北極海洋紅球菌B7740產類異戊二烯的分離純化方法與流程

2023-05-12 03:07:16

本發明屬於紅球菌b7740產類異戊二烯分離純化的
技術領域：
，具體涉及北極海洋紅球菌b7740產類異戊二烯的分離純化方法。
背景技術：
：紅球菌屬是一類廣泛分布於自然界的革蘭氏陽性菌，在土壤、海底沉積物和食草動物糞便中含量豐富，且多數為營腐生生活。紅球菌屬(rhodococcussp.)是在1891年由zoof建立的，從建立至今，分類地位一直不確定。目前，紅球菌歸屬於放線菌門(actinobacteria)，放線菌綱(actinobacteria)，放線菌亞綱(actinobacteridae)，放線菌目(actinomycetales)，棒桿菌亞目(croynebacterineae)，諾卡氏菌科(nocardiaceae)，紅球菌屬(rhodococcus)。目前，國內外對紅平紅球菌的研究較多，主要集中在其生物降解能力研究和分子學研究，而對紅球菌產類異戊二烯物質研究較少，尤其對極地海洋來源的紅球菌b7740產類異戊二烯物質的鑑定與研究尚十分匱乏，紅球菌b7740是我國北極科考隊於第三次北極科考時從b77站點20米的表層海水中發現，對於該菌所產物質的純化尚未有任何文獻報導。紅球菌b7740產類胡蘿蔔素因該微生物獨特的代謝通路，與常見高等植物來源類胡蘿蔔素相比，結構相差較大，結構種類不單一，其獨特的結構不僅賦予了它獨特的活性，也增大了其純化的難度。技術實現要素：為解決上述現有技術存在的問題，本發明提供了北極海洋紅球菌b7740產類異戊二烯的分離純化方法，該分離方法操作方便快捷，能對紅球菌b7740所產類異戊二烯物質進行有效的分離純化。實現本發明上述目的所採用的技術方案為：北極海洋紅球菌b7740產類異戊二烯的分離純化方法，利用高速逆流色譜分離純化北極海洋紅球菌b7740產類異戊二烯。北極海洋紅球菌b7740產類異戊二烯的分離純化方法，包括如下步驟：1、按正己烷、乙腈和二氯甲烷的體積比為10:6-8:2-4配製溶劑體系，充分搖勻，待溶劑體系開始分層，靜置分層並分離，得上層液和下層液，上層液作為固定相，下層液作為流動相；2、將類異戊二烯提取液用部分下層液溶解，配製成100-1000ug/ml樣品溶液；3、打開恆溫水浴，將溫度設置為18-22℃；4、用無水乙醇清洗泵中的螺旋柱管；5、泵入固定相；6、平衡兩相溶劑體系：打開紫外檢測器，待預熱完成後，將波長設置為450nm；正轉轉動主機，同時以10ml/min流速泵入流動相，待檢測器出口端流出流動相且紫外信號穩定不變時，則溶劑體系已基本平衡；7、進樣；8、接收流分。進一步，正己烷、乙腈和二氯甲烷的體積比為10:8:2、10:6.5:3.5、10:7:3或10:6.75:3.25。與現有技術相比，本發明的優點和有益效果在於：本發明利用tbe-300c高速逆流色譜儀對紅球菌b7740所產類異戊二烯物質進行有效的分離純化，得到三種稀有海洋來源類胡蘿蔔素。此三種北極海洋來源的稀有類胡蘿蔔素，具有與常見高等植物來源類胡蘿蔔素完全不同的端基，該三種類胡蘿蔔素經鑑定為芳香類胡蘿蔔素，獨特的結構賦予其獨特的活性，具有應用於食品、藥品、化妝品的價值，並因為其獨特的天然來源，比人工合成的類胡蘿蔔素更易受市場青睞。說明書附圖圖1為實施例1中紅球菌b7740產類異戊二烯物質(溶劑體系中正己烷、乙腈和二氯甲烷體積比為10:8:2時)的hsccc色譜圖。圖2為實施例1中紅球菌b7740產類異戊二烯物質(溶劑體系中正己烷、乙腈和二氯甲烷體積比為10:6.5:3.5時)的hsccc色譜圖。圖3為實施例1中紅球菌b7740產類異戊二烯物質(溶劑體系中正己烷、乙腈和二氯甲烷體積比為10:7:3時)的hsccc色譜圖。圖4為實施例1中紅球菌b7740產類異戊二烯物質(溶劑體系中正己烷、乙腈和二氯甲烷體積比為10:6.75:3.25時)的hsccc色譜圖。圖5為實施例1中分離產物一的高精度質譜圖。圖6為實施例1中分離產物二的高精度質譜圖。