用大孔吸附樹脂製備樟芝多糖和樟芝三萜的方法及其產品的製作方法
2023-05-12 03:24:06 1
專利名稱：用大孔吸附樹脂製備樟芝多糖和樟芝三萜的方法及其產品的製作方法
技術領域：
本發明是建立一種用大孔吸附樹脂層析分離製備樟芝多糖和樟芝三萜的方法。本發明也包括利用本方法獲得的具藥理活性的產品及用於製備藥物。涉及大孔吸附樹脂層析分離和中草藥有機成分的分離提純技術領域。
背景技術：
樟芝(Antrodia camphorata)是臺灣一種著名的中藥。野生子實體生長在臺灣保護樹種牛樟樹樹幹腐朽之心材內壁，或枯死倒伏之牛樟木材陰暗潮溼之表面，很不容易被發現。樟芝在臺灣有悠久的使用歷史，原住民皆將樟芝視為是最珍貴的藥材。野生上品在物以稀為貴的預期心理作用之下，天然樟芝的價格也日漸地水漲船高，目前被稱為是全世界市場上最昂貴的野生真菌，市價往往高達每臺斤新臺幣十多萬元至數十萬元不等，野生上品可達15000美元/公斤，可說是藥材中的王中之王。目前，還不能人工培育樟芝子實體。在臺灣，近幾年已有十幾家公司開發出用樟芝發酵菌絲體和發酵菌粉為主要原料的保健食品，可以調節生理功能、滋補強身、增強體力、增加免疫力、精神旺盛、促進新陳代謝、減少疲勞感。
近幾年研究發現，樟芝子實體和發酵產物的主要藥理活性物質是多糖、多酚和三萜。樟芝子實體和液體深層發酵菌絲體中粗多糖具有強的抗B肝病毒表面抗原的活性，50ug/ml多糖濃度抗B肝病毒(HBV)表面抗原的活性強於α-幹擾素1000U/ml的劑量。而樟芝子實體和某些菌株液體深層發酵菌絲體產生的多糖還具有抗B肝病毒e抗原的活性。這是首次發現來源於食用真菌中多糖具有在細胞水平抗HBV活性。
樟芝的抗氧化能力與所含的多酚、總三萜有關。環境及膳食中某些化學物質進入機體後通過體內的代謝過程．引起活性氧自由基大量生成、內源性抗氧化物質減少甚至耗竭，從而引發脂類、蛋白質等生物大分子的一系列改變生命機體之所以發生氧化損傷，從而導致一系列疾病如冠心病，動脈粥樣硬化，癌症等。使用抗氧化劑可清除體內氧自由基，以達到保護人體細胞組織，保護心腦血管循環系統、抗癌及延緩衰老等生理作用。樟芝三萜則具有抗HBV和抑制腫瘤，特別是抑制肝癌細胞的活性。
目前，樟芝中生理活性物質的分離純化研究工作不多，適合工業化生產的資料更是缺乏，且步驟繁雜。
大孔吸附樹脂是近代發展起來的一類有機高聚物吸附劑，20世紀70年代末逐漸應用到中草藥有效成分提取分離過程中。在天然產物分離中常用的是非極性和中極性大孔樹脂，其特點是吸附容量大、再生簡單、效果可靠。目前還沒有用大孔吸附樹脂分離樟芝多糖和樟芝三萜的報導。
發明內容
本發明的目的是提供用大孔吸附樹脂製備樟芝多糖和樟芝三萜的方法及其產品，採用大孔樹脂吸附工藝，可達到用一步操作實現工業化分離樟芝多糖和樟芝三萜的目的。
本發明的技術方案用大孔吸附樹脂層析分離製備樟芝中生理活性物質，具體是指多糖和三萜的方法。由於樟芝野生子實體或人工栽培子實體，固體栽培和液體發酵所得菌絲體產物中多糖和三萜都是其主要藥理活性組分，因此，本發明所述的分離製備方法對樟芝野生子實體或人工栽培所得子實體、液體發酵和固體栽培所得菌絲體產物都適用。
對於液體發酵所得菌絲體產物可在發酵結束後在發酵罐內加快攪拌槳速度將菌絲體打碎，然後升高溫度至90-100℃提取1-3小時。如用液體發酵所得菌絲體乾燥物、野生子實體或人工栽培子實體、固體栽培所得菌絲體，則可打碎成適宜大小的碎塊後，加入以所提取物乾重計8-10倍重量的水，在90-100℃提取1-3小時。在提取結束後，可採用離心過濾法或板框過濾法除去不溶物，得提取清液。將所得清液濃縮至固形物含量10％(重量比)後準備上大孔吸附樹脂柱吸附。
