表位多肽依賴性的殺傷性T細胞增殖。imD。未成熟樹突狀細胞；maDC: 成熟樹突狀細胞；Ni:尼古丁； BTX/BGTX:銀環蛇毒素；GF257:雞卵白蛋 白特異性表位多肽；OVA:雞卵白蛋白。
圖6所示為尼古丁處理後DC體內轉輸對表達腫瘤特異性抗原的腫瘤的預防 效果。
圖7所示為尼古丁處理後DC體內轉輸對表達腫瘤非特異性抗原的腫瘤的預 防效果。
圖8所示為尼古丁處理後DC體內轉輸對腫瘤的治療效果。
具體實施例方式
本發明人通過長期而深入的研究發現通過尼古丁刺激可以提高樹突狀細 胞誘導免疫應答的效率，轉輸經尼古丁處理後的樹突狀細胞可有效預防和治療 腫瘤。經實驗迸一步證實，尼古丁不但可促進骨髓來源樹突狀細胞上調表達
nAchR、共刺激分子CD80和CD86的表達，而且還可促進樹突狀細胞對抗原的 吞噬，可用於預防表達腫瘤特異性抗原的腫瘤的形成。此外，發明人還發現用 尼古丁和腫瘤抗原聯合處理樹突狀細胞可提高對表達腫瘤特異性或非特異性 抗原的腫瘤的預防和治療作用。發明人在此基礎上完成了本發明。
尼古丁
本發明中所用的尼古丁為具有下式結構的化合物或其生物學上、藥學上可 接受的鹽
(-)-尼古丁
本發明的尼古丁可採用提取自天然植物，例如菸葉、多種茄科植物的果實 (如番茄、枸杞子等)，也可採用化學合成的尼古丁。
提純後的尼古丁是一種味苦、無色透明的油質液體，揮發性強，在空氣中 極易氧化成暗灰色，能迅速溶於水及酒精中。因此，可在施用前，將尼古丁溶 於水、培養基或醇(例如乙醇、丙醇)中配製成溶液。
本發明用於處理樹突狀細胞的尼古丁的濃度為1乂10-9~1乂10-3摩爾/升，優
選lX10-8 lX10-4摩爾/升，更優選1X 10—7-1 X10-5摩爾/升，最優選1X10'7摩爾/升。
樹突狀細胞
如本文所用，術語"本發明的樹突狀細胞(DC)"、"尼古丁處理的樹突狀 細胞"可互換使用，均指用尼古丁刺激後能起到預防和/或治療腫瘤作用的樹突 狀細胞，其中還包括在尼古丁處理後用腫瘤抗原進一步處理的樹突狀細胞。
用於本發明的樹突狀細胞可獲自哺乳動物，優選獲自大鼠、小鼠或人。在 本發明的一個實施方式中，所述樹突狀細胞獲自小鼠。在本發明的另一實施方式中，所述樹突狀細胞獲自人。
用於本發明的樹突狀細胞可為未成熟的樹突狀細胞。可使用本領域已知的
方法(例如GM-CSF、 IL-4等)從骨髓細胞、臍帶血細胞、外周血等單核細胞誘導 產生。
用尼古丁處理樹突狀細胞
在本發明中，用尼古丁處理所得的樹突狀細胞，以獲得本發明的樹突狀細 胞，所述方法包括以下步驟
(1) 在摩爾濃度為lX10" lXl(^摩爾/升的尼古丁或其鹽存在的條件下，培 養未成熟的樹突狀細胞；
(2) 收集處理後的樹突狀細胞。
在本發明的優選實施方式中，所用尼古丁的終濃度為ixlcr9 1 x 10—3摩爾/
升，優選為lX10-s lX10"摩爾/升，更優選lX10llX10's摩爾/升，最優選l
xio々摩爾/升。
在本發明的優選實施方式中，尼古丁處理時間為6-72小時，更優選8-48小 時，更優選10-24小時，最優選12-14小時。
收集本發明的樹突狀細胞後，可採用流式細胞術等方法對其表面的尼古丁 a7受體的表達量進行檢測。在本發明的優選實施方式中，該受體在本發明樹突狀細 胞表面的表達量與處理前的樹突狀細胞相比提高了 15-60%，更優選提高了20-50%， 最優選提高了23-28%。
在本發明的優選實施方式中，還對本發明樹突狀細胞表面共刺激分子的表達進 行了檢測。共剌激分子CD80、 CD86、 CD40、 CDUb和CD54在本發明樹突狀細胞 表面的表達量與處理前的樹突狀細胞相比提高了 100-300%,更優選提高了 120-250%，最優選提高了 100-200%。
同時研究表明本發明的經尼古丁處理的樹突狀細胞能促進未成熟和成熟樹突 狀細胞的吞噬功能、增強樹突狀細胞的抗原遞呈功能以及促進產生效用性CTL。從