圖7為實施例1中分離產物三的高精度質譜圖。具體實施方式下面結合具體實施方式對本發明進行詳細說明。北極海洋紅球菌b7740，是發明人於2008年7-9月中國第三次北極科學考察期間，用seabird911plusctd系統從北冰洋b77站點(146°49.28′w，76°58.08′n)25m深的表層海水樣品中分離得到，寧波市微生物與環境工程重點實驗室通過16srdna序列blast在線比對，判定該菌為紅球菌屬。實施例1北極海洋紅球菌b7740產類異戊二烯的分離純化實驗1、實驗材料1.1、實驗試劑溶菌酶(20000u/mg)購自國藥集團化學試劑有限公司，醋酸鋅、氯化鈉、甲醇和二氯甲烷購自國藥集團化學試劑有限公司，正己烷、二氯甲烷購自國藥集團化學試劑有限公司；色譜級甲醇、乙腈購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；色譜級甲基叔丁基醚購自上海阿拉丁生化科技技股有限公司。1.2、實驗儀器tbe-300c高速逆流色譜儀購自上海同田生物科技有限公司；2695高效液相色譜儀購自美國waters公司；ltq-orbitrapelite質譜儀購自賽默飛世爾科技(美國)有限公司。1.3、實驗原料按照中國專利(一種紅球菌b7740類胡蘿蔔素的微膠囊製備方法、201510016005.8)公開的方法製備類異戊二烯提取液：稱取0.8g北極海洋紅球菌b7740凍幹菌粉(浙江萬裡學院提供)置於離心管中，加入16ml溶菌酶溶液(1mg/ml)，置於37℃水浴中，避光放置1h，然後加入24ml飽和醋酸鋅溶液使已破壁的紅球菌沉降，將該離心管於7000rpm、4℃下離心10min，丟棄上清液，再將64ml混合有機溶劑(甲醇：二氯甲烷＝4:1，體積比)加入到紅球菌沉澱中，用玻璃棒攪拌均勻，離心，分離出上清液，繼續向離心管中加入混合有機溶劑(甲醇：二氯甲烷＝4:1，體積比)，如此反覆提取2-3次，合併上清液，得到類異戊二烯提取液。2、實驗方法：2.1、用1000ml分離漏鬥按正己烷、乙腈和二氯甲烷的體積比為10:8:2配製2l溶劑體系，充分振蕩搖勻，待溶劑體系開始分層，在室溫(25℃)下靜置15min進行分層，分離，得上層液(固定相)和下層液(流動相)，將上層液和下層液分別放入藍蓋瓶中，超聲排氣20min，備用；2.2、將類異戊二烯提取液用20ml下層液溶解，配製成300ug/ml樣品溶液；2.3、打開恆溫水浴，將溫度設置為20℃；2.4、用無水乙醇清洗泵中的螺旋柱管：以50ml/min流速泵入無水乙醇，泵入1min後停止，再打開氣泵，排氣5min，將螺旋柱管中的殘留液體吹乾；重複此過程3次(最後一次排氣1h)；2.5、泵入固定相：以50ml/min流速泵入固定相，待檢測器出口端流出約30-50ml固定相時，停泵；2.6、平衡兩相溶劑體系：打開紫外檢測器，待預熱完成後，將波長設置為450nm；正轉轉動主機(rev為反轉，fwd為正轉)，轉速為800r/min，同時以10ml/min流速泵入流動相，待檢測器出口端流出流動相且紫外信號穩定不變時，則溶劑體系已基本平衡；2.7、進樣；將進樣六通閥切至到load，在裝樣柱的注射器中倒入樣品溶液20ml，推排氣泡後，將樣液吸入到進樣圈中，直至樣液剩餘1ml為止，再將load切換至inject，並將檢測器、工作站調零，重新記錄；2.8、接收流分：待工作站開始記錄，按色譜出峰的信號的順序收集流分；2.9、清洗hsccc儀器：斷開主機與泵的連接，關閉主機，以50ml/min流速將無水乙醇泵入，衝洗螺旋柱管，泵入1min後停止，再將主機的進口與氣泵的氣管連接，打開氣泵，排氣5min，將螺旋柱管中的殘留液體吹乾；重複此過程3次(最後一次排氣30min)；2.10、將收集的各分流用旋轉蒸發儀旋幹，再用甲基叔丁基醚復溶，經氮氣吹乾後，得到各待測流分樣品，放置於冰箱負一層進行低溫、避光貯藏；2.11、重複步驟2.1-2.10三次，每次重複只改變正己烷、乙腈和二氯甲烷的體積比，正己烷、乙腈和二氯甲烷的體積比分別變為10:6.5:3.5、10:7:3或10:6.75:3.25，其他操作不變。