大孔吸附樹脂柱的準備將市售的非極性大孔吸附樹脂，如D-101，或中極性大孔吸附樹脂，如HPD400等裝入層析柱。層析柱的材質最好選用玻璃柱，如工業化生產可採用不鏽鋼柱，然後按樹脂操作要求，一般用100％乙醇洗脫至洗脫液加水不渾濁為宜。接著用蒸餾水洗柱至洗脫液無乙醇味，層析柱備用。
將過濾步驟所得濃縮液用適宜的緩慢流速上柱吸附，在上樣後用3倍柱體積的蒸餾水洗脫，洗脫時流速也不宜過快。樟芝多糖為極性物質，不被非極性和中極性大孔樹脂吸附，故存在於蒸餾水洗脫部分，將此部分洗脫液濃縮至原體積的5-10％，濃縮後加乙醇至終乙醇濃度為70-80％後，4℃靜置冷藏24小時，收集所得沉澱即得樟芝多糖。
然後選用遞增乙醇濃度洗脫，用50-60％濃度的乙醇繼續洗脫層析柱去除色素雜質，棄去此洗脫液，然後用80-100％濃度的乙醇繼續洗脫層析柱，每個濃度洗脫3-4個柱體積，樟芝三萜可被較高濃度的乙醇水溶液洗出。選用適當型號的大孔樹脂可得到活性較高的總三萜。
在本發明中採用的是非極性和中極性大孔吸附樹脂，如非極性的D-101和中極性的HPD400等。不同廠家生產的大孔吸附樹脂對樟芝多糖和樟芝三萜都具有分離效果，但分離能力有一定差異，所分得的產物生理活性也不完全相同。
本發明的有益效果本發明將大孔吸附樹脂層析技術成功用於分離製備樟芝多糖和樟芝三萜，為中藥材王中之王的樟芝的有效藥理活性產品的大規模工業化提取和純化提供了一種可行的方法，為所獲藥理活性產品的進一步的開發和應用奠定了基礎。
樟芝多糖具有在細胞水平抗B肝病毒(HBV)的活性。所獲得的樟芝三萜組分兼具抗氧化和抗肝癌細胞活性。D-101樹脂層析製備的樟芝三萜在100ug/ml時，對人正常肝細胞的抑制率為5.2％，而對人肝癌細胞HepG2和Bel7402的抑制率分別可達21％和12％。HPD400樹脂層析製備的樟芝三萜在100ug/ml時，對人正常肝細胞的抑制率為10％，而對人肝癌細胞HepG2和Bel7402的抑制率分別可達30％和44％，表明其具有很好的抗肝癌細胞活性。用液-質聯用分析，其主要有效成分是一新結構化合物，是將來開發中藥、天然藥物一類新藥的優秀新化學實體。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明做進一步的詳細說明。以下實施例中所用的樣品為液體發酵樟芝菌絲體，所舉實例並非限制本專利的適用範圍。
實施例1用非極性大孔樹脂D-101分離製備樟芝多糖和樟芝三萜層析柱用內徑4cm，長80cm的玻璃層析柱，內裝D-101填料(由天津市海光化工有限公司生產)，高50cm，相應的填料體積為628ml。將樟芝液體發酵產物的水提取液配製成100mg/ml上樣，上樣量為140ml，上樣和洗脫的流速保持5ml/min。上樣結束後用1900ml的蒸餾水洗脫，收集洗脫液，濃縮後加入乙醇至終乙醇濃度達75％，4℃靜置冷藏24小時，收集得白色沉澱，真空乾燥得樟芝多糖2.6g。
水洗後用遞增乙醇濃度洗脫，用50-60％濃度的乙醇繼續洗脫層析柱去除色素雜質，棄去此洗脫液，然後用80-100％濃度的乙醇繼續洗脫層析柱，樟芝三萜主要存在於80-100％乙醇洗脫液中，洗脫液呈無色透明，濃縮乾燥得淡黃色產物0.08g，佔發酵產物乾重得率為0.23％。