而可用於預防和治療腫瘤。
在本發明的優選實施方式中，所述方法還包括使腫瘤抗原與步驟(l)中的樹 突狀細胞接觸的步驟。
在本發明的優選實施方式中，所用腫瘤抗原選自腫瘤細胞的裂解物、溶解 物或人工合成的腫瘤抗原，其濃度為0.1-10mg/ml，優選0.5-5mg/m，最優選1- 2mg/ml。在本發明的優選實施方式中，用腫瘤抗原處理的時間為l-24小時，更優選2-12小時，更優選3-8小時，最優選4小時。由上述方法所得的樹突狀細胞表面a7尼古丁受體表達量比未經處理的樹突狀細胞提高25%以上，且所述細胞對腫瘤發生和生長具有抑制作用。可將本發明的樹突狀細胞通過注射等方式，直接給予需要預防或治療腫瘤的對象。也可將體外處理後的細胞回輸到細胞供應者的體內。所述細胞的用量優選為104-108個樹突狀細胞/次，更優選為105-107個樹突狀細胞/次，最優選為106-107個樹突狀細胞/次。組合物如本文所用，術語"本發明的組合物"是指含有本發明的經尼古丁處理的樹突狀細胞作為活性成分的組合物，其中包括藥物組合物。藥物組合物可含有(a)有效量的本發明樹突狀細胞；以及(b)藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。本發明中，術語"含有"表示各種成分可一起應用於本發明的混合物或組合物中。因此，術語"主要由...組成"和"由...組成"包含在術語"含有"中。本發明中，"藥學上可接受的"成分是適用於人和/或動物而無過度不良副反應(如毒性、刺激和變態反應)即有合理的效益/風險比的物質。術語"藥學上可接受的載體"指用於治療劑給藥的載體，它們本身不誘導產生對接受該組合物的個體有害的抗體，且給藥後沒有過分的毒性。這些載體是本領域普通技術人員所熟知的。在《雷明頓藥物科學》(Remington's Pharmaceutical Sciences, MackPub.Co.， N丄1991年)中可找到關於藥學上可接受的載體的充分討論。本文所用的術語"有效量"指治療劑治療、緩解或預防目標疾病或狀況的 量，或是表現出可檢測的治療或預防效果的量。對於某一對象的精確有效量取決於該對象的體型和健康狀況、病症的性質和程度、以及選擇給予的治療劑和/或治療劑的組合。因此，預先指定準確的有效量是沒用的。然而，對於某給定的狀況而言，可以用常規實驗來確定該有效量，臨床醫師是能夠判斷出來的。用本發明方法製備的樹突狀細胞可以廣泛應用於預防和治療各種腫瘤，代表性的例子包括(但並不限於)乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、原發性肝癌、淋巴瘤等。本發明的用於預防和治療各種腫瘤的藥物組合物含有安全有效量的本發明上述經尼古丁處理的樹突狀細胞的細胞群，優選含有104-108個樹突狀細胞/ 劑，更優選含有105-107個樹突狀細胞/劑，最優選含有106-107個樹突狀細胞/劑。配製好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但並不限於) 肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、皮內、或局部給藥。也可通過轉輸給予本發明 的組合物或用尼古丁處理的樹突狀細胞。如本文所用，術語"轉輸"是指將細 胞在體外處理後輸入或回輸入機體。本發明的組合物中還可含有從脾臟、外周血誘導的T淋巴細胞或自然殺傷 細胞。也可在給予本發明的樹突狀細胞之前、之時或之後給予T淋巴細胞和自然殺傷細胞。使用藥物組合物時，是將安全有效量本發明的樹突狀細胞施用於哺乳動物。在本發明的另一個優選例中，每天施用1 6劑本發明的組合物，優選施用 1 3劑；最優選的，每天服用的劑量為l劑。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之內的。