3、一級檢測：將每次操作所得的各待測樣品用高效液相色譜和紫外吸收進行檢測：高效液相色譜檢測條件如下：色譜柱ymcc30(5um×4.6mm×150mm)，柱溫25℃，紫外吸收檢測器，檢測波長450nm，進樣量10ul；流動相：流動相a為甲醇，b為甲基叔丁基醚，流速：1ml/min.洗脫程序：第一階段：採用流動相a和流動相b的混合液洗脫30分鐘，其中流動相a的體積百分含量由95變為70％，流動相b的體積百分含量由5變為30％；第二階段：採用流動相a和流動相b的混合液洗脫20分鐘，其中流動相a的體積百分含量由70變為50％，流動相b的體積百分含量由30變為50％；第三階段：採用流動相a和流動相b的混合液洗脫10分鐘，其中流動相a的體積百分含量由50變為95％，流動相b的體積百分含量由50變為5％。4、一級實驗結果：4.1、溶劑體系中正己烷、乙腈和二氯甲烷體積比為10:8:2時的分離效果溶劑體系在正己烷：乙腈：二氯甲烷的體積比為10:8:2的條件下，類異戊二烯提取液的hsccc色譜圖如圖1所示，由圖1可知，出現了三個峰，三個峰按出峰順序分別為峰一、峰二和峰三。峰一、峰二和峰三所對應的待測流分樣品的hplc和紫外吸收檢測結果如表1所示：表1類異戊二烯提取液在溶劑體系中正己烷、乙腈和二氯甲烷體積比為10:8:2時分離產物的hplc和紫外吸收檢測結果從表1可以看出，峰一的分離效果不好，含有三種主要成分，峰二的分離效果雖然好一些，純度達到了80.33％，但雜峰太多，峰三的分離效果最好，純度高達95.21％，其最大紫外吸收波長為452nm。4.2、溶劑體系中正己烷、乙腈和二氯甲烷體積比為10:6.5:3.5時的分離效果溶劑體系在正己烷：乙腈：二氯甲烷的體積比為10:6.5:3.5的條件下，類異戊二烯提取液的hsccc色譜圖如圖2所示，由圖2可知，出現了八個峰，八個峰按出峰順序分別為峰一、峰二、峰三、峰四、峰五、峰六、峰七和峰八。峰一-峰八所對應的待測流分樣品的hplc和紫外吸收檢測結果如表2所示：表2類異戊二烯提取液在溶劑體系中正己烷、乙腈和二氯甲烷體積比為10:6.5:3.5時分離產物的hplc和紫外吸收檢測結果hsccc分離產物hplc出峰時間hplc出峰面積hplc出峰面積％紫外吸收λmax峰一亂，峰雜＿＿峰二亂，峰雜＿＿峰三22.036130781.62274,452,468峰四26.8179165856.79434,458,484峰五32.2456200393.41282,452,476峰六29.583177893.92284,434,460,486峰七亂，峰雜＿＿峰八24.1253727380.36250,274由表2可知，峰一、峰二和峰七的分離效果很差，全是雜峰，峰三的純度達到了81.62％，但還有一些雜峰，分離效果一般般，峰四的分離效果也不好，純度只有56.79％，雜峰太多，峰五的分離效果非常好，純度達到了93.41％，其最大紫外吸收波長為452nm，峰六的純度雖然達到了93.41％，但存在拖尾現象，峰八雖然純度達到了80.36％，但沒有出現單峰，兩個峰連在了一起，分離效果也一般。4.3、溶劑體系中正己烷、乙腈和二氯甲烷體積比為10:7:3時的分離效果溶劑體系在正己烷：乙腈：二氯甲烷的體積比為10:7:3的條件下，類異戊二烯提取液的hsccc色譜圖如圖3所示，由圖3可知，出現了四個峰，四個峰按出峰順序分別為峰一、峰二、峰三和峰四，同時標出間一(峰一之前的曲線部分)、間二(峰三和峰四之間的曲線部分)和間三(峰四之後的曲線部分)。峰一-峰四以及間一-三所對應的待測流分樣品的hplc和紫外吸收檢測結果如表3所示：表3類異戊二烯提取液在溶劑體系中正己烷、乙腈和二氯甲烷體積比為10:7:3時分離產物的hplc和紫外吸收檢測結果hsccc分離產物hplc出峰時間hplc出峰面積hplc出峰面積％紫外吸收λmax間接液一＿＿＿峰一22.01892634992.82274,452,468峰二＿＿＿峰三26.8283486385.1434,458,484間接液二32.2123519683.79282,452,476峰四32.2329124178.96282,452,476間接液三29.5199616991.79284,434,460,486從表3可知，間接液一、峰二的分離效果很差，峰一和間接液三的分離效果比較好，純度分別達到了92.82％、91.79％，其最大紫外吸收波長分別為452nm、460nm，峰四的純度雖然純度達到了78.96％，但沒有單峰出現，兩峰連在了一起，分離效果一般，峰三的純度雖然達到了85.1％，但沒有單峰出現，兩峰連在了一起，分離效果不好，間接液二雖然達到了83.79％，但存在拖尾現象，而且有較多小雜峰。4.4、溶劑體系中正己烷、乙腈和二氯甲烷體積比為10:6.75:3.25時的分離效果溶劑體系在正己烷：乙腈：二氯甲烷的體積比為10:6.75:3.25的條件下，類異戊二烯提取液的hsccc色譜圖如圖4所示，由圖4可知，出現了六個峰，六個峰按出峰順序分別為峰一、峰二、峰三、峰四、峰五、峰六。峰一-峰六所對應的待測流分樣品的hplc和紫外吸收檢測結果如表4所示：表4類異戊二烯提取液在溶劑體系中正己烷、乙腈和二氯甲烷體積比為10:6.75:3.25時分離產物的hplc和紫外吸收檢測結果hsccc分離產物hplc出峰時間hplc出峰面積hplc出峰面積％紫外吸收λmax峰一22.0326250272.56274,452,468峰二24.1144199762.6250,274峰三32.3949091792.87282,452,476峰四29.5435915196.39284,434,460,486峰五亂，峰雜＿＿峰六26.8756466489.7434,458,484從表4可知，峰一、峰二的分離效果一般，純度分別只有72.56％和62.6％，峰三和峰四的分離效果較好，純度分別達到了92.87％和96.39％，其最大紫外吸收波長分別為452nm、460nm，峰五的分離效果很差，峰六的分離效果較好，純度為89.7％，其最大紫外吸收波長為458nm，經分析，峰六為β-胡蘿蔔素。5、二級檢測取分離產物一(4.3中峰一對應的流分)、分離產物二(4.4中峰四對應的流分)、分離產物三(4.1中峰三對應的流分)進行高精度質譜分析：質譜條件：esi離子源，掃描範圍m/z400-700，解析度60000，離子阱dda模式，運用碰撞誘導解離(cid)和35％的碰撞能量，掃描時選取3個信號最強的離子進行串聯質譜分析，加熱溫度250℃，毛細管溫度350℃，鞘氣流速：35，輔助氣體流速：15，噴霧電壓：3.5kv，s-lens射頻水平60％，樣品溶解於色譜甲醇中，進樣量2ul，流速0.2ml/min。6、二級實驗結果：如圖5所示，分離產物一在高精度質譜中其分子離子峰為m/z＝589.3283，即為其實際測量高精度加氫分子量值，其與理論值的偏差見表5，其誤差為4.9ppm以內，鑑定分離產物一為synechoxanthin。如圖6所示，分離產物二在高精度質譜中其分子離子峰為m/z＝533.4095，即為其實際測量高精度加氫分子量值，其與理論值的偏差見表5，其誤差為8.8ppm，鑑定分離產物二為chlorobactene。如圖7所示，分離產物三在高精度質譜中其分子離子峰為m/z＝529.3835，即為其實際測量高精度加氫分子量值，其與理論值的偏差見表5，其誤差為1.1ppm，鑑定21號峰為isorenieratene。分離產物一-三的高精度質譜數據如圖5所示：productformulacalculatedmasserror(ppm)experimentalmass分離產物一c40h4404+h+589.33124.9589.3283分離產物二c40h52+h+533.41428.8533.4095分離產物三c40h48+h+529.38291.1529.3835當前第1頁12