一種鹽酸納洛酮的藥物組合物及其醫藥用途的製作方法

2023-05-12 06:56:51 2

本發明屬於生物醫藥領域，涉及鹽酸納洛酮的新用途，具體涉及鹽酸納洛酮的藥物組合物及其在宮頸癌中的應用。
背景技術：
：鹽酸納洛酮為純粹的阿片受體拮抗藥，本身無內在活性。但能競爭性拮抗各類阿片受體，對μ受體有很強的親和力。納洛酮生效迅速，拮抗作用強。納洛酮同時逆轉阿片激動劑所有作用，包括鎮痛。另外其還具有與拮抗阿片受體不相關的回蘇作用。可迅速逆轉阿片鎮痛藥引起的呼吸抑制，可引起高度興奮，使心血管功能亢進。本品尚有抗休克作用。不產生嗎啡樣的依賴性、戒斷症狀和呼吸抑制。迄今為止，尚未見鹽酸納洛酮及其藥物組合物與宮頸癌的相關性報導。技術實現要素：本發明的目的在於提供一種鹽酸納洛酮的藥物組合物，該藥物組合物中含有鹽酸納洛酮和一種天然產物，鹽酸納洛酮和該天然產物可以協同治療宮頸癌。本發明的上述目的是通過下面的技術方案得以實現的：一種具有下述結構式的化合物(Ⅰ)，一種鹽酸納洛酮的藥物組合物，包括鹽酸納洛酮、化合物(Ⅰ)和藥學上可以接受的載體，製備成需要的劑型；化合物(Ⅰ)具有如下結構式：進一步地，藥學上可以接受的載體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、溼潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體或潤滑劑。進一步地，所述劑型包括片劑、膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、衝劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。上述化合物(Ⅰ)的製備方法，包含以下操作步驟：(a)將水飛薊粉碎，用70～80％乙醇熱回流提取，合併提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步驟(a)中正丁醇萃取物用大孔樹脂除雜，先用15％乙醇洗脫6個柱體積，再用70％乙醇洗脫10個柱體積，收集70％洗脫液，減壓濃縮得70％乙醇洗脫濃縮物；(c)步驟(b)中70％乙醇洗脫濃縮物用正相矽膠分離，依次用體積比為80:1、30:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分；(d)步驟(c)中組分3用正相矽膠進一步分離，依次用體積比為25:1、15:1和2:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；(e)步驟(d)中組分2用十八烷基矽烷鍵合的反相矽膠分離，用體積百分濃度為72％的甲醇水溶液等度洗脫，收集8～14個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(Ⅰ)。進一步地，化合物(Ⅰ)的製備方法中，所述大孔樹脂為D101型大孔吸附樹脂。上述化合物(Ⅰ)在製備治療宮頸癌的藥物中的應用。上述鹽酸納洛酮的藥物組合物在製備治療宮頸癌的藥物中的應用。本發明的優點：本發明提供的鹽酸納洛酮的藥物組合物中含有鹽酸納洛酮和一種結構新穎的天然產物，鹽酸納洛酮和該天然產物單獨作用時，對宮頸癌具有治療作用；二者聯合作用時，對宮頸癌的治療效果進一步提高，可以開發成治療宮頸癌的藥物。本發明與現有技術相比具有突出的實質性特點和顯著的進步。具體實施方式下面結合實施例進一步說明本發明的實質性內容，但並不以此限定本發明保護範圍。儘管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和範圍。實施例1：化合物(Ⅰ)分離製備及結構確證試劑來源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購自上海凌峰化學試劑有限公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學試劑有限公司。