肝病的預診檢測的製作方法
2023-05-14 14:58:41
本發明涉及病人的預診，尤其是患有肝病的患者。更具體地，本發明涉及用於評估受試者死亡風險或肝臟相關事件風險的非侵入性的預診方法。
背景技術：
流行病學數據突顯了肝臟疾病在世界範圍內產生顯著的負擔，包括在美國和歐洲。最普通的肝病由過量的酒精攝入引起，或者由感染C型肝炎和B型肝炎病毒所引起，並且與肥胖和代謝綜合症(非酒精性脂肪肝)相關的比例逐漸提高。慢性肝病是發病和死亡的重要原因。
現有技術中，興趣主要專注於診斷這些患者。例如，申請人申請了數個用於評估肝病的存在和/或嚴重性的方法的專利申請。這些方法為診斷方法，即詳述了有關的肝臟組織活檢及診斷纖維化、顯著的纖維化或肝硬化的靶標。診斷方法中，通過與活檢比較評估生物標記與纖維化階段的關聯。
診斷方法提供了關於纖維化嚴重性的有效信息。然而，進一步需要幫助患者做出臨床監測的決定，並幫助早期識別具有肝臟相關併發症或死亡危險的患者。
該進一步需要可通過預診方法實現，即基於一組對照患者的預期壽命或基於一組對照患者經受的併發症評估生物標記相關性的方法。
現有技術中，不同的評分與肝硬化的預診相關，例如MELD評分和Child-Pugh評分。MELD評分(其中MELD代表晚期肝病模型)在於血清肝紅素與肌酸酐水平、凝血酶原時間和肝病的病因的國際標準化比率(INR)的數學組合(Kamath等，Hepatology 2001；33:464-470)。Child-Pugh評分基於總肝紅素、血清白蛋白、國際標準化比率(INR)或凝血酶原時間、腹水和肝臟性腦病的組合。
然而，MELD評分和Child-Pugh評分都僅涉及肝硬化的預診(Metavir F4階段)，並且不能幫助患有較少纖維化程度的患者的預診，例如Metavir F0、F1、F2或F3纖維化階段。
其它最近的研究使用對酒精性肝病患者的存活率預測的診斷學測試。例如，Naveau等(Hepatology 2009,49(1):97-105)描述了在多變量分析中使用Fibrotest生物標記(診斷評分)，用於產生稱為Fibrotest預診的預診評分。
此外，Vergniol等(Gastroenterology 2011；140:1970-1979)研究了肝臟硬度、FibroTest、APRI或FIB-4用於預測肝病患者中存活或與肝臟相關的死亡的效率。Vergniol等推斷肝臟硬度和FibroTest都可用於預測存活或與肝臟相關的死亡，並且他們的數學組合呈現顯著的預診準確性。然而，FibroTest、肝臟硬度和它們的組合的精確性之間沒有統計上的差異。此外，Vergniol等未描述或給出用於評估肝臟相關事件危險性的預診檢測。
對預診應用診斷性檢測可能不會產生最精確的預診。本發明旨在基於血液生物標記、臨床標記、檢測和/或物理數據的多變量數學組合，提出設計用於預診的評分及方法。與現有技術的預診檢測相比，本發明的預診檢測容許評估死亡的風險，具有提高的準確性，並且進一步容許評估與肝臟相關事件的風險。
技術實現要素：
本發明涉及用於評估受試者的死亡風險或與肝臟相關事件風險的體外非侵入性預診方法，所述方法包括：
a.從所述受試者獲得下面的變量中的至少1種，優選至少2種：
ⅰ.在所述受試者的樣品中測量的生物標記，優選地，所述生物標記選自包括以下的組中：血糖、總膽固醇、HDL膽固醇(HDL)、LDL膽固醇(LDL)、AST(天冬氨酸轉氨酶)、ALT(丙氨酸轉氨酶)、AST/ALT、AST.ALT、鐵蛋白、血小板(PLT)、AST/PLT、凝血酶原時間(PT)或凝血酶原指數(PI)、透明質酸(HA或透明質酸鹽)、血紅蛋白、甘油三酯、α-2巨球蛋白(A2M)、γ-穀氨醯轉肽酶(GGT)、尿素、肝紅素、載脂蛋白A1(ApoA1)、III型原膠原N-末端前肽(P3NP)、γ-球蛋白(GBL)、鈉(Na)、白蛋白(ALB)、鐵蛋白(Fer)、葡萄糖(Glu)、鹼性磷酸酶(ALP)、YKL-40(人類軟骨糖蛋白39)、基質金屬蛋白酶1的組織抑制劑(TIMP-1)、TGF、細胞角蛋白18和基質金屬蛋白酶2(MMP-2)至9(MMP-9)、它們的比例及數學組合；
ⅱ.臨床數據，優選選自以下的組中：體重、體質指數、年齡、性別、臀圍、腹圍或身高以及它們的數學組合；
ⅲ.二元標記，優選選自包括糖尿病、SVR、病因或NAFLD的組中；
ⅳ血液檢測結果，優選選自包括FibroMeter、CirrhoMeter、ELF評分、FibroSpect、APRI、FIB-4和Hepascore的組中，其中，所述血液檢測不是Fibrotest；
b.任選擇地，通過多變量組合獲得至少一個血液檢測結果，優選用步驟(a)中獲得的至少一個變量的二元邏輯回歸，所述血液檢測不是Fibrotest，
c.從醫學影像或臨床測量，優選根據彈性測定法，更優選根據振動控制的瞬時彈性成像(VCTE)獲得至少一個物理數據，以及
d.以多變量時間相關模型數學地組合：
—步驟(a)中獲得的所述至少一個變量和/或步驟(b)中獲得的所述至少一個血液檢測結果；以及
—步驟(c)中獲得的所述至少一個物理數據，
從而獲得預診評分。
在一個實施方式中，所述至少一個物理數據為肝臟硬度測量(LSM)，優選通過VCTE測量。
在一個實施方式中，步驟(a)中獲得的所述至少一個變量是將用於獲得血液檢測結果的變量的組，所述血液檢測結果選自包括以下的組中：FibroMeter、CirrhoMeter、ELF評分、FibroSpect、APRI、FIB-4和Hepascore，並且步驟(d)包括以多變量時間相關模型組合所述變量的組，以及/或者步驟(b)中獲得的所述至少一個血液檢測選自包括FibroMeter、CirrhoMeter、ELF評分、FibroSpect、APRI、FIB-4和Hepascore的組中。
在一個實施方式中，所述方法包括在步驟(d)中以多變量時間相關模型數學地組合下面所述的變量或至少下面所述的變量：
—凝血酶原指數、肝紅素、尿素、透明質酸、LSM、年齡和性別，或者
—年齡、性別、病因、LSM、AST和尿素，或者
—年齡、性別、NAFLD、LSM、AST和尿素，或者
—年齡、性別、LSM、AST和尿素，或者
—年齡、性別、NAFLD、凝血酶原時間、肝紅素、尿素和LSM，或者
—年齡、性別、NAFLD、凝血酶原時間、AST、尿素和LSM，或者
—年齡、性別、凝血酶原時間、肝紅素、尿素、透明質酸和LSM，或者
—年齡、性別、凝血酶原時間、肝紅素、尿素和LSM，或者
—年齡、性別、凝血酶原時間、AST、尿素和LSM，或者
—年齡、性別、病因、AST、尿素和LSM。
本發明的另一個目的是用於評估受試者與肝臟相關事件風險，尤其是併發症的體外非侵入性預診方法，所述方法包括：獲得並以多變量時間相關模型數學地組合：
a.至少一個生物標記，優選選自包括以下的組中：血糖、總膽固醇、HDL膽固醇(HDL)、LDL膽固醇(LDL)、AST(天冬氨酸轉氨酶)、ALT(丙氨酸轉氨酶)、AST/ALT、AST.ALT、鐵蛋白、血小板(PLT)、AST/PLT、凝血酶原時間(PT)或凝血酶原指數(PI)、透明質酸(HA或透明質酸鹽)、血紅蛋白、甘油三酯、α-2巨球蛋白(A2M)、γ-穀氨醯轉肽酶(GGT)、尿素、肝紅素、載脂蛋白A1(ApoA1)、III型原膠原N-末端前肽(P3NP)、γ-球蛋白(GBL)、鈉(Na)、白蛋白(ALB)、鐵蛋白(Fer)、葡萄糖(Glu)、鹼性磷酸酶(ALP)、YKL-40(人類軟骨糖蛋白39)、基質金屬蛋白酶1的組織抑制劑(TIMP-1)、TGF、細胞角蛋白18和基質金屬蛋白酶2(MMP-2)至9(MMP-9)、它們的比例及數學組合；
b.任選擇地，至少一個臨床數據，優選選自包括體重、體質指數、年齡、性別、臀圍、腹圍或身高及其數學組合的組中；
c.任選擇地，至少一個二元標記，優選選自包括糖尿病、持續病毒應答(SVR)、病因或NAFLD的組中，以及
d.任選擇地，至少一個血液檢測結果，優選選自包括FibroMeter、CirrhoMeter、ELF評分、FibroSpect、APRI、FIB-4和Hepascore的組中，
從而獲得預診評分。
在一個實施方式中，所述方法包括：以多變量時間相關模型數學地組合下面所述的變量或至少下面所述的變量：
—透明質酸、AST、SVR、血小板和GGT，或者
—透明質酸、血小板和SVR，或者
—透明質酸和SVR。
在一個實施方式中，所述方法進一步包括以多變量時間相關模型數學地組合來自醫學影像或臨床測量的至少一個物理數據，優選彈性測定法，更優選振動控制瞬時彈性成像(VCTE)，甚至更優選地所述至少一個物理數據為通過振動控制瞬時彈性成像(VCTE)測定的LSM。
在一個實施方式中，所述多變量時間相關模型為COX模型，並且/或者，其中，所述多變量COX模型為定時的或時間依賴性，優選為時間依賴性。
本發明還涉及用於評估受試者的死亡風險和/或與肝臟相關事件風險的體外非侵入性預診方法，所述方法包括：
a.從所述受試者獲得第一血液檢測結果，
b.從所述受試者獲得第二血液檢測結果，以及
c.以組合分類組合所述至少一個第一血液檢測結果和所述至少一個第二血液檢測結果，從而評估死亡風險和/或與肝臟相關事件的風險。
在一個實施方式中，所述第一血液檢測為FibroMeter，並且所述第二血液檢測結果為CirrhoMeter。
在一個實施方式中，死亡是全因死亡和/或與肝臟相關的死亡。
在一個實施方式中，所述與肝臟相關事件，尤其是併發症，選自包括以下的列表：腹水、腦病、黃疸、重度食管靜脈曲張的發生、靜脈曲張破裂出血、胃腸出血、肝臟腎綜合症、肝臟細胞癌、肝臟移植、食管靜脈曲張和門靜脈高壓。
在一個實施方式中，所述受試者患有肝病，所述肝病優選選自包括以下的列表：嚴重的波爾圖隔膜(porto-septal)纖維化、嚴重的波爾圖隔膜纖維化、小葉中心(centrolobular)纖維化、肝硬化、竇周纖維化，所述纖維化為酒精性或非酒精性來源，以及/或者所述受試者是患有慢性病的患者，優選所述慢性疾病選自包括以下的組中：慢性病毒性肝炎C、慢性病毒性肝炎B、慢性病毒性肝炎D、慢性病毒性肝炎E、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、慢性酒精性肝病、自身免疫肝炎、原發性膽汁性肝硬化、血色沉著病和威爾遜氏病(Wilson disease)的組。
在一個實施方式中，由計算機實施本發明的方法。
本發明的另一個目的為微處理器，其包括執行本發明的方法的計算機算法。
定義
在本發明中，下面的術語具有下述含義：
—「預診」是指統計預測受試者在特定的時期內發生死亡或與肝臟相關事件(或者首次肝臟相關事件)，例如在至少3個月的期間，優選3個月，6個月，9個月，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年期間的評估。因此，術語「預診」涉及評估受試者死亡或與肝臟相關事件的特定風險。
—「與肝臟相關事件」是指需要特定治療或照料的肝臟相關事件或併發症，或者涉及患者的肝病或病症的發展，包括但不限於黃疸、腹水、腦病、靜脈曲張破裂出血、肝臟細胞癌、嚴重感染(像感染性休克)、肝臟腎綜合症、肝臟肺綜合症。
—本發明上下文中的「風險」是指在特定的時期將發生死亡或肝臟相關相關的可能性，並且可意味著受試者「絕對的」風險或「相對的」風險。絕對風險可參考相關時間群組的實際觀測後測量(actual observationpost-measurement)，或參考從相關時期內遵循的統計上有效的歷史群組產生的指數值來測量。相對風險是指受試者的絕對風險與低風險群組的絕對風險或平均群體風險的比率，其可根據臨床風險因子的評定方式而變化。通常還使用比值比，其是指定測試結果的陽性事件與陰性事件的比例(比值是根據公式p/(1-p)，其中p是事件概率，而(1-p)是沒有事件的概率)。在一個實施方式中，本發明的方法可進一步包括比較從所述受試者獲得的預診評分與對照評分的步驟。
—「評分」是指通過至少一個生物標記和/或至少一個臨床數據和/或至少一個物理數據和/或至少一個二元標記和/或至少一個血液檢測結果的數學組合(單變量或多變量變量)獲得的任何數值。在一個實施方式中，評分是未綁定的數值。在另一個實施方式中，評分是通過數學函數獲得的綁定的數值。優選地，0～1的評分範圍。在一個實施方式中，評分中數學地組合的至少一個生物標記和/或至少一個臨床數據和/或至少一個物理數據和/或至少一個二元標記和/或至少一個評分是獨立的，即，給出的每條信息是不同的，並且未與他人給出的信息相聯繫。
—數字前的「約」意思是所述數值加減10％。
—「生物標記」是指可在受試者樣品中測量的變量，其中，所述樣品可為體液樣品，例如血液、血清或鳥樣，優選血液或血清樣品。
—「臨床數據」是指從受試者的外部觀察獲得的數據，不用使用實驗室檢測等。
—「二元標記」是指標記具有0或1的值(或者是或否)。
—「物理數據」是指通過物理方法獲得的變量。
—「血液檢測」相當於包括無創測量至少一個數據的檢測，並且當測量所述至少兩個數據時，數學地組合在評分內的至少兩個數據。本發明中，所述數據可為生物標記、臨床數據、物理數據、二元標記或它們的任何組合(例如，評分內的任何數學組合)。
具體實施方式
本發明涉及受試者中的體外預診方法，優選涉及非侵入體外預診方法，用於預測死亡(優選肝臟相關死亡)或肝臟相關事件，尤其是併發症。因此，還可定義本發明的方法為評估受試者中死亡風險或肝臟相關事件的風險的體外方法，尤其是併發症。本發明還涉及體外預診方法，優選涉及非侵入體外預診方法，用於確定受試者中死亡或肝臟相關事件增加的風險。通過反映識別能力的Harrell’s C指數評估本發明預診方法的預測效力。
在一個實施方式中，本發明的預診方法具有至少約0.70的Harrell’s C指數，優選至少約0.71、0.72、0.73、0.74、0.75、0.76、0.77、0.78、0.79、0.80、0.81、0.82、0.83、0.84、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99或更大。
因此，本發明涉及用於評估受試者的死亡風險和/或與肝臟相關事件風險的體外預診方法，優選地所述方法為非侵入性，所述方法包括：
a.從所述受試者獲得至少1種下面的變量：
ⅰ.在所述受試者的樣品中測量的生物標記；
ⅱ.臨床數據；
ⅲ.二元標記；
ⅳ.血液檢測結果；
b.任選擇地，通過單變量組合獲得至少一個血液檢測結果，優選用步驟(a)中獲得的至少一個變量的二元邏輯回歸，所述血液檢測不是Fibrotest，
c.從醫學影像或臨床測量，優選從彈性測定法，更優選振動控制的瞬時彈性成像(VCTE)獲得至少一個物理數據，以及
d.以多變量時間相關模型數學地組合：
—步驟(a)中獲得的所述至少一個變量和/或步驟(b)中獲得的所述至少一個血液檢測結果；以及
—步驟(c)中獲得的所述至少一個物理數據，
從而獲得預診評分。
在一個實施方式中，步驟(b)中獲得的所述血液檢測不是APRI、FIB-4或Actitest。
在一個實施方式中，步驟(a)中獲得至少2個，優選2、3、4、5、6、7、8或更多的變量。
在一個實施方式中，本發明的方法進一步包括根據步驟(d)中獲得的預診評分，評估受試者中死亡風險和/或與肝臟相關事件風險(尤其是併發症)的步驟。
在一個實施方式中，本發明的方法包括在步驟(d)中以多變量時間相關模型數學地組合步驟(a)中獲得的所述至少一個變量和步驟(c)中獲得的所述至少一個物理數據。
在另一個實施方式中，本發明的方法包括在步驟(d)中以多變量時間相關模型數學地組合步驟(b)中獲得的所述至少一個血液檢測和步驟(c)中獲得的所述至少一個物理數據。
在一個實施方式中，術語「死亡」和「死亡率」都是指總的死亡和死亡率(還可稱為全因死亡或死亡率)和/或肝臟相關死亡或死亡率。肝臟相關死亡的原因的實例包括但不限於與門靜脈高壓相關出血造成的死亡、與食管或胃靜脈曲張相關出血造成的死亡、肝臟細胞癌、腹水、腦病、肝臟衰竭合併敗血症、急性或慢性肝臟功能衰竭、肝臟腎綜合症、肝臟肺綜合症或其他肝臟代謝失調。
在一個實施方式中，術語「肝臟相關事件，尤其是併發症」是指需要特定治療或照顧的與肝臟相關的事件後併發症，例如，諸如腹水、腦病、黃疸(可定義為血清肝紅素>50μmol/l)、發生大的食管靜脈曲張(優選具有≥5mm的直徑，並且/或者優選直徑≥25％的食管周長)、靜脈曲張破裂出血、胃腸出血(例如，諸如由於門靜脈高壓)、肝臟腎綜合症、肝臟肺綜合症、肝臟細胞癌、肝臟移植、食管靜脈曲張、門靜脈高壓大於或等於預定的閾值(例如，諸如肝臟靜脈壓力梯度大於或等於10mm Hg或大於等於12mm Hg)、嚴重感染(例如，諸如感染性休克)。
在一個實施方式中，術語「肝臟相關事件，尤其是併發症」是指肝臟疾病或病症在受試者中的發展，例如，諸如纖維化非硬化患者表現肝硬化，或者，對於患者，與預定閾值交叉的(例如，諸如FibroMeter結果大於或等於0.982，或者Fibroscan結果大於或等於14kPa)的事實。
根據本發明，死亡(包括全因死亡或與肝臟相關的死亡)不是指肝臟相關事件，尤其是併發症。
在一個實施方式中，本發明的方法用於預測患者中第一個肝臟相關事件，尤其是併發症。
在本發明的一個實施方式中，本發明的預診方法用於評估截至評估日期在至少3個月的期間內，優選3個月、6個月、9個月，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年，死亡的風險或肝臟相關事件的風險。
在一個實施方式中，受試者是哺乳動物，優選人類。在一個實施方式中，受試者是雄性或雌性。在一個實施方式中，受試者是成年人或兒童。
在一個實施方式中，受試者被感染，優選被診斷出肝臟疾病或病症，因此可定義本發明的方法為預測肝臟疾病或病症的方法。
優選地，受試者為患者，即，受試者正等待接受，或正接受醫療護理，或者是/將是醫療過程的對象。
在一個實施方式中，受試者患有肝臟疾病或病症，優選選自包括以下的列表：嚴重的波爾圖隔膜纖維化、嚴重的波爾圖隔膜纖維化、小葉中心纖維化、肝硬化、竇周(persinusoidal)纖維化，所述纖維化為酒精性來源或非酒精性來源。
在一個實施方式中，所述受試者患有慢性病，優選地，所述慢性病選自包括以下的組中：慢性病毒性肝炎C、慢性病毒性肝炎B、慢性病毒性肝炎D、慢性病毒性肝炎E、非酒精性脂肪肝(NAFLD)、慢性酒精性肝病、自身免疫性肝炎、原發性膽汁性肝硬化、血色沉著病和威爾遜氏病。
生物標記的實例包括但不限於血糖、總膽固醇、HDL膽固醇(HDL)、LDL膽固醇(LDL)、AST(天冬氨酸轉氨酶)、ALT(丙氨酸轉氨酶)、AST/ALT(比例)、AST.ALT(產物)、鐵蛋白、血小板(PLT)、AST/PLT(比例)、凝血酶原時間(PT)或凝血酶原指數(PI)、透明質酸(HA或透明質酸鹽)、血紅蛋白、甘油三酯、α-2巨球蛋白(A2M)、γ-穀氨醯轉肽酶(GGT)、尿素、肝紅素、載脂蛋白A1(ApoA1)、III型原膠原N-末端前肽(P3NP或P3P)、γ-球蛋白(GBL)、鈉(Na)、白蛋白(ALB)、鐵蛋白(Fer)、葡萄糖(Glu)、鹼性磷酸酶(ALP)、YKL-40(人類軟骨糖蛋白39)、基質金屬蛋白酶1的組織抑制劑(TIMP-1)、TGF、細胞角蛋白18和基質金屬蛋白酶2(MMP-2)至9(MMP-9)、觸珠蛋白、它們的比例及數學組合。
臨床數據的實例包括但不限於重量、體質指數、年齡、性別、臀圍、腰圍或身高，以及它們的數學組合，例如，諸如它們的比，例如臀圍/腰圍。
二元非侵入檢測標記的實例包括但不限於糖尿病、SVR(其中，SVR代表持續的病毒應答，並定義為在完成慢性肝炎C病毒(HCV)感染的抗病毒治療後病毒血症6周、優選12周、更優選24周)、病因和NAFLD。關於二元標記「病因」，技術人員已知所述變量為單個二元標記或多個二元標記，並且對於肝臟疾病，病因可為NAFLD、酒精、病毒或其他。因此，二元標記可以表述為NAFLD相對於其它(單個二元標記)，或者NAFLD相對於參考病因，以及病毒相對於參考病因等(多個二元標記)。
在一個實施方式中，本發明的血液檢測相當於選自包括以下的群組的血液檢測：ELF、FibroSpectTM、APRI、FIB-4、Hepascore、FibrotestTM、FibroMeterTM、CirrhoMeterTM、CombiMeter、Elasto-FibroMeterTM、InflaMeterTM、Elasto-Fibrotest。由於這些血液檢測為診斷性檢測，所以它們基於多變量數學組合，例如，諸如二元邏輯回歸。
ELF為基於透明質酸、P3P、TIMP-1和年齡的血液檢測。
FibroSpectTM為基於透明質酸、TIMP-1和A2M的血液檢測。
APRI為基於血小板和AST的血液檢測。
FIB-4為基於血小板、AST、ALT和年齡的血液檢測。
HEPASCORE為基於透明質酸、肝紅素、α2-巨球蛋白、GGT、年齡和性別的血液檢測。
FIBROTESTTM為基於α2-巨球蛋白、觸珠蛋白、載脂蛋白A1、總肝紅素、GGT、年齡和性別的血液檢測。
ELASTO-FIBROTEST為用LSM測量，例如通過FibroscanTM測量的，基於FIBROTEST或FIBROTEST結果的變量的數學組合的檢測。
FIBROMETERTM和CIRRHOMETERTM共同形成了一組血液檢測，其內容依賴於慢性肝病的病因以及診斷目標(例如，諸如纖維化，顯著的纖維化(中度的橋接纖維化)、嚴重的纖維化(大量的橋接纖維化)或肝硬化)。這個血液檢測組稱為FM家族，並在下表中詳述。
FM：FibroMeter,CM：CirrhoMeter,
A2M：α-2巨球蛋白，HA：透明質酸，PI：凝血酶原指數，PLT：血小板，Fer：鐵蛋白，Glu：葡萄糖
aHA可被GGT取代
COMBIMETERTM或Elasto-FibroMeterTM是基於FM家族變量或FM家族的檢測結果與FIBROSCANTM結果的數學組合(如上文中的表格詳述)的一組檢測。在一個實施方式中，所述數學組合是二元邏輯回歸。
在一個實施方式中，CombiMeterTM或Elasto-FibroMeterTM產生基於來自肝臟或脾彈性測定中的物理數據的數學組合的評分，物理數據例如來自FibroscanTM的分散指數，例如IQR或IQR/中值或中值，優選具有選自包括以下的列表的至少3種，優選至少4、5、6、7或更多種，更優選7或8或9種生物標記和/或臨床證據的FibroscanTM中值：血糖、總膽固醇、HDL膽固醇(HDL)、LDL膽固醇(LDL)、AST(天冬氨酸轉氨酶)、ALT(丙氨酸氨基轉移酶)、AST/ALT、AST.ALT、鐵蛋白、血小板(PLT)、AST/PLT、凝血酶原時間(PT)或凝血酶原指數(PI)、透明質酸(HA或透明質酸鹽)、血紅蛋白、甘油三酯、α-2巨球蛋白(A2M)、γ-穀氨醯轉肽酶(GGT)、尿素、肝紅素、載脂蛋白A1(ApoA1)、III型原膠原N-末端前肽(P3NP)、γ球蛋白(GBL)、鈉(Na)、白蛋白(ALB)、鐵蛋白(Fer)、葡萄糖(Glu)、鹼性磷酸酶(ALP)、YKL-40(人類軟骨糖蛋白39)、基質金屬蛋白酶1的組織抑制劑(TIMP-1)、TGF、細胞角蛋白18和基質金屬蛋白酶2(MMP-2)至9(MMP-9)、觸珠蛋白、糖尿病、體重、體質指數、年齡、性別、臀圍、腹圍或身高，以及它們的比例及數學組合。
INFLAMETERTM是反映包括ALT、A2M、PI和血小板的壞死炎症活性的伴隨檢測。
在一個實施方式中，本發明的方法不包括在步驟(a)中獲得FibrostestTM。
在一個實施方式中，本發明的方法不包括在步驟(a)和/或步驟(b)中獲得ActitestTM。ACTITESTTM是基於α2-巨球蛋白、觸珠蛋白、載脂蛋白A1、總肝紅素、GGT、ALT、年齡和性別的血液檢測。
在一個實施方式中，本發明的方法不包括在步驟(a)和/或步驟(b)中獲得APRI。
在一個實施方式中，本發明的方法不包括在步驟(a)和/或步驟(b)中獲得FIB-4。
在一個實施方式中，本發明的方法不包括或包含以多變量域數學地組合FibrostestTM結果和物理數據，例如由VCTE(例如，Fibroscan)測量的肝臟硬度測量(LSM)。
在一個實施方式中，本發明的方法包括在步驟(a)中獲得並在步驟(d)中以多變量時間相關模型中數學組合物理數據與如上文所定義的血液檢測的變量。
在一個實施方式中，本發明的方法包括在步驟(a)中獲得並在步驟(d)中以多變量時間相關模型中數學組合物理數據與ELF，即透明質酸、P3P、TIMP-1和年齡的變量。
在一個實施方式中，本發明的方法包括在步驟(a)中獲得並在步驟(d)中以多變量時間相關模型中數學組合物理數據與FibroSpectTM，即透明質酸、P3P、TIMP-1和A2M的變量。
在一個實施方式中，本發明的方法包括在步驟(a)中獲得並在步驟(d)中以多變量時間相關模型中數學組合物理數據與APRI，即血小板和AST的變量。在一個實施方式中，本發明的方法不包括或包含在步驟(a)中獲得並在步驟(d)中以多變量時間相關模型中數學組合物理數據與APRI，即血小板和AST的變量。
在一個實施方式中，本發明的方法包括在步驟(a)中獲得並在步驟(d)中以多變量時間相關模型中數學組合物理數據與FIB-4，即血小板、ASAT、ALT和AST的變量。在一個實施方式中，本發明的方法不包括或包含在步驟(a)中獲得並在步驟(d)中以多變量時間相關模型中數學組合物理數據與FIB-4，即血小板、ASAT、ALT和年齡的變量。
在一個實施方式中，本發明的方法包括在步驟(a)中獲得並在步驟(d)中以多變量時間相關模型中數學組合物理數據與HEPASCORE，即透明質酸、肝紅素、α2-巨球蛋白、GGT、年齡和性別的變量。
在一個實施方式中，本發明的方法包括在步驟(a)中獲得並在步驟(d)中以多變量時間相關模型中數學組合物理數據與FIBROTESTTM，即α2-巨球蛋白、觸珠蛋白、載脂蛋白A1、總肝紅素、GGT、年齡和性別的變量。在一個實施方式中，本發明的方法不包括或包含在步驟(a)中獲得並在步驟(d)中以多變量時間相關模型中數學組合物理數據與FIBROTESTTM，即α2-巨球蛋白、觸珠蛋白、載脂蛋白A1、總肝紅素、GGT、年齡和性別的變量。
在一個實施方式中，本發明的方法包括在步驟(a)中獲得並在步驟(d)中以多變量時間相關模型中數學組合物理數據與ACTITESTTM，即α2-巨球蛋白、觸珠蛋白、載脂蛋白A1、總肝紅素、GGT、ALT、年齡和性別的變量。在一個實施方式中，本發明的方法不包括或包含在步驟(a)中獲得並在步驟(d)中以多變量時間相關模型中數學組合物理數據與ACTITESTTM，即α2-巨球蛋白、觸珠蛋白、載脂蛋白A1、總肝紅素、GGT、ALT、年齡和性別的變量。
在一個實施方式中，本發明的方法包括在步驟(a)中獲得並在步驟(d)中以多變量時間相關模型中數學組合物理數據與上面表中列出的FIBROMETERTM和/或CIRRHOMETERTM的變量。
在一個實施方式中，本發明的方法包括在步驟(a)中獲得並在步驟(d)中以多變量時間相關模型中數學組合物理數據與上面提供的COMBIMETERTM或Elasto-FibroMeterTM的變量。
在一個實施方式中，本發明的方法包括在步驟(a)中獲得並在步驟(d)中以多變量時間相關模型中數學組合物理數據與上面提供的Elasto-Fibrotestas的變量。
在一個實施方式中，本發明的方法包括在步驟(a)中獲得並在步驟(d)中以多變量時間相關模型中數學組合物理數據與INFLAMETERTM，即ALT、A2M、PI和血小板的變量。
物理方法的實例包括但不限於醫學成像數據和臨床測量，例如，脾的測量，特別是脾長度。根據實施方式，物理方法選自包括超聲波檢查，特別是都卜勒超聲波檢查和彈性超聲波檢查，以及速度測量超聲波檢查(使用所述數據的優選檢測是振動控制的瞬時彈性成像(VCTE，也稱為FibroscanTM)、ARFI、VTE、超音速彈性測量(超音速成像)、MRI(磁共振成像)和MNR(核磁共振)，特別是MNR彈性測定法或速度測量法。
在一個實施方式中，物理方法是VCTE、ARFI、VTE、超音速彈性法或MRI硬度。
優選地，數據是彈性測量數據，優選肝臟硬度評價(LSE)數據或脾硬度評價，其可以例如由VCTE獲得。根據本發明的優選實施方式，物理數據為肝臟硬度測量(LSM)，優選地由VCTE測量。
在特定實施方式中，物理數據是通過VCTE(也稱為FibroscanTM，法國巴黎)的肝臟硬度測量(LSM)，優選地用M探針進行。優選地，檢查條件是製造商推薦的條件，目的是獲得至少3次，優選10次有效測量。結果可以表示為所有有效測量的中值(千帕)，或者表示為IQR或表示為比率(IQR/中值)。
在本發明的一個實施方式中，本發明的方法包括執行VCTE，其涉及獲得至少3個並且優選地10個有效測量，以及恢復對應於所有有效測量的千帕斯卡中值的物理數據。
在一個實施方式中，本發明的方法包括在步驟(d)中以多變量時間相關模型數學組合凝血酶原指數、肝紅素、尿素、透明質酸、LSM、年齡和性別。
在一個實施方式中，本發明的方法包括在步驟(d)中以多變量時間相關模型數學組合年齡、性別、病因、LSM、AST和尿素。
在一個實施方式中，本發明的方法包括在步驟(d)中以多變量時間相關模型數學組合年齡、性別、NAFLD、LSM、AST和尿素。
在一個實施方式中，本發明的方法包括在步驟(d)中以多變量時間相關模型數學組合年齡、性別、LSM、AST和尿素。
在一個實施方式中，本發明的方法包括在步驟(d)中以多變量時間相關模型數學組合年齡、性別、NAFLD、凝血酶原時間、肝紅素、尿素和LSM。
在一個實施方式中，本發明的方法包括在步驟(d)中以多變量時間相關模型數學組合年齡、性別、NAFLD、凝血酶原時間、AST、尿素和LSM。
在一個實施方式中，本發明的方法包括在步驟(d)中以多變量時間相關模型數學組合年齡、性別、凝血酶原時間、肝紅素、尿素、透明質酸和LSM。
在一個實施方式中，本發明的方法包括在步驟(d)中以多變量時間相關模型數學組合年齡、性別、凝血酶原時間、肝紅素、尿素和LSM。
在一個實施方式中，本發明的方法包括在步驟(d)中以多變量時間相關模型數學組合年齡、性別、凝血酶原時間、AST、尿素和LSM。
在一個實施方式中，本發明的方法包括在步驟(d)中以多變量時間相關模型數學組合年齡、性別、病因、AST、尿素和LSM。
本發明的另一個目的是用於評估受試者中肝臟相關事件，特別是併發症的風險的體外非侵入性預診方法，包括獲得並以多變量時間相關模型數學組合：
a.至少一個生物標記；
b.任選擇地，至少一個臨床數據；
c.任選擇地，至少一個二元標記，以及
d.任選擇地，至少一個血液檢測結果，
從而獲得預診評分，
其中，生物標記、臨床數據、二元標記和血液檢測結果如上述。
在一個實施方式中，本發明的方法還包括根據預診評分的值評估受試者中肝臟相關事件，特別是併發症的風險的步驟。
在一個實施方式中，本發明的方法還包括獲得並以多變量時間相關模型數學組合物理數據與上面定義的血液檢測變量。
在一個實施方式中，本發明的方法還包括獲得並以多變量時間相關模型數學組合ELF，即透明質酸、P3P、TIMP-1和年齡的變量。
在一個實施方式中，本發明的方法還包括獲得並以多變量時間相關模型數學組合FibroSpectTM，即透明質酸、TIMP-1和A2M的變量。
在一個實施方式中，本發明的方法還包括獲得並以多變量時間相關模型數學組合APRI，即血小板和AST的變量。
在一個實施方式中，本發明的方法還包括獲得並以多變量時間相關模型數學組合FIB-4，即血小板、ASAT、ALT和年齡的變量。
在一個實施方式中，本發明的方法還包括獲得並以多變量時間相關模型數學組合HEPASCORE，即透明質酸、肝紅素、α2-巨球蛋白、GGT、年齡和性別的變量。
在一個實施方式中，本發明的方法還包括獲得並以多變量時間相關模型數學組合FIBROTESTTM，即α2-巨球蛋白、觸珠蛋白、載脂蛋白A1、總肝紅素、GGT、年齡和性別的變量。
在一個實施方式中，本發明的方法還包括獲得並以多變量時間相關模型數學組合如上面表中列出的FIBROTESTTM和/或CIRRHOMETERTM的變量。
在一個實施方式中，本發明的方法還包括獲得並以多變量時間相關模型數學組合如上面表中列出的COMBIMETERTM和/或Elasto-FibroMeterTM的變量。
在一個實施方式中，本發明的方法還包括獲得並以多變量時間相關模型數學組合INFLAMETERTM，即ALT、A2M、PI和血小板的變量。
在本發明的一個實施方式中，所述方法還包括獲得並以多變量時間相關模型數學組合透明質酸、AST、SVR、血小板和GGT。
在本發明的一個實施方式中，所述方法還包括獲得並以多變量時間相關模型數學組合透明質酸、血小板和SVR。
在本發明的一個實施方式中，所述方法還包括獲得並以多變量時間相關模型數學組合透明質酸和SVR。
在本發明的一個實施方式中，所述用於評估受試者中肝臟相關事件，特別是併發症的風險的體外非侵入性預診方法進一步包括：
—獲得至少一個物理數據，以及
—以多變量時間相關模型數學組合所述至少一個物理數據以及所述至少一個生物標記，以及任選擇地所述至少一個臨床數據、所述至少一個二元標記以及所述至少一個血液檢測結果，從而獲得預診評分，
其中，所述物理數據如上所述。
在一個實施方式中，本發明的方法進一步包括根據預診評分值評估受試者中肝臟相關事件，特別是併發症的風險的步驟。
在一個實施方式中，通過彈性測定法，更優選通過振動控制的瞬時彈性成像(VCTE)獲得所述物理數據，甚至更優選地，所述至少一種物理數據為通過振動控制的瞬時彈性成像(VCTE)測量的LSM。
在本發明的一個實施方式中，所述方法包括獲得並以多變量時間相關模型數學組合透明質酸、AST、SVR、血小板、GGT和LSM。
在本發明的一個實施方式中，所述方法包括獲得並以多變量時間相關模型數學組合透明質酸、血小板、SVR和LSM。
在本發明的一個實施方式中，方法包括獲得並以多變量時間相關模型數學組合透明質酸、SVR和LSM。
在一個實施方式中，多變量時間相關模型為COX比例風險回歸模型。
在一個實施方式中，本發明的預診評分基於時間固定的Cox模型，即本發明的方法僅包括選自生物標記、臨床數據，二元標記和血液測試和/或物理數據的變量的一個測量，其通常在基線時間被記錄。
在另一個實施方式中，本發明的預診評分基於時間依賴的Cox模型，即本發明的方法包括選自以下變量的至少兩個連續的測量：在包括基線時間的各個時間記錄的生物標記、臨床數據、二元標記和血液測試和/或物理數據。
在一個實施方式中，本發明的預診方法進一步包括比較受試者獲得的預診評分與參考預診評分的步驟。
根據本發明，預診評分表明死亡或肝臟相關事件的風險。
在一個實施方式中，本發明的預診方法還包括比較受試者獲得的預診評分與參考預診評分。
在一個實施方式中，受試者獲得的預診評分與參考評分之間的差異或者無差異表明死亡或肝臟相關事件的風險增加。
在一個實施方式中，參考分數可以是指數分數，或可源自一個或多個風險預測算法或計算的死亡或肝臟相關事件的預診指數。參考分數可與源自人群研究的數字或值相關，包括但不限於，具有相似纖維化水平的受試者，相同或相似年齡範圍的受試者，相同或相似族群的受試者。
在本發明的一個實施方式中，參考分數來源於基本上健康的一個或多個受試者(即參考群體)，即不受肝臟疾病或病症影響的受試者。在本發明的另一個實施方式中，參考分數源自受肝臟疾病或病症影響的一個或多個受試者(即參考群體)。
在本發明的一個實施方式中，與參考評分無異的從受試者獲得的預診評分表示死亡或肝臟相關事件的風險。優選地，在該實施方式中，參考分數源自基本上健康的受試者
在本發明的另一個實施方式中，從受試者獲得的與參考評分無異的預診評分表示死亡或肝臟相關事件的風險。優選地，在該實施方式中，參考評分來自肝臟疾病患者，更優選來自患有不良預診的肝病患者。
在一個實施方式中，如果第一個值比第二個值大或小約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多，則第一個值被認為不同於第二個值。
在一個實施方式中，在用於獲得參考分數的參考群體中測量的預診分數以百分位數分類，其中由參考群體的所有受試者獲得的預診評分根據它們的數值按升序排列。在本發明的一個實施方式中，百分位數是受試者的百分位數，即每個百分位數包含相同數目的受試者。因此，第一個百分位數對應於具有最低預診評分的受試者，而最後一個百分位數對應於具有最高預診評分的受試者。
在一個實施方式中，參考分數對應於參考群體的第一百分位數的最高預診分數。
在另一個實施方式中，參考評分對應於參考群體的第二、第三...或倒數第二百分位數的最高預診評分。
在一個實施方式中，給出3個百分位數時，每個百分位數被稱為三分位數。根據該實施方式，參考值對應於第一、第二三分位的最高預診評分。
在另一個實施方式中，給出4個百分位數時，每個百分位數被稱為四分位數。根據該實施方式，參考值對應於第一、第二、第三或第四五分位的最高預診評分。
當繪製四個百分位數時，每個百分位數被命名為四分位數。根據該實施例，參考值對應於第一、第二或第三四分位數的最高預診分數。
在另一個實施方式中，給出5個百分位數時，每個百分位數被稱為五分位數。根據該實施方式，參考值對應於第一、第二、第三或第四五分位的最高預診評分。
在本發明的一個實施方式中，本發明的預診方法因此導致在分類的類別中對受試者進行分類，其中分類的每個類別對應於特定的死亡風險或肝臟相關事件。這樣的分類，其中特定預診評分對應於特定評估的風險，也是本發明的目的。
例如，本發明的預診方法導致在包括5個類別的分類中對受試者進行分類，每個類別對應於五分位數：第一類(或五分位數)對應於5年內死亡或肝臟相關事件風險為0，第二類(或五分位數)對應於死亡或肝臟相關事件的風險高於0％且小於或等於25％，第三類(或五分位數)對應於死亡或的肝臟相關事件大於25％且小於或等於50％，第四類(或五分位數)對應於高於50％且小於或等於75％的死亡或肝臟相關事件的風險，並且第五即最後一類(或五分位數)對應於大於75％的死亡或肝臟相關事件的風險。
本發明還涉及用於評估受試者的死亡風險和/或與肝臟相關事件風險的體外非侵入性預診方法，所述方法包括：
a.獲得至少1種選自生物標記、臨床數據、二元標記和血液檢測結果的變量，以單變量模型組合它們，從而從所述受試者獲得第一血液檢測結果，
b.獲得至少1種選自生物標記、臨床數據、二元標記和血液檢測結果的變量，以單變量模型組合它們，從而從所述受試者獲得第二血液檢測結果，
c.以組合的分類組合所述至少一個第一血液檢測結果和所述至少一個第二血液檢測結果，從而評估死亡風險和/或肝臟相關事件風險。
在本發明的一個實施方式中，第一血液檢測是FibroMeter，而第二血液檢測結果為CirrhoMeter。
在本發明的一個實施方式中，本發明的預診方法因此導致在組合分類(其也可以被稱為評分風險圖表)的類別中對主體的分類，其中所述組合分類是表的形式，其中每個單元格與特定評估的死亡風險或肝臟相關事件相關。這樣的得分風險圖表也是本發明的目的。
在一個實施方式中，評分風險圖為2維矩陣表，其中，每個維度相應於血液檢測和/或物理方法。
其分類是使用對參考群體的參考而預先構建的。例如，進行Fibroscan可以導致受試者在3個纖維化階段(F0-F1、F2-F3或F4)之一中分類。因此，得分風險圖(線)的第一維對應於第一血液檢測或物理方法的階段，而第二維(列)對應於第二血液檢測或物理方法的階段。
在一個實施方式中，評分風險圖包括對應於例如臨床數據的附加維度，例如年齡和性別。
圖13中示出了本發明的4維評分風險圖表的實例，其由Fibroscan(LSM)、FibroMeter、年齡和性別的組合產生，其中風險圖的每種情況對應於3年前全因死亡風險的百分比。
本發明的一個實施方式中，由計算機實施本發明的方法。
因此，本發明還涉及微處理器，包括執行本發明的預診方法的計算機算法。
技術人員易於推斷本發明的預診評分指示的死亡或肝臟相關事件的特定風險，其可以由願意為他/她的患者提供最佳醫療護理的醫生使用。例如，存在高死亡或肝臟相關事件風險的患者比低風險患者需要更頻繁的隨訪。
因此，本發明還涉及調節患者的治療、醫療護理或隨訪的方法，其中，所述方法包括測量所述患者根據本發明的預診評分。
本發明還涉及患者的治療的監測方法，其中，所述方法包括測量所述患者根據本發明的預診評分。
本發明還涉及治療肝病患者的方法，優選慢性肝病患者，所述方法包括(i)測定所述患者根據本發明的預診評分，以及(ii)根據步驟(i)中測量的預診評分治療所述患者。
此外，本發明的預診評分可用於決定患者肝臟移植的優先順序。
附圖說明
圖1是顯示每個非侵入性肝臟纖維化檢測的時間依賴性AUROC(t)(A，C)和靈敏度(B，D)的組合圖，用於預測1565名患者中的全因死亡率(A，B)和肝臟相關死亡率(C，D)，所述患者具有在3個月的間隔內的非侵入性肝臟纖維化檢測的可用數據。
圖2是顯示每個非侵入性肝臟纖維化檢測的時間依賴性AUROC(t)和MELD評分的圖的組合，用於預測在基線時為肝硬化的444名患者中的總死亡率(A)和肝臟相關死亡率(B)，按LSM≥14kPa分類。
圖3是根據慢性肝病的病因：(A～B)酒精性肝病，(C～D)慢性病毒性肝炎和(E～F)非酒精性脂肪肝，顯示每個非侵入性肝臟纖維化檢測的時間依賴性AUROC(t)的組合圖，用於預測總死亡率(A(643名患者，181名死亡)，C(478名患者，35名死亡)和E(313名患者)，39例死亡)和肝臟相關死亡率(B(642名患者，85例死亡)，D(474名患者，19例死亡)和F(311名患者，10例死亡)。
圖4是顯示在驗證組(n＝782)中以時間固定多變量模型的校準能力的評估的組合圖，包括年齡、性別、LSM和FibroMeterv2G的基線結果。根據全因死亡(A)和肝臟相關死亡(B)的風險評分，將患者的觀察到的(實線)和估計的(虛線)存活率分為5組。對於肝臟相關死亡率，由於事件數量少，組合前三個五分位數。第一上部曲線對應於第一個五分之一等。
圖5是顯示在驗證組(782名患者，1342個存活數據點)中以時間依賴性多變量模型的校準能力的評估的組合圖，包括年齡、性別、LSM和FibroMeterv2G的時變結果。根據全因死亡(A)和肝臟相關死亡(B)的風險評分，將患者的觀察到的(實線)和估計的(虛線)存活率分為5組。對於肝臟相關死亡率，由於事件數量少，組合前三個五分位數。
圖6是顯示在隨訪期間首例顯著的肝臟相關事件(A)和無肝臟相關死亡(B)的存活的累積發生率的組合圖。
圖7是顯示作為Metavir纖維化(F)分期(A)或Fibrotest(B)、FibroMeterV2G(C)、CirrhoMeterV2G(D)分類類別的函數的首例顯著的肝臟相關事件的累積發生率的組合圖。Metavir F0至F3分期(p＝0.174)之間無顯著差異，因此肝臟活檢僅鑑定出具有不同預診的2個亞組：F0-3相對於F4(p<0.001)。診斷纖維化分類在臨床實踐中用於估計來自FibroMeterV2G或CirrhoMeterV2G結果的Metavir纖維化分期，其也是預診量表(scale)：與Fibrotest不同，FibroMeterV2G或CirrhoMeterV2G類型的增加與預診逐漸惡化相關。第一上曲線對應於到更高的纖維化分期等。
圖8是顯示首例顯著的肝臟相關事件(A)和無肝臟相關死亡的存活(B)的累積發生率的組合圖，其作為由FIB4的2個推薦診斷截止值定義的3個亞組的函數(3.25)。第一條上曲線對應於較高的纖維化分期等。
圖9是顯示FibroMeter2GV(專用於嚴重的纖維化診斷)和CirrhoMeter2GV(用於肝硬化診斷)及其相應纖維化分類的散點圖。這2個血液檢測與CirrhoMeterV2G「拉伸」的高FibroMeterV2G值互補。可以區分兩個不同的組：FM1-4類顯示比CirrhoMeterV2G值更大的FibroMeterV2G值的範圍，並且在FM5-7類中觀察到相反情況。
圖10是顯示作為FM/CM分類的函數的首例顯著的肝臟相關事件(A)和無肝臟相關死亡的存活(B)的累積發生率的組合圖。FM/CM分類鑑定了5個具有顯著不同預診的患者亞組。A：第一條上曲線對應於較高的纖維化分期等。B：第一條較低的曲線對應於較高的纖維化分期等。
圖11是顯示作為Metavir纖維化(F)分期(A)或Fibrotest(B)、FibroMeter(C)、CirrhoMeter(D)分類類別的函數的無肝臟相關死亡的存活的組合圖。第一條較低的曲線對應於較高的纖維化分期等。
圖12是顯示評價來自FibroMeterV2G和CirrhoMeterV2G診斷分類結果的肝臟相關預診的圖。在輕度疾病(即，包括在3個第一類的FibroMeterV2G分類)患者中，FibroMeterV2G分類用於鑑定2個預診亞組。在晚期疾病患者(即，包括在FibroMeterV2G分類的最後4個類別中)，CirrhoMeterV2G分類鑑定3個額外的預診亞組。肝臟相關事件的發生率作為這些定義預診FM/CM分類的5個預診亞組的函數而逐漸增加。
圖13是3年前全因死亡(1個生存)的風險圖的組合。LSM：F0-F1<7kPa，F2-F3 7-13.9kPa，F4≥14kPa-FibroMeterV2G：F0-F1<0.3754，F2-F30.3754～0.8342，F4≥0.8343—A-B：男性全因死亡的風險圖(A：年齡小於55，B：55歲或以上的年齡)，C-D：女性全因死亡風險圖(C：年齡小於55，D：年齡為55歲以上)。
實施例
通過下面的實施例進一步描述本發明。
實施例1：定時多變量預診方法和時間依賴的多變量預診方法
患者和方法
研究人群
我們計入2005年1月至 2009年12月在昂熱大學醫院的肝臟科因為慢性肝病諮詢或住院且同意參與SNIFF群體(Score Non Invasif de Fibrose du Foie)的年齡大於18歲的受試者。無論患者慢性肝病的嚴重性或病因，在群體(cohort)中包括他們(HVC、HVB、酗酒、非酒精性脂肪肝、其他原因)。隨訪他們直至死亡或直到2011年1月1日。
肝臟纖維化的非侵入性評估
所有的患者在進入群體或隨後的每次訪問中通過血液檢測或肝臟硬度測量或兩者對肝臟纖維化進行非侵入性評估。
肝臟纖維化的血液檢測–在我們醫院的實驗室中集中血液分析樣品。測量生物參數(α-2巨球蛋白、血小板計數、天冬氨酸轉氨酶、丙氨酸轉氨酶、γ-穀氨醯胺轉肽酶、肝紅素、透明質酸、凝血酶原指數、尿素)允許計算至少一個下面用於肝臟纖維化的血液檢測：APRI(Wai等，Hepatology 2003；38:518-26)、FIB-4(Sterling等，Hepatology 2006；43:1317-25)、Hepascore(Adams等，ClinChem 2005；51:1867-73)、FibroMeterV2G(Leroy等，ClinBiochem 2008；41:1368-76)。在肝硬化患者中還計算特別設計的MELD評分，以預測肝病晚期的患者中的短期死亡率(Kamath等，Hepatology 2001；33(2):464-70)。
肝臟硬度測量–用M探針進行通過超聲診斷儀的肝硬化測量(LSM)(Echosens，法國巴黎)。檢測條件是製造商建議的那些，目標為獲得至少10個有效的測量。結果表示為全部有效測量的中位數(kilopascals)，並且根據肝硬化水平：「非常可靠」(IQR/M≤0.10)，「可靠」(0.100.30，具有M0.30，具有M>7.1kPa)通過使用四分間距至中值的比(IQR/M)分為「非常可信」、「可信」和「不可靠」。
端點評估
用於這些分析的感興趣的端點為全因死亡率和與肝臟相關的死亡率。接下來記錄死亡的日期和首要原因，並在2011年5月登記計算的國家死亡註冊。從醫院資料庫獲得通過該方式不能找到的那些患者的數據，並通過來自普通醫生的信息確認。根據國際疾病分類(ICD-10)第10版編碼死亡的原因，並匯集成類。
統計方法
使用SAS版本9.2(SAS Institute Inc.，美國北卡羅萊納州卡裡)以及R版本 3.0.2(奧地利維也納，可從http://www.R-project.org/獲得)進行統計分析。所有的檢測是雙向的，並認為p75％)的組中可獲得每個肝臟纖維化血液檢測。
表1.患者的特徵
定量變量的結果表示為中位數(第一四分位數，第三四分位數)。LSM＝肝臟硬度測量，NAFLD＝非酒精性脂肪肝。
(a)費希爾精確檢驗(類別變量)或曼-懷-威三氏檢驗(定量變量)的p值。
在2011年1月1日，整個群體的平均隨訪持續時間為3.3年[四分位距(IQR)1.9～4.6]。在隨訪期間，588個患者(17.5％)死亡，258例死亡(7.7％)與肝臟相關。在1年、3年和5年的總生存率(無全因死亡)的Kaplan-Meie估計分別為91.6％、83.0％和75.5％。1年、3年和5年肝臟相關生存率(無肝臟相關死亡)分別為95.7％、92.5％和86.6％。
根據法國國家死亡登記處的數據，死亡的其他原因主要是與肝臟和肝臟內膽管無關的腫瘤(ICD-10C00-D48，C22除外，n＝104)，循環系統疾病(ICD-10I00-99，n＝79)，發病和死亡的外部原因(ICD-10V01-Y98，n＝36)，內分泌營養和代謝疾病(ICD-10E00-E90，n＝17)，除了肝臟外的消化系統疾病(ICD-10K00-K93，K70-K77除外，n＝16)。12例患者死亡原因未知。
與死亡率的單變量關係
與在隨訪結束時活著的患者相比，死亡的患者具有完全不同的基線特徵(表2)：如在基線的所有非侵入性肝臟纖維化檢測所反映，他們更老，並且更頻繁地為男性，他們兩次患上酒精性肝病，並在基線有更嚴重的疾病。根據每個肝臟纖維化檢測值在基線的四分位數，Kaplan-Meier估計總生存率和肝臟相關生存率都顯著不同(從數秩比較<0.0001的所有p值)。
表2.整個群體在隨訪結束時根據生命體徵的基線特徵的比較。
定量變量的結果表示為中位數(第一四分位數，第三四分位數)。LSM＝肝臟硬度測量。
(a)全因死亡。
(b)費希爾精確檢驗(類別變量)或曼-懷-威三氏檢驗(定量變量)的p值。
(c)通過最近提出的可靠性標準分類：「非常可靠」(IQR/中值≤0.10)以及「可靠」(0.100.30，具有LSE中值<7.1kPa)。
比較纖維化檢測預測死亡率的能力
在具有3個月間隔內所有檢測的可用數據的包括的患者的子樣本中進行非侵入性肝臟纖維化檢測的預測能力的統計比較。這些1,565名患者的社會人口特徵和慢性肝病的原因與群中的其他患者相比沒有差異(表1)。但是具有所有檢測的患者更近地被包含在族群中，因此具有稍短的隨訪持續時間：中值隨訪是2.8年[第一四分位數和第三四分位數：1.7～3.9]。他們還具有比未選擇的患者更高的基線肝臟硬度中值，但是相反地，它們對於大多數肝臟纖維化血液測試具有更小的基線值。
對於全因死亡率和肝臟相關死率，通過Harrell’s C指數評估的APRI的總體預測能力比其它非侵入性肝臟纖維化檢測低的多(表3)。
表3.非侵入性肝臟纖維化檢測對死亡風險預測的總區分能力
通過自舉法評估95％CI和C指數的差異。LSM＝肝臟硬度測量，LSM-r＝LSM結果分類為對於診斷目的非常可靠/可靠。
(a)顯著小於LSM(p<0.0001)、FIB-4(p<0.0001)、Hepascore(p<0.0001)、FibroMeter V2G(p<0.0001)。
(b)顯著大於LSM(p<0.040)、APRI(p<0.0001)、FIB-4(p<0.0001)、Hepascore(p＝0.0086)那些。
(c)顯著小於LSM(p<0.0001)、FIB-4(p<0.0001)、Hepascore(p<0.0001)、FibroMeterV2G(p<0.0001)。
(d)顯著小於FibroMeterV2G(p<0.0001)和LSM非常可靠/可靠的結果(p0.70，對於肝臟相關死亡率，AUC(t)從0.80至0.90。例如，為了預測所有原因的3年死亡，AUC(t＝3)為：對於FibroMeterV2G為0.80(95％CI＝[0.76～0.83])，對於Hepascore為0.77[0.74～0.81](p<0.001相對於FibroMeterV2G)，對於LSM(p<0.028)為0.76[0.73～0.80]，對於FIB4為0.76[0.72～0.79](p<0.001)，並且對於APRI為p＝0.67[0.62～0.71][p0.70，t從0變化到接近5年)。總之，FibroMeterV2G和其他肝臟纖維化的C指數的所有配對比較導致p0.80)，而對於全因死亡，AUC(t)隨時間的變化更大。特別地，檢測的基線測量的預診值隨著NALFD患者的預測延遲的增加而略微減小。
僅基於基線肝臟纖維化檢測的多變量預診模型
將具有在基線的所有檢測的1,565位患者的子樣本隨機分為訓練集和驗證集後進行多變量分析。這兩個患者亞組的主要特徵列於表4。
表4.隨機選擇的訓練集和驗證集之間的患者特徵的比較
通過在訓練集中的多變量分析，我們觀察到每個血液纖維化檢測和LSM是獨立的預診因素(數據未顯示)。年齡和性別在所有多變量Cox模型中也是顯著的，但不是慢性肝病的原因，也不是LSM結果的四分位距。根據Akaike信息標準(AIC)，最佳多變量Cox模型是包括年齡、性別、LSM和FibroMeterV2G的模型，用於預測全因死亡率或肝病死亡率。沒有發現獨立預測因子之間的相互作用。表5中給出了使AIC減小的多變量模型的係數的細節。
表5.最佳多變量Cox模型減小了AIC，以基於時間固定方法(A)和時間依賴方法(B)預測死亡率。
圖4A描述了驗證集患者(來自驗證集)的預診模型(來自訓練集)預測的總體存活曲線，其根據他們的風險評分分為5組(五分位數)。我們觀察到預測的和觀察到的總生存率之間的良好擬合：從五分位數1到五分位數5，3年時的預測總存活率為98.6％、94.3％、90.6％、80.5％和46.7％，而觀察到的總存活率為99.0％、97.6％、93.0％、78.0％和50.9％。此外，組合LSM和FibroMeterV2G的預診模型具有改善的辨別能力：驗證集中的預診模型的Harrell's C指數[95％CI]為0.834[0.805～0.863]，相比之下，對於FibroMeterV2G僅0.791[0.756～0.826](p<0.0001)，並且對於LSM為0.775[0.736～0.811](p＝0.0013)。預診多變量模型在ALD中具有比FibroMeterV2G和LSM更好的性能，並且在慢性病毒性肝炎中比FibroMeterV2G更有效，但不比LSM更有效(表6，未顯示關於配對比較的詳細內容)。
表6.通過Harrell的C指數[95％CI]評估多變量預診模型(包括年齡、性別、LSM和FibroMeterV2G)在驗證集(n＝782)中的辨別能力。
通過自舉法評估Harrell的95％CI。LSM＝肝臟硬度測量，NAFLD＝非酒精性脂肪肝。
觀察到的和預測的存活(校準)之間的一致性不太令人滿意(圖4B)：在最高風險的五分之一患者中低估了超過1年的肝臟相關存活的概率，而高估了具有稍低風險的患者的存活率(從第四個五分位數)。此外，與使用單一非侵入性肝臟纖維化檢測相比，通過將預診模型應用於驗證集，沒有提高精確度：與僅使用FibroMeterV2G(p＝0.27)的0.857[0.815～0.895]和使用LSM(p＝0.43)的0.848[0.785～0.896]相比，預診模型的Harrell's C指數[95％CI]為0.867[0.828～0.902]。
定義肝臟纖維化檢測的多變量預診模型為時變協變量
進行非侵入性檢測1至8次，從包括在族群中到隨訪結束前一年。測量之間的中值間隔長度為1.1年[第一四分位數和第三四分位數：0.6～1.7]。在將時間依賴性預診模型應用於驗證集之後，我們觀察到預測的肝臟相關生存和觀察到的肝臟相關生存之間的更好匹配(圖5)。對於全因死亡率和肝臟相關死亡率，更新協變量的預診模型也基於年齡、性別、LSM和FibroMeterV2G。這些時間依賴性多變量Cox模型的Harrell's C指數和95％CI在驗證集中，對於預測全因死亡為0.837[0.808～0.865]，並且對於預測肝臟相關死亡為0.879[0.840～0.914](表6)。在ALD患者中，對於預測肝臟相關死亡，C指數增加到0.832[0.774～0.881]。
然後我們基於年齡、性別、LSM和凝血酶原指數、肝紅素、尿素、透明質酸，通過肝臟纖維化診斷檢測和本發明的預診模型的辨別能力比較總體預診性能。在族群中包含的1565名具有所有非侵入性肝臟纖維化檢測的患者中，通過Harrell指數[95％CI]評估預診性能。結果示於表7中。
表7：肝臟纖維化診斷檢測和本發明的預診模型的Harrell’s C指數
通過自舉法評估C指數的95％CI和差異。LSM＝肝臟硬度測量，NAFLD＝非酒精性脂肪肝，LSM-r＝LSM結果對於診斷目的分為非常可靠/可靠。
(a)顯著小於FibroMeterV2G(p<0.007)、EFMV2G(p<0.002)、EFMV3G(p<0.008)
(b)顯著小於FibroMeterV2G(p<0.040)
(c)顯著大於所有肝臟纖維化診斷試驗(p<0.001)
(d)顯著小於EFMV2G(p<0.030)
(e)顯著大於CirrhoMeterV2G(p<0.012)、FibroMeterV3G(p<0.001)、CirrhoMeterV3G(p30g/d的酒精，或者女性消耗>20g/d的酒精、血色病、自身免疫性肝炎)或者肝硬化併發症(腹水、靜脈曲張破裂出血、系統感染、肝臟細胞癌)。遵守目前赫爾辛基宣言倫理指南的研究方案，並且經IRB批准後，全部患者獲得知情權。
隨後的數據收集
隨訪開始於肝臟活檢那一天，並結束於2011年1月1日。根據當前的EASL和AASLD指南，患者被隨訪並接受抗病毒治療。在隨訪期間記錄的數據包括：完成SVR、首次顯著的肝臟相關事件的日期，以及死亡的日期和原因。定義SVR為在抗病毒治療結束後6個月陰性C型肝炎病毒RNA。所考慮的顯著的肝臟相關事件(SLRE)是需要特殊治療或護理的那些：腹水、腦病、黃疸(血清肝紅素>50μmol/l)、重度食管靜脈曲張的發生(直徑≥5mm)、靜脈曲張破裂出血、靜脈曲張破裂出血、肝臟腎綜合症和肝臟細胞癌。認為重度食管靜脈曲張是顯著的肝臟相關的事件，因為它們的發生顯著影響治療和預診。隨訪數據記錄在患者檔案中；對於失去醫院隨訪的病例，向患者或其全科醫生要求隨訪數據。通過諮詢國家死亡登記處獲得所有患者的死亡日期和原因。移植的患者在肝臟移植的日期被檢查為死亡。最後，在本研究中評價2個臨床結果：SLRE作為主要終點(在第一次事件發生之日審查患者)以及肝臟相關死亡作為次要終點。
組織學評估
根據Metavir纖維化(F)分期評價肝臟纖維化。由兩名資深肝病學專家獨立完成初步病理檢查，對不一致病例進行共識解讀。病理學家不知道患者的特徵和血液標記結果。
血液檢測
在肝臟活檢日期的約7天內對87.4％的病例中進行血液收集，而對其他病例中在之後不超過3個月內進行血液收集。所有血液檢測在Angers醫院的實驗室中進行。
血液纖維化檢測–根據公開的或獲得專利的公式計算以下血液纖維化檢測：APRI(Wai等，Hepatology 2003；38：518-26)，FIB4(Sterling等，Hepatology 2006；43：1317-25)，Hepascore(Adams等，ClinChem2005；51：1867-73)，Fibrotest(Biopredictive，法國巴黎)(Castera等，Gastroenterology 2005；128：343-50)，FibroMeterV2G(用於病毒的第二代，法國巴黎)(Leroy等，ClinBiochem 2008；41：1368-76)。我們還計算了CirrhoMeterV2G(Echosens，法國巴黎)，其與FibroMeterV2G共享相同的標記，但是具有針對診斷肝硬化的特異性係數(Boursier等，Eur J GastroenterolHepatol 2009；21：28-38)。在臨床實踐中，使用它們的纖維化階段分類來解釋一些血液纖維化檢測的結果，纖維化階段分類根據檢測結果估計Metavir F分期。Fibroest分類包括8個類別(此處稱為FT1至FT8)，FibroMeterV2G包括7個類別(FM1至FM7)，以及CirrhoMeterV2G包括6個類別(CM1至CM6)。
統計分析
使用Kaplan-Meier方法測定存活曲線，並與對數秩檢驗比較。通過Harrell的C指數評價用於預測臨床結果的辨別能力。Harrell的C指數是AUROC對事件發生時間(time-to-evetn)(存活)數據的延伸，並且評估預測的事件風險與觀察到的生存時間之間的一致性。其結果從0變化到1：1表示完美的一致性(風險評分的鑑別力)，0.5表示隨機預測，並且小於0.5的值表示與預期相反方向的鑑別。對於所評估的每個檢測，通過自舉法計算Harrell C指數的95％置信區間，使用與原始數據集相同大小的1,000個隨機樣本(具有替換)。使用自舉重採樣程序進行C指數的配對比較。為了比較2個檢測，我們計算了在從原始數據集中替換的1,000個隨機選擇樣本中的每一個的C指數之間的差異。然後，獲得差值的自舉95％置信區間，並且我們使用來自該自舉分布的標準誤差的估計來計算C指數之間的標準化差異，並且找到相應的p值。大多數統計分析由專業統計學家(SB)使用SPSS版本18.0軟體(IBM，美國紐約阿蒙克)和SAS 9.1(SAS Institute Inc.，美國北卡羅來納州卡瑞)進行。
結果
患者
表8詳述了包括的373個患者的主要基線特徵。
表8：包括的患者的特徵
定量變量的結果表示為中位數，括號內為第一四分位數和第三四分位數)，並且分類變量表示為絕對數，括號內為百分數。SVR：持續的病毒應答。
a沒有或不成功的抗病毒治療
b僅考慮在隨訪期間的首例顯著的肝臟相關事件
包括的平均肝臟活檢長度為20mm(第一四分位數：15mm，第三四分位數：25mm)。47個患者(12.6％)在隨訪期間經歷至少一次SLRE。首例SLRE為：重度靜脈曲張(n＝20)、肝臟細胞癌(n＝13)、腹水(n＝4)、黃疸(n＝4)、肝臟性腦病(n＝1)、靜脈曲張破裂出血(n＝1)、腹水以及黃疸(n＝2)、腹水以及黃疸和腦病(n＝2)。SLRE的平均隨訪是7.6年(四分位數範圍：4.0～12.1；2972人—年)。平均隨訪時的首次SLRE的累積發生率為11.5％(圖6a)。
50例患者在隨訪期間死亡；2例死亡原因未知，肝臟相關17例。另有6例肝臟移植患者。因此，認為23例患者的死亡與肝臟相關。由於死亡發生在首次SLRE後，所以死亡的平均隨訪時間長於SLRE：9.5年(四分位數範圍：5.8～13.0；3508人—年)。平均隨訪時無肝臟相關死亡的存活率和總體存活率分別為：95.1％(圖6b)和88.8％。
37.2％的患者在隨訪期間達到SVR，並且62.8％的患者沒有抗病毒治療或沒有成功地抗病毒治療。在獲得SVR的患者的隨訪期間沒有肝臟相關死亡，其中只有5例患有SLRE。這5個患者中的3個(2個具有Metavir F4和1個具有F3)在達到SVR之前發展出嚴重的食管靜脈曲張。一個患者(包含的Metavir F2)在代謝綜合症的情況下達到SVR 5年後具有嚴重的食管靜脈曲張，因此歸因於持續活動性非酒精性脂肪肝。在隨訪期間恢復過量飲酒的情況下，最後一個患者(包含的Metavir F3)在達到SVR之前具有黃疸和腹水。
預測首次SLRE
肝臟活檢相對於血液檢測
圖7a示出了作為Metavir F分期的函數的首次SLRE的累積發生率。F4和F3分期之間的差異高度顯著(p0.340用於其它比較。
b比較Metavir F相對於血液檢測：p＝0.011相對於FIB4，p＝0.078相對於FibroMeterV2G，p>0.190用於其它比較。
表10：用於預測首例顯著的肝臟相關事件和肝臟相關死亡的血液纖維化檢測和肝臟活檢(Metavir F)的Harrell C指數的配對比較
顯著性差異為粗體
簡言之，Metavir F和6種血纖維化檢測對於預測首次SLRE具有良好的的辨別能力(C指數>0.8)。6例血纖維化檢測中的5例具有大於肝臟活檢的C指數；這種增加對於FIB4(p＝0.002)、FibroMeter(p＝0.005)和APRI(p＝0.039)是顯著的。
為了相對於肝臟活檢評估每個肝臟纖維化檢測，我們進行了根據年齡、性別、HCV基因型(1相對於其他)和SVR而調節的連續多變量逐步前演Cox模型，包括Metavir F的每個血液檢測，用於預測首次SLRE(表 11)。
表11：相對於Metavir F分期，評價血液纖維化檢測用於預測肝臟相關結果。以根據年齡、性別、持續的病毒反應和HCV基因型調節的多變量逐步正演Cox模型用Metavir F分期引入每個評分(1相對於其他)。
每個血液纖維化檢測為SLRE的獨立預測因子(在第一步，除了Hepascore)。當在多變量分析中引入FibroMeter或CirrhoMeter時，不選擇Metavir F作為SLRE的獨立預測因子。這顯示了FibroMeter或CirrhoMeter完全獲得了獨立預測，不需要任何顯著的肝臟活檢的另外預測。
總之，先前所有的結果顯示了血液纖維化檢測是預測因子，在用於在CHC患者中預測SRLE時至少如同Metavir F分期一樣準確，並且對於一些，明顯優於Metavir F分期。
纖維化分類
由於我們的結果顯示了作為預診標記的血液纖維化檢測，所以他們應該個別化(individualize)不同預診的患者亞組。這些亞組的魯邦的後驗確定將需要具有高事件率的大群組(>1000個患者)，隨後是外部驗證。因此，我們選擇評估血液檢測纖維化分類的預診意義。這有兩個相關原因。首先，纖維化分類允許患者的先驗分層。其次，已經開發了纖維化分類來估計纖維化分期，並且這個原始設計將驗證其識別有風險的患者的能力。
圖7b至7d顯示作為Fibrotest、FibroMeter或CirrhoMeter纖維化分類的函數的首次SLRE的累積發生率。與Fibrotest不同，FibroMeter或CirrhoMeter類的增加與預診的逐漸惡化相關。此外，包括在FM1或CM1類(每個16.7％的患者)中的患者具有良好的預診，在隨訪期間沒有SLRE。FIB4提供了用於預測首次SLRE的最高的Harrell C指數，但詳細的纖維化分類不適用於該血液檢測。因此，我們評估由其推薦的1.45和3.25這2個診斷截斷值定義的3個亞組的預診。有趣的是，這3個亞組具有顯著不同的預診(p<0.001，圖8)。然而，包括在具有推定的最佳預診(即FIB4<1.45)的亞組中的11名患者(4.6％)在隨訪期間經歷了SLRE。
在臨床實踐中如何預測SLRE？
我們已經在橫斷面研究中顯示，通過二元邏輯回歸的纖維化檢測的組合改善了肝臟纖維化的非侵入性診斷(Boursier等，Am J Gastroenterol2011；106：1255-63)。我們在本縱向研究中使用相同的設計來確定用於預測首次SLRE的血液纖維化檢測的最互補的組合。
在多變量正演Cox模型中，包括6個血液纖維化檢測：年齡、性別、SVR和HCV基因型(1相對於其他)，首次SLRE的獨立預測因子為CirrhoMeter(p<0.001)、FibroMeter(p＝0.008)和SVR(p＝0.010)。這個結果並不令人驚訝，因為FibroMeter和CirrhoMeter(第一個用於顯著的纖維化，後者用於肝硬化)明顯與CirrhoMeter「拉伸」的高FibroMeter值互補(圖9)。在多變量分析中，FibroMeter和CirrhoMeter之間的相互作用是顯著的(p＝0.002)。此外，FM4和FM5類別之間的界線清楚地區分了兩組：FM1-4類顯示比CirrhoMeter值更大的FibroMeter值範圍，在FM5-7類中觀察到相反的情況(圖9)。因此，我們在FM1-4和FM5-7組中分別重複多變量分析。包括SVR、FibroMeter和CirrhoMeter的多變量後演Cox模型顯示了作為FM1-4組中首次SLRE的獨立預測因素的FibroMeter(p＝0.024)和SVR(p＝0.040)。相比之下，CirrhoMeter(p<0.001)是FM5-7組中唯一的獨立預測因子。這些結果表明FibroMeter在CHC的早期階段更好地預測首次SLRE，而CirrhoMeter更好地預測晚期疾病患者。
這些結果導致我們評估包括在FM1-4類中的患者的FibroMeter分類與包括在FM5-7類中的患者的CirrhoMeter分類的組合。這種組合提供了10個中間類別(FM1-4和CM1-6，如果FM5-7)。由於顯著不同的預診(FM1；FM2/3，FM≥4+CM≤4，FM≥4+CM5，FM≥4+CM6)定義了新的FM/CM分類，所以將這10個中間類分成5個最終類。包括在FM/CM分類的5個類別中的患者的比率分別為第1至第5：16.7％、41.5％、27.2％、10.0％和4.6％。
FM/CM分類與肝臟活組織檢查
如同Metavir F分期，FM/CM分類將患者分為5類，但是帶來了幾個優點。首先，在隨訪期間，FM/CM分類的相鄰類別的首次SLRE的累積發生率之間顯著不同(圖10a)，而Metavir F0與F3階段之間沒有顯著差異(圖7a)。第二，在包含在第一類FM/CM分類中的患者的隨訪期間沒有發生SLRE，而根據基線肝臟活檢的1個F0患者在隨訪期間患上黃疸。第三，包括在最高類別的FM/CM分類中的患者具有比肝臟活檢所定義的肝硬化患者(圖10a)明顯更差的預診(圖7a)。最後，在包括Metavir F、FibroMeter、CirrhoMeter和FM/CM分類的多變量逐步正演Cox模型中，在多變量分析的第一步選擇FM/CM分類作為SLRE的獨立預測因子。
肝臟相關死亡
Metavir F4和F3階段的無肝臟相關死亡的存活率之間有顯著的差別(p<0.001)，但在F0至F3階段之間沒有顯著差異(p＝0.456，圖11a)。所有血液纖維化檢測具有比肝臟活檢更高的C指數(表9)；這種增加對於FIB4是顯著的(p＝0.011，表10)。多變量逐步正演Cox模型連續地包括使用Metavir F分期的每個血液檢測(表11)，顯示CirrhoMeter是唯一的對Metavir F沒有獨立作用的血液纖維化檢測。
FibroMeter或CirrhoMeter分類增加的類型與隨訪期間肝臟相關死亡的逐漸增加相關(圖11)，並且最高級別的CirrhoMeter分類鑑定了非常高風險患者的亞組。對於第一個SLRE，FIB4提供了用於預測肝臟相關死亡的最高的Harrell C指數，並且使用推薦的診斷截止值，FIB4鑑定了具有顯著不同預診的3個亞組(圖8b)。包含在具有推定的最佳預診(即FIB4<1.45)的亞組中的3名患者(1.3％)在隨訪期間因肝臟相關原因死亡。
臨床實踐中評估與肝臟相關的死亡
在多變量正演Cox模型中，包括6個血液纖維化檢測：年齡、性別和HCV基因型(在這個模型中未引入SVR，因為在SVR患者中沒有死亡)，CirrhoMeter是肝臟相關死亡的唯一獨立預測因子(p<0.001)。在GVL類中包括的患者中沒有發生肝臟相關死亡(圖11d)。然而，CM1到CM5的相鄰類別的無肝臟相關死亡的存活率之間沒有顯著差異；它僅在CM5和CM6類之間顯著不同。
相比之下，第2和第3類之間以及在FM/CM分類的第4和第5類之間的無肝臟相關死亡的存活率顯著不同(圖10b)。最後，在包括MetavirF、FibroMeter、CirrhoMeter和FM/CM分類的多變量逐步正演Cox模型中，FM/CM分類是肝臟相關死亡的唯一獨立預測因子。
臨床實踐中評估肝臟預診
總之，通過兩個補充檢測的組合來最好地評估CHC中的肝臟預診：在輕度疾病患者中的FibroMeter(針對纖維化)以及在晚期疾病患者中的CirrhoMeter(針對肝硬化)。兩個檢測提供了組合的FM/CM分類，其是首次SLRE以及肝臟相關死亡的最佳獨立預測因子。圖12中給出了作為FM/CM分類的函數的5年和10年SLRE或肝臟相關死亡的發生率(詳見表12)。
表12：作為FM/CM分類的函數的首例顯著的肝臟相關事件(SLRE)或肝臟相關死亡的累積發生率(％)。
a沒有抗病毒治療或者不成功的抗病毒治療
b該情況下沒有患者
我們的結果表明血液纖維化檢測至少全面地如Metavir F分期一樣準確地預測CHC患者的肝臟預診。事實上，對於預測SLRE或肝臟相關死亡，血液纖維化檢測都不具有顯著低於肝臟活檢的Harrell C指數。在包括用Metavir F分期的每個血液檢測的多變量分析中，幾乎所有血液纖維化檢測是SLRE或肝臟相關死亡的獨立預測因子，表明血液纖維化檢測提供相關的預診信息。此外，FibroMeter和CirrhoMeter是SLRE的獨立預測因子，Metavir F對其無作用，如同CirrhoMeter對於肝臟相關死亡那樣。
在評估的6個血液纖維化檢測中，多變量分析將FibroMeter和CirrhoMeter鑑定為用於預測首次SLRE的最佳組合。這兩個檢測，前者特異性靶向顯著的纖維化，後者特異性靶向肝硬化(Boursier等，Eur J Gastroenterol Hepatol 2009；21：28-38)是非常互補的(圖9)，並且它們的關聯改善了首次SLRE的預測：FibroMeter在低纖維化水平更具預測性，而CirrhoMeter在高纖維化水平更具預測性，因為它如雙速變速器那樣擴大了檢測尺度。最後，類似於肝硬化患者中的Child-Pugh評分或肝臟靜脈壓力梯度測量，CirrhoMeter可使高FibroMeter值分層，以改善對預診顯著不同的亞組的識別。在臨床實踐中，FibroMeter和CirrhoMeter包括相同的標記，但具有不同的係數，因此可被同時計算，無需額外的成本。因為它需要非常大的人群來魯棒地確定後驗預診亞組，所以我們決定根據當前在臨床實踐中使用的先驗性纖維化分類或診斷截斷(cut-off)來對患者進行分層(stratify)。在該設置中，與Metavir F分期相比，FM/CM分類中的FibroMeter和CirrhoMeter纖維化分類的組合具有幾個優點。首先，儘管Metavir F分期僅鑑定了兩組具有不同預診的患者(FO-3相對於F4)，但是FM/CM分類鑑定了5個顯著不同的組(圖10a)。第二，與Metavir F分期相反，在FM/CM分類的較低類別中沒有發生SLRE，因此定義了具有優異預診的亞組。第三，最高類別的FM/CM鑑定了未被Metavir F分期鑑定的非常高風險患者的亞組。
FIB4是一種便宜且易於計算的血液纖維化檢測，在我們的研究中顯示出非常好的預診準確性。可能是因為它被FibroMeter和CirrhoMeter的高互補作用掩蓋了該端點，所以它不被多變量分析選作首次SLRE的獨立預測因子。通過使用其2個推薦的診斷截斷值，FIB4鑑定了其預診顯著不同的3個亞組的患者。然而，來自最佳預診亞組的11名患者在隨訪期間經歷SLRE，而相比之下，包括在第一類FibroMeter或CirrhoMeter分類中的患者不患有SLRE。這可能是由於對FIB4閾值的不當選擇。實際上，在包括在FIB4的3個第一十分位數中的患者的隨訪期間沒有發生SLRE。這表明FIB4也能夠確定具有良好預診的患者亞組，並且為此目的應該改進(refined)FIB4閾值。
總之，血液纖維化檢測還是預診檢測，至少在患有CHC的患者的肝臟預診的預測中如肝臟組織活檢同樣精確。兩個互補血液檢測的組合，一個針對纖維化(FibroMeter)，並且另一個針對肝硬化(CirrhoMeter)，比肝臟組織活檢更準確，並且看來是用於臨床實踐預診基準評估的簡單和精確的方法。