在治療和預防腫瘤時，本發明的樹突狀細胞可以單用，還可同時和其它治 療劑或治療方法聯用。所述其它治療劑包括(但不限於)如TNF-a、 TNF-b、 IFN-a、血管它丁、內 皮它丁、甘磷醯芥、血卟啉、石蒜鹼內銨鹽、鴉膽子乳、足葉乙甙、脫水衛矛 醇、阿黴素、三苯氧胺、5-氟尿嘧啶、去甲斑螯素、雙呋喃氟尿嘧啶、葫蘆素、 三尖杉酯鹼、冬凌草乙素、馬藺子甲素、雲芝糖肽、阿糖胞苷、卡波鉑、紫杉 醇、香菇多糖、氟他胺、異環磷醯胺、烏苯美司、醋酸亮丙瑞林、脫氧氟尿苷、 洛波鉑、依林諾特肯、來屈唑或替尼泊甙等。所述其它治療方法包括(但不限於)放射療法、化學療法或手術療法等。本發明的優點本發明的方法和樹突狀細胞具有如下的優點1) 首次利用尼古丁對樹突狀細胞進行了表達刺激，其中尼古丁作為化合物，具有細胞因子刺激或分子轉染所無法比擬的經濟、穩定、方便的優點；2) 本發明的方法簡單、經濟、安全、有效；3) 本發明樹突狀細胞誘導免疫應答的能力提高，具有良好的抑制和治療腫 瘤的效果，其對表達腫瘤非特異性抗原和/或特異性抗原的腫瘤具有預防和治療效果，可用於各種腫瘤。實施例以下將以實施例進一步說明本發明。這些實施例僅用於舉例說明本發明， 但不以任何方式限制本發明。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建 議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟 悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的常規方法及材料皆可應 用於本發明方法中。實施例l.樹突狀細胞的體外尼古丁處理顏腳鄉潘扁雌將小鼠(C57BL/6，中國科學院上海實驗動物中心，雌性，《8周齡)處死後， 在無菌條件下分離骨髓細胞。低滲法破解紅細胞後，以GM-CSF 10ng/mL和IL-4 lng/mL(購自R&D公司)誘導樹突狀細胞。培養4天後(37"， 5。/oC02)以無菌PBS 洗去懸浮細胞後，即得未成熟的樹突狀細胞。將該未成熟的樹突狀細胞，按106個細胞/6釐米細胞培養皿的密度，以1X 1(T、lXl(rS摩爾/升的尼古丁刺激12-14小時，即得尼古丁處理後的樹突狀細胞。艦猶雄表鵬才7一受歸澄層微通過流式細胞術檢測樹突狀細胞表面表達的尼古丁a7的受體，以a BTX-FITC染色。在第四天時樹突狀表面表達尼古丁a7受體的平均螢光密度為2.03。而到第 六天和第八天時，該數值分別增加到2.23和4.04，當以LPS(內毒素)誘導樹突狀 細胞成熟時，該受體密度增加到35.13(見圖1)。繼用尼古丁處理樹突狀細胞可提高該細胞表面尼古丁a7受體的表達。實施例2.經尼古丁處理的樹突狀細胞表面a7受體表達的增加
實邀方茲
按照實施例l所述的方法獲得尼古丁處理的樹突狀細胞，並用流式細胞術 檢測該細胞在第4、 6、 8天及用LPS誘導的成熟樹突狀細胞(內毒素LPS從開始培 養起算，直接加入，10ng/mL，經過4天LPS的誘導刺激的aBTX-FITC螢光密度， 以反映樹突狀細胞表面a7受體的表達情況。
同時，分別以未用尼古丁誘導的未成熟樹突狀細胞和先以lX10-s摩爾/升尼 古丁拮抗劑銀蛇環毒素作用l小時，再以尼古丁剌激的未成熟樹突狀細胞作為 對照，比較表達a7受體的陽性細胞的百分率。
實邀錄菜
在第4天時，受體的平均螢光密度為2.03;到第6天和第8天時，該數值分別 增加到2.23和4.04;當以LPS誘導樹突狀細胞成熟時，該受體密度增加到35.13(圖1)。
培養4天的未成熟樹突狀細胞有36.87%的細胞表達該受體；以1乂10'7摩爾/ 升的尼古丁刺激12小時後，表達該受體的陽性細胞數增加到60.58%;而先以l X10-s摩爾/升尼古丁拮抗劑銀蛇環毒素作用l小時，再以尼古丁刺激時，該陽性 細胞百分率降低到52.97。/。(見圖2)。
繼
樹突狀細胞表面oc7受體的表達受尼古丁分子的調控。
實施例3.尼古丁處理對樹突狀細胞表面共剌激分子表達的促進作用
實邀誠
實驗方法同實施例l。
實麥，
樹突狀細胞表達共刺激分子CD80、 CD86、 CD40、 CDllb和CD54。未成熟 樹突狀細胞經尼古丁刺激後，其表面的上述分子分別有130%-200%表達增加。裙論尼古丁處理能促進樹突狀細胞表面共刺激分子的表達。實施例4.尼古丁促進未成熟和成熟樹突狀細胞的吞噬功能實邀旅將如上所述獲得的經GM-CSF、 IL-4誘導的未成熟和成熟樹突狀細胞以上 述的尼古丁及其拮抗劑銀蛇環毒素作用後，加入終濃度為5mg/mL的 Dextran-FITC，在37。C下的常規細胞培養條件下培養30分鐘，用PBS洗滌3次後， 以流式細胞儀檢測樹突狀細胞吞噬的Dextran的螢光密度。實凝翁菜和成熟樹突狀細胞相比，未成熟樹突狀細胞具有更強的吞噬能力。當以尼 古丁刺激後，成熟或未成熟樹突狀細胞的吞噬能力與同工型的對照相比均有明 顯增加。當以拮抗劑拮抗尼古丁的作用後，上述吞噬能力增加的趨勢得到明顯 扭轉(PO.05)(見圖4)。碧訟尼古丁能有效促進未成熟和成熟樹突狀細胞的吞噬功能。實施例5.尼古丁處理增加樹突狀細胞的抗原遞雖功能並產生效應性的CTL實凝減以尼古丁聯合抗原雞卵白蛋白(OVA)或OVA特異性的殺傷性T細胞表位肽 剌激未成熟樹突狀細胞後，將上述樹突狀細胞和T淋巴細胞按照1: IO比例混合， 以進行混合淋巴細胞反應(MLR)。 MLR在常規細胞培養條件培養5天後，以酶聯 免疫斑點分析技術檢測抗原特異性的殺傷性T細胞的數量。魏分邀本實驗中的GF257為OVA的殺傷性T細胞表位；OVA為雞卵白蛋白。 ImDC/Ni+0VA為尼古丁處理後的樹突狀細胞+OVA組；imDC/OVA為OVA 刺激的樹突狀細胞組；imDC/Ni/OVA為尼古丁聯合OVA處理組；imDC/GF257 為腫瘤抗原肽(SIINFEKL多肽)處理樹突狀細胞組；imDC/尼古丁為單純尼古丁處理樹突狀細胞組；imDC/Ni/GF257為尼古丁聯合SIINFEKL處理組； imDC/BGTX/Ni/GF257為銀環蛇毒素、尼古丁、 SIINFEKL聯合處理組。
頻茲眉
以酶聯免疫斑點實驗ELISPOT檢測增殖細胞中抗原特異性殺傷性T細胞 CTL的數量，尼古丁處理後樹突狀細胞再以雞卵白蛋白OVA刺激後，其刺激T 細胞增殖的能力得到明顯增強，並顯示尼古丁作用後樹突狀細胞可誘導更多的 抗原特異性CTL(見圖5)。當以拮抗劑拮抗尼古丁的作用後，上述能力增加的趨 勢得到明顯扭轉(P〈0.05)(見圖5)。
翁論
用尼古丁處理樹突狀細胞可極大提高該細胞的抗原遞呈功能，並由此產生 更多的效應性CTL。
實施例6.轉輸尼古丁處理後樹突狀細胞在預防腫癍的作用
實毅方法
以尼古丁刺激樹突狀細胞(同實施例l)、或以尼古丁聯合腫瘤抗原肽 (SIINFEKL)或EL4腫瘤細胞裂解物刺激樹突狀細胞，再以腹腔內注射法將5X 105個上述樹突狀細胞轉輸到小鼠體內，轉輸2天後再於小鼠頸部皮下接種2X 106個腫瘤細胞。10-14天後處死小鼠，取瘤稱重。
實膽菜
當將5乂105個尼古丁處理樹突狀細胞轉輸小鼠體內，2天後再以2乂106個同 基因背景的表達OVA的小鼠腫瘤細胞系荷瘤時，尼古丁處理後的樹突狀細胞及
尼古丁刺激聯合腫瘤抗原肽負載的樹突狀細胞可產生抗原特異性的抗腫瘤保 護作用，其抑瘤率分別達96.1°/。和98.7%(圖6)。
當以不表達特異性抗原的腫瘤細胞EL4荷瘤轉輸樹突狀細胞小鼠時，尼古 丁刺激聯合腫瘤抗原肽負載樹突狀細胞的細胞轉輸可產生40%的抑瘤率(圖7)。
茲論
尼古丁處理後樹突狀細胞可用於有效預防腫瘤。實施例7.轉輸尼古丁處理後樹突狀細胞在腫癍治療中的作用
實驗方法
於小鼠頸部皮下接種2乂106個腫瘤細胞，2天後再以腹腔內注射方式轉輸5 X1S個尼古丁處理、尼古丁聯合腫瘤抗原肽(SIINFEKL)或腫瘤細胞裂解物刺激 的樹突狀細胞，轉輸10-14天後處死小鼠，取瘤稱重。
實驗茲菜
當先以2X1(^個同基因背景的表達0VA的小鼠腫瘤細胞系荷瘤，2天後再 以5乂105個尼古丁處理後樹突狀細胞轉輸小鼠體內，尼古丁處理後的樹突狀細 胞及尼古丁刺激聯合腫瘤抗原肽負載的樹突狀細胞可產生抗原特異性的抗腫 瘤保護作用，其抑瘤率分別達53%和89.4%。
當以不表達腫瘤特異性抗原的小鼠淋巴瘤細胞系EL4荷瘤小鼠時，尼古丁 刺激聯合腫瘤溶解物負載的樹突狀細胞時，其抑瘤率達62.6%(圖8)。
潛訟
尼古丁處理後樹突狀細胞可用於有效治療腫瘤。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻 被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後， 本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申 請所附權利要求書所限定的範圍。
權利要求
1.一種製備樹突狀細胞方法，所述方法包括以下步驟(1)在摩爾濃度為1×10-9～1×10-3摩爾/升的尼古丁或其鹽存在的條件下，培養未成熟的樹突狀細胞；(2)收集處理後的樹突狀細胞。
2. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括步驟在步驟 (1)和(2)之間，使步驟(l)中所得的尼古丁處理後的細胞與腫瘤抗原接觸。
3. 如權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，所述尼古丁或其鹽的濃度為l X10'8~1X10—4摩爾/升。
4. 如權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，所述樹突狀細胞為獲自哺乳動 物的未成熟樹突狀細胞。
5. —種樹突狀細胞，其特徵在於，所述樹突狀細胞是用權利要求l-4中任一項 所述的方法製備得到的。
6. 如權利要求5所述的樹突狀細胞，其特徵在於，所述樹突狀細胞細胞表面a7 尼古丁受體表達量與未經處理的樹突狀細胞提高相比提高了 15-60%，且細胞表面 共刺激分子CD80、 CD86、 CD40、 CDllb和CD54的表達量與處理前的樹突狀細胞 相比提高了 100-300%。
7. —種藥物組合物，其包含.-i) 用權利要求l-4中任一項所述的方法製得的樹突狀細胞；和ii) 藥學上可接受的載體。
8. 如權利要求7所述的藥物組合物，其特徵在於，所述藥物組合物中所述樹突 狀細胞的量為104-108個。
9. 權利要求5所述的樹突狀細胞在製備用於預防和/或治療腫瘤的藥物中的用途。
10. —種尼古丁的用途，其特徵在於，用於製備具有腫瘤預防和/或治療功 能的樹突狀細胞或具有增強的誘導免疫應答能力的樹突狀細胞。
全文摘要
本發明提供了一種製備樹突狀細胞方法，所述方法包括(1)在摩爾濃度為1×10-9～1×10-3摩爾/升的尼古丁或其鹽存在的條件下，培養未成熟的樹突狀細胞；(2)收集處理後的樹突狀細胞。本發明的方法還可包括步驟在步驟(1)和(2)之間，使步驟(1)中所得的尼古丁處理後的細胞與腫瘤抗原接觸。本發明還提供了用該方法製備的樹突狀細胞、及其組合物、試劑盒和用途。本發明的樹突狀細胞具有增強的誘導免疫應答能力的樹突狀細胞，可用於預防和治療各種腫瘤。
文檔編號C12N5/06GK101289653SQ200710039508
公開日2008年10月22日 申請日期2007年4月16日 優先權日2007年4月16日
發明者萬大方, 顧健人, 高豐光 申請人:上海市腫瘤研究所