分離方法：(a)將水飛薊(2kg)粉碎，用75％乙醇熱回流提取(20L×3次)，合併提取液，濃縮至無醇味(4L)，依次用石油醚(4L×3次)、乙酸乙酯(4L×3次)和水飽和的正丁醇(4L×3次)萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步驟(a)中正丁醇萃取物用D101型大孔樹脂除雜，先用15％乙醇洗脫6個柱體積，再用70％乙醇洗脫10個柱體積，收集70％洗脫液，減壓濃縮得70％乙醇洗脫濃縮物；(c)步驟(b)中70％乙醇洗脫濃縮物用正相矽膠分離，依次用體積比為80:1(8個柱體積)、30:1(8個柱體積)、15:1(8個柱體積)和5:1(10個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分；(d)步驟(c)中組分3用正相矽膠進一步分離，依次用體積比為25:1(8個柱體積)、15:1(10個柱體積)和2:1(5個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；(e)步驟(d)中組分2用十八烷基矽烷鍵合的反相矽膠分離，用體積百分濃度為72％的甲醇水溶液等度洗脫，收集8～14個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物(Ⅰ)(純度大於98％)。結構確證：HR-ESI-MS顯示[M+H]+為m/z399.1942，結合核磁特徵可得分子式為C20H30O8，不飽和度為6。核磁共振氫譜數據δH(ppm，CDCl3，500MHz)：H-1a(1.86，m)，H-1b(1.15，m)，H-2(2.24，m)，H-5(4.67，s)，H-7(3.42，s)，H-8(1.31，s)，H-10(2.04，m)，H-11(1.47，m)，H-12(3.45，s)，H-14(3.65，s)，H-16a(5.21，s)，H-16a(5.10，s)，H-17(2.01，s)，H-18(0.97，d，J＝5.9Hz)，H-19(1.01，d，J＝7.1Hz)，H-20(1.32，s)；核磁共振碳譜數據δC(ppm，CDCl3，125MHz)：31.2(CH2，1-C)，37.1(CH，2-C)，214.3(C，3-C)，101.5(C，4-C)，72.8(CH，5-C)，96.1(C，6-C)，67.4(CH，7-C)，40.1(CH，8-C)，72.4(C，9-C)，48.5(CH，10-C)，38.1(CH，11-C)，68.7(CH，12-C)，89.5(C，13-C)，60.2(CH，14-C)，143.5(C，15-C)，115.1(CH2，16-C)，18.1(CH3，17-C)，12.2(CH3，18-C)，16.4(CH3，19-C)，19.2(CH3，20-C)。紅外光譜表明該化合物含有羥基(3436cm-1)。氫譜顯示四個甲基信號[δH2.01(3H，s，Me-17)，0.97(3H，d，J＝5.9Hz，Me-18)，1.01(3H，d，J＝7.1Hz，Me-19)和1.32(3H，s，Me-20)]，一組末端雙鍵信號[δH5.21(1H，s，H-16a)和5.10(1H，s，H-16b)]，五個連氧次甲基質子信號[δH4.67(1H，s，H-5)，3.42(1H，s，H-7)，3.45(1H，s，H-12)和3.65(1H，s，H-14)]。該化合物的碳譜顯示該化合物有20個碳信號，包括四個甲基，兩個亞甲基(一個烯烴碳)，八個次甲基(四個連氧碳)，以及六個季碳(一個酮羰基碳，一個烯烴碳以及四個連氧季碳)。通過核磁數據以及高分辨質譜數據，可以推測該化合物為一個典型的瑞香烷型化合物。通過HMBC譜的解析可以發現，H-2/C-3，H-19/C-3，H-5/C-4，H-5/C-6，H-8/C-7以及H-20/C-7的相關性可以證明該化合物中C-4，C-5，C-6和C-7均為連氧碳，同時C-3為一個羰基碳信號。另外，H-18/C-12，H-12/C-14，H-12/C-13的相關性說明C-12，C-13以及C-14均為連氧碳。