實施例2用中極性大孔樹脂HPD400分離製備樟芝多糖和樟芝三萜層析柱用內徑4cm，長80cm的玻璃層析柱，內裝HPD400填料(由河北滄州寶恩化工有限公司生產)，高50cm，相應的填料體積為628ml。將樟芝液體發酵產物的水提取液配製成100mg/ml上樣，上樣量為140ml，上樣和洗脫的流速保持5ml/min。上樣結束後用1900ml的蒸餾水洗脫，收集洗脫液，濃縮後加入乙醇至終乙醇濃度達75％，4℃靜置冷藏24小時，收集得白色沉澱，真空乾燥得樟芝多糖2.5g。
水洗後用遞增乙醇濃度洗脫，用50-60％濃度的乙醇繼續洗脫層析柱去除色素雜質，棄去此洗脫液，然後用80-100％濃度的乙醇繼續洗脫層析柱，洗脫液呈無色透明，濃縮乾燥得白色結晶0.175g，佔發酵產物乾重得率為0.50％。
實施例3D-101和HPD400所製備的樟芝三萜用於抗氧化、抑制肝癌細胞的測定方法和結果抗氧化測定方法準確稱取20mg DPPH(2，2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，二苯代苦味醯肼自由基)用無水乙醇溶解並定容於250毫升容量瓶中，則DPPH濃度為2×10-4mol/l，取待測液和等體積2×10-4mol/l DPPH溶液加入同一具塞試管中，搖勻。30分後用無水乙醇作參比測定其吸光度Ai，測定波長517nm。同時測定2×10-4mol/l DPPH溶液與等體積無水乙醇混合液的吸光度Ac，以及待測液與等體積無水乙醇混合液的吸光度Aj。根據下列公式計算抑制率抑制率＝[1-(Ai-Aj)/Ac]×100％其中Ac未加抗氧化劑時DPPH溶液的吸光度；Ai加抗氧化劑時DPPH溶液的吸光度；Aj待測液在測定波長的吸光度。
抗氧化測定結果D101所製備三萜的EC50(即50％抑制濃度)為1.9mg/ml，HPD400所製備三萜的EC50為6.3mg/ml。
抑制肝癌細胞測定方法完全培養液的配製RPMI1640培養液用無菌的1mol/L HCl或NaOH調pH至7.0～7.2，過濾除菌，用前加入10％小牛血清(FCS)，1％200mmol/L穀氨醯胺，100U/ml的青黴素和100μg/mL鏈黴素，即為完全培養液。
細胞培養人肝癌細胞株Hep G2生長在完全培養基中，於37℃，5％CO2，飽和溼度條件下培養。傳代至旺盛生長後，試驗24h前半量換液，0.4％臺盼藍鑑定活細胞數應為98％以上。所有實驗均經二次以上重複證實。
MTT法細胞生長抑制實驗原理MTT即3-(4，5-dimethylthiazol-2yl)-2，5-diphenyltetrazoloium，中文名為3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑嗡。活細胞線粒體能夠將黃色的MTT代謝生成紫色的結晶，用二甲亞碸溶解結晶後，測定570nm的光吸收。因為吸光度的大小與活細胞線粒體的代謝能力成正相關，從而與活細胞數量呈一定的相關性。因此，根據顏色的變化可以確定細胞的生長抑制情況。
方法用0.25％胰蛋白酶消化後用RPMI1640完全培養液調整Hep G2細胞濃度為1×105～5×105/mL，將Hep G2細胞加入96孔培養板中，每孔150μL。加入用完全培養液稀釋成15μg/mL、50μg/mL的100％乙醇洗脫物溶液150μL，每個樣品設四次重複，同時設空白對照，將細胞培養板移入CO2培養箱中，在37℃、5％CO2及飽和溼度條件下培養48h。培養結束後，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)10μl，37℃繼續孵育4h。然後棄去孔內培養上清液，每孔加入150μl二甲亞碸，37℃保溫10min，震蕩60s，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔在570nm處的吸光度值(OD值)，計算百分抑制率，並從量效時間曲線上計算出不同作用時間的IC50。
抑制肝癌細胞測定結果D-101樹脂層析製備的樟芝三萜在100ug/ml時，對人正常肝細胞的抑制率為5.2％，而對人肝癌細胞HepG2和Bel7402的抑制率分別可達21％和12％。HPD400樹脂層析製備的樟芝三萜在100ug/ml時，對人正常肝細胞的抑制率為10％，而對人肝癌細胞HepG2和Bel7402的抑制率分別可達30％和44％，表明其具有很好的抗肝癌細胞活性。用液-質聯用分析，其主要有效成分是一新結構化合物，是將來開發中藥、天然藥物一類新藥的優秀新化學實體。
權利要求
1.一種用大孔吸附樹脂分離製備樟芝多糖和樟芝三萜的方法，其特徵是將樟芝子實體或菌絲體用熱水提取，提取液過濾，過濾所得清液用大孔吸附樹脂層析柱吸附，用3倍填料體積的蒸餾水洗脫，收集蒸餾水洗脫液，濃縮後用乙醇沉澱得樟芝多糖；再用乙醇分級洗脫層析柱，將洗脫液濃縮，乾燥得樟芝三萜；具體工藝為熱水提取樟制子實體或菌絲體打碎後以乾重計加入8-10倍重量的水，在90-100℃提取1-3小時；過濾提取結束後，用離心或板框過濾去除不溶物得提取清液，將所得清液濃縮至固形物含量10％；層析柱吸附將過濾步驟所得濃縮液在大孔吸附樹脂層析柱上樣吸附；蒸餾水洗脫並製備樟芝多糖用蒸餾水洗脫上樣後的層析柱，收集洗脫液濃縮至原體積的5-10％，然後在濃縮液中加入乙醇至終乙醇濃度達70-80％，靜置冷藏，收集所得沉澱，乾燥即得樟芝多糖；乙醇分級洗脫並製備樟芝三萜用50-60％濃度的乙醇繼續洗脫層析柱去除色素雜質，棄去此洗脫液，然後用80-100％濃度的乙醇繼續洗脫層析柱，收集80-100％濃度的乙醇洗脫液濃縮、乾燥得樟芝三萜。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵是所用的樟芝原料包括野生子實體或人工栽培所得子實體，固體栽培或液體發酵所得菌絲體。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵是所述的大孔吸附樹脂是非極性大孔樹脂或中極性大孔樹脂。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵是所述的非極性大孔吸附樹脂是D-101樹脂，中極性大孔吸附樹脂是HPD400。
5.用權利要求1所述方法製備的產品，其特徵是具有藥理活性的產品分別是樟芝多糖和樟芝三萜。
6.如權利要求5所述的產品樟芝三萜的應用，其特徵是用於治療過氧化物導致的疾病或肝癌的藥物。
全文摘要
用大孔吸附樹脂製備樟芝多糖和樟芝三萜的方法及其產品，涉及大孔吸附樹脂層析分離和中草藥有機成分的分離提純技術領域。本發明對樟芝子實體或菌絲體採取熱水提取，大孔樹脂吸附水提取液和乙醇分級洗脫方法分別獲得樟芝多糖和樟芝三萜。本發明也包括把本方法獲得的具藥理活性產品用於製備藥物。所獲得的樟芝三萜具有很好的抗肝癌細胞活性。用液－質聯用分析，其主要有效成分是一新結構化合物，是將來開發中藥、天然藥物一類新藥的優秀新化學實體。
文檔編號C07C7/00GK1683418SQ20051003803
公開日2005年10月19日 申請日期2005年3月7日 優先權日2005年3月7日
發明者敖宗華, 符慧子, 鄒錫良 申請人:敖宗華, 符慧子, 鄒錫良