最後，通過H-17/C-16以及H-16/C-13之間的相關說明在C-15和C-16之間存在一個末端雙鍵。至此，解析出該化合物中6個不飽和度中的5個，通過和trigochininsA的核磁數據進行比較發現，該化合物的C-4和C-6位的碳譜數據均發生很大的位移，故而該化合物中存在一個C-4和C-6之間的四元環。ROESY譜中H-1b/H-8，H-8/H-7，H-8/H-11，H-8/H-14以及H-11/H-12的相關信號表明這些質子都是位於β位的。同時，H-5/H-10，H-5/H-20，H-10/H-2，H-10/H-18的相關性顯示這些質子都是位於α位的。此外，H-17/H-14以及H-16/H-12之間強烈的相關說明該化合物中13-OH位於α位的。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和ROESY譜，以及文獻關於相關類型核磁數據，可基本確定該化合物如下所示，立體構型進一步通過ECD試驗確定，理論值與實驗值基本一致。該化合物化學式及碳原子編號如下：實施例2：藥理作用本實施例使用人宮頸癌Hela細胞懸液製備宮頸癌大鼠模型，檢測三組大鼠宮頸癌組織中Survivin、Caspase-3和Caspase-7表達水平。觀察藥物下調宮頸癌大鼠凋亡抑制因子Survivin水平，改善凋亡因子Caspase-3和Caspase-7的表達等方面的抗宮頸癌作用。1、材料與方法1.1動物6周齡雌性Wistar大鼠，平均體重(153±14)g，購於中國科學院上海動物中心。1.2試劑與樣品鹽酸納洛酮購自中國藥品生物製品檢定所。化合物(Ⅰ)自製，製備方法見實施例1。人宮頸癌Hela細胞株購於中國醫學科學院基礎研究所；兔抗人Survivin抗體、兔抗人Caspase-3抗體、兔抗人Caspase-7抗體和DAB顯色劑購於CellSignallingTechnology公司。1.3大鼠分組及模型製備無菌操作下，取人宮頸癌Hela細胞置於RPMI-1640培養液(成為分10％胎牛血清和2％穀氨醯胺)中，在37℃體積分數為5％的CO2飽和溼度環境中培養，培養24h至生長對數期，用0.25％胰酶消化細胞，10％體積分數的小牛血清培養基終止消化，1200r/min離心10min，洗滌，調整細胞計數為107/mL，抽取人宮頸癌Hela細胞懸液，向大鼠腋窩皮下注射0.5mL，常規飼養大鼠7d後見明顯腫瘤結節生長，為造模成功，剔除沒有造模成功的大鼠。大鼠隨機分為5組，分別為正常對照組、模型對照組、鹽酸納洛酮組(80mg·kg-1)、化合物(Ⅰ)組(80mg·kg-1)、鹽酸納洛酮與化合物(Ⅰ)組合物組【40mg·kg-1鹽酸納洛酮+40mg·kg-1化合物(Ⅰ)】。正常對照組為未造模的大鼠，予以混合飼料和純淨水飼養，由大鼠自行飲食。模型對照組予以混合飼料和純淨水飼養；藥物組在飼養的基礎上，每天灌胃給藥。1.4檢測Survivin、Caspase-3和Caspase-7的蛋白表達大鼠飼養3周後處死，無菌操作下，模型組和給藥組取腫瘤組織50mg，正常對照組腋窩皮下組織50mg，將選取好的組織經PBS緩衝液洗滌，將洗滌後的組織研磨、離心收集，用冰冷PBS洗滌細胞3次後，加入裂解緩衝液，搖勻，置於4℃水中冰浴30min，1200r/min離心10min，吸取上清液，即胞質蛋白。採用BCA法對樣品蛋白質進行蛋白定量。調整樣品蛋白量為30～40μg後進行SDS-PAGE凝膠電泳分離，並將蛋白質轉移到PVDF膜上。PBST洗膜5min後，PBST溶解封閉PVDF膜2h。繼而加入兔抗人Survivin抗體、兔抗人Caspase-3抗體、兔抗人Caspase-7抗體(按1：1000稀釋)或抗β-actin(1：2000稀釋)，置於4℃環境中過夜。PBST洗滌3次，每次10min，加入二抗，溫室孵育2h。再次用PBST洗滌3次，每次10min。將PVDF膜ECL顯色，在暗室中將PVDF曝光於X光片中，用凝膠成像系統掃描分析結果。1.5統計學方法實驗數據用均數±標準差(x±s)表示，應用SPSS18.0版統計軟體進行單因素方差分析和t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。2、實驗結果2.1對宮頸癌模型大鼠移植瘤體積的的影響實驗結束後，正常對照組未見腫瘤生長；與模型對照組比較，鹽酸納洛酮與化合物(Ⅰ)組合物組腫瘤體積明顯縮小(P＜0.01)；與模型對照組比較，鹽酸納洛酮組、化合物(Ⅰ)組腫瘤體積縮小(P＜0.05)。試驗結果見表1，體積單位為mm3。2.2對宮頸癌模型大鼠移植瘤組織中Survivin、Caspase-3和Caspase-7蛋白表達的影響與正常對照組比較，模型對照組組大鼠腫瘤組織中Survivin的表達明顯升高，而其Caspase-3和Caspase-7蛋白表達明顯降低，差異均有統計學意義(P＜0.01)；與模型對照組比較，鹽酸納洛酮與化合物(Ⅰ)組合物組大鼠腫瘤組織中Survivin的表達較明顯降低(P＜0.01)，Caspase-3和Caspase-7蛋白的表達均顯著升高(P＜0.01)；與模型對照組比較，鹽酸納洛酮組、化合物(Ⅰ)組大鼠腫瘤組織中Survivin的表達降低(P＜0.05)，Caspase-3和Caspase-7蛋白的表達均升高(P＜0.05)。試驗結果見表1。表1對移植瘤體積和移植瘤組織中Survivin、Caspase-3和Caspase-7蛋白表達的影響組別體積SurvivinCaspase-3Caspase-7正常對照組00.017±0.0040.894±0.3290.952±0.257模型對照組975±2320.856±0.2540.367±0.2560.494±0.167鹽酸納洛酮組274±320.474±0.1280.568±0.2970.727±0.169化合物(Ⅰ)組283±270.425±0.1130.534±0.2520.725±0.159鹽酸納洛酮與化合物(Ⅰ)組合物組25±40.277±0.2320.798±0.1990.927±0.154宮頸癌是女性生殖系統三大惡性腫瘤之一，是最常見的婦科惡性腫瘤。本病是由宮頸上皮內瘤變形成後繼續發展，突破上皮下基膜侵潤間質，形成宮頸侵潤癌。宮頸轉化區上皮化生過度活躍，並在致癌因素作用下也可形成宮頸侵潤癌。常與性生活紊亂、分娩次數多、高危型HPV感染、早婚等因素有關。本病發病初期可有接觸性出血、陰道異常分泌物等症狀，但多數患者早期常無明顯症狀和體徵，晚期可出現陰道出現不規則流血以及癌組織累及其他組織器官出現的繼發性症狀。據調查統計，我國宮頸癌患病率仍處於逐年上升趨勢。細胞凋亡促進因子和凋亡抑制因子共同調節細胞凋亡過程。Survivin是目前發現凋亡抑制作用最強的因子，能夠抑制凋亡促進因子酶原轉變為活性凋亡促進因子，抑制細胞凋亡，在正常人組織中幾乎零表達，但在惡性腫瘤組織中呈現高表達，在腫瘤的發生發展中起到不可忽略的作用。有研究報導，正常人體組織中Survivin為低表達，宮頸CIN患者組織中Survivin呈中等表達，而宮頸癌患者組織中Survivin呈現出高表達。根據Survivin這一特點，可將Survivin做為判斷惡性腫瘤預後和輔助診斷的重要指標，也可為惡性腫瘤靶點治療提供依據。Caspase-3和Caspase-7是凋亡促進因子Caspase家族的重要成員，具有誘導細胞凋亡作用。人體少數細胞非依賴凋亡促進因子，但大多數細胞凋亡依賴凋亡因子的誘導，當凋亡促進因子被抑制，活性受到抑制，細胞凋亡與增殖平衡失調，導致腫瘤發生。凋亡抑制因子Survivin下調時，凋亡促進因子Caspase上調，促進細胞凋亡，Survivin可直接或間接作用於Caspase來抑制細胞凋亡。上述結果表明，鹽酸納洛酮、化合物(Ⅰ)單獨作用時，對宮頸癌具有治療作用；鹽酸納洛酮和化合物(Ⅰ)聯合作用時，治療效果進一步提高，可以開發成治療宮頸癌的藥物。上述實施例的作用在於說明本發明的實質性內容，但並不以此限定本發明的保護範圍。本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和保護範圍。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp