一種茶花愈傷組織再生植株的方法

2023-05-11 15:28:41

專利名稱：一種茶花愈傷組織再生植株的方法
技術領域：
本發明涉及山茶花組織培養方法，屬於生物技術領域，是一種茶花愈傷組織再生植株的方法。
背景技術：
山茶花是我國的特色名貴花卉，也是世界聞名的觀賞木本植物。茶花是園林綠化的重要 材料，具有花色美，花期長，葉片亮綠，樹冠多姿，以及在高大樹冠下能良好生長的習性， 被廣泛利用於公園綠地、自然風景區和名勝古蹟。山茶花亦是盆栽的佳品，某些矮生的灌木 型品種，常被作為盆栽應用。除了觀賞價值外，山茶花還具有很高的經濟價值，其花、根均 可入藥，果實可榨油，金花茶的葉可代茶飲，輔助治療高血壓，花可治便血，花的紅、黃色 浸提液可作食用色素。
為保持山茶花品種親本的優良性狀，茶花的繁殖通常不採用實生籽播苗方式，況且玫瑰 重瓣、完全重瓣型等山茶花品種因雌、雄蕊完全退化而不能結實。採用扦插和嫁接方式，對 於一些稀有的山茶花品種來說，其繁殖係數較低，難以進行規模化生產，實現產業化目的。
利用愈傷組織途徑再生不定芽可獲得大量的無性分株，是茶花快速繁殖及遺傳轉化的必 要手段。在山茶花中誘導愈傷組織常用的外植體是葉和莖段，也有少數用花瓣和小孢子的。 Pedroso等(1993)以50齡紅山茶成年樹的葉片為外植體，發現在葉柄和主葉脈處易形成愈 傷組織。Shults等(1996)以紅山茶的花瓣為外植體，在含BA和NAA的培養基上愈傷組織 有較好的生長，但未獲得其再生植株。隆振雄(1981)將油茶的花粉作為外植體，可在合適 的培養基上獲得較高愈傷組織誘導頻率，並且獲得了綠芽點和根，但因汙染而未能獲得完整 的再生植株。
目前還未見從茶花愈傷組織中獲得不定芽的報導，也未見專利申請。因此本發明為滿足 稀有茶花品種的市場需要提供了一條有效的途徑，同時也為茶花分子育種奠定基礎。

發明內容
本發明的目的是針對山茶花愈傷組織誘導和再生植株十分困難技術瓶頸，提供一種茶花 愈傷組織再生植株的方法。
本發明目的通過以下技術方案來實現這種茶花愈傷組織再生植株的方法，該方法按以 下歩驟進行(1) 將山茶花果實用自來水衝洗乾淨，再用洗衣粉浸泡10分鐘，自來水衝洗；然後轉 移到無菌超淨臺上去除果皮後，用體積比為75%的乙醇表面消毒30秒，無菌水衝洗2遍， 用重量比為0.1X的HgCl2中浸泡15—20分鐘，無菌水衝洗5—6遍；
(2) 剝去種子的內外種皮，接種在1/2MS培養基上；
(3) 無菌苗長至3釐米以上時，將小植株幼嫩葉片和莖段接種在愈傷組織誘導培養基上， 愈傷組織誘導培養基為MS+ 0.5mg'L—'6-BA+l,0 mg'L"2，4-D;
(4) 愈傷組織長至直徑為1釐米大小時，轉移至愈傷組織分化培養基上，愈傷組織分化 培養基為MS+mg'L-l6-BA20 + 0.1 mg'L"IBA+mg.L"KT0.1; '
(5) 不定芽長至0.5cm時進行分離，壯芽培養基為MS+0.2 mg.L"6-BA+0.05 mg丄"NAA;
(6) 當芽條長至4—5cm時，切掉芽條基部，以1000g'L"的IBA浸泡芽條的基部，然 後接種在MW+0.2 mg七"IBA+0.2 mg'L"NAA的培養基上。
作為優選，所述的山茶花果實為9月份採集的成熟果實。
作為優選，所述的培養條件為培養溫度為25±2"，光照光強為2500 3000 Lx，光照時 間為12h/d。
本發明的有益效果是目前還沒有從山茶花愈傷組織誘導不定芽和植株再生的報導。本
發明培養基配方簡單，操作工藝簡便，培養時間短，再生頻率高，擴繁係數大，有利於大規 模生產珍稀山茶花植株及實現外源基因的遺傳轉化。
具體實施例方式
通過以下實施例對本發明作進一步的詳細說明，但本發明的內容並不局限於此。
本發明所述的這種茶花愈傷組織再生植株的方法，材料為浙江紅山茶9月成熟果實。將 採集的果實用自來水衝洗乾淨，再用洗衣粉浸泡10分鐘，自來水衝洗。然後轉移到無菌超淨 臺上去除果皮後，用體積比為75%乙醇表面消毒30秒，無菌水衝洗2遍，重量比為0.1%的 HgCl2中浸泡15——20分鐘，無菌水衝洗5——6遍。剝去內外種皮後接種在1/2MS培養基 上，培養溫度為25±2"，光照光強為2500 3000Lx，光照時間為12h/d，以下的培養條件都 相同。
培養2周後實生苗長至3釐米高，將小植株幼嫩葉片和莖段接種在愈傷組織誘導培養基 上，愈傷組織誘導培養基為MS+0.5mg'L—'6-BA+1.0mg'L—'2,4-D。培養一周後，葉切塊開始皺 起，半月後邊緣有少量愈傷組織長出，l個月後愈傷組織直徑達l釐米左右。愈傷組織在分化培養基培養約半月後形成顆粒狀小突起，即生長點，再經培養後分化成 不定芽， 一塊愈傷組織上可形成大量不定芽，在切除較大的芽後，還有不定芽不斷的分化出 來，最佳的培養基是MS+20mg.L—^-BA+(U mg.L"lBA+0.1 mg丄"KT。
培養半月後，不定芽長至0.5cm即可分離，在壯芽培養基MS+0.2 mg丄"6-BA十 0.05mg丄—'NAA上培養1個月後芽條可長至4——5cm,切掉芽條基部，以1000g丄"的IBA 浸泡芽條的基部，然後接種在MW+0.2 mg丄"IBA十0.2mg，L"NAA的培養基上，培養1個月 後根系較發達，生根率達100%。
除上述實施例外，本發明還可以有其他實施方式。凡採用等同替換或等效變換形成的技 術方案，均落在本發明要求的保護範圍。
權利要求
1、一種茶花愈傷組織再生植株的方法，其特徵在於該方法按以下步驟進行(1)將山茶花果實用自來水衝洗乾淨，再用洗衣粉浸泡10分鐘，自來水衝洗；然後轉移到無菌超淨臺上去除果皮後，用體積比為75％的乙醇表面消毒30秒，無菌水衝洗2遍，用重量比為0.1％的HgCl2中浸泡15-20分鐘，無菌水衝洗5-6遍；(2)剝去種子的內外種皮，接種在1/2MS培養基上；(3)無菌苗長至3釐米以上時，將小植株幼嫩葉片和莖段接種在愈傷組織誘導培養基上，愈傷組織誘導培養基為MS+0.5mg·L-16-BA+1.0mg·L-12，4-D；(4)愈傷組織長至直徑為1釐米大小時，轉移至愈傷組織分化培養基上，愈傷組織分化培養基為MS+mg·L-16-BA20+0.1mg·L-1IBA+mg·L-1KT0.1；(5)不定芽長至0.5cm時進行分離，壯芽培養基為MS+0.2mg·L-16-BA+0.05mg·L-1NAA；(6)當芽條長至4-5cm時，切掉芽條基部，以1000g·L-1的IBA浸泡芽條的基部，然後接種在MW+0.2mg·L-1IBA+0.2mg·L-1NAA的培養基上。
2、 根據權利要求1所述的茶花愈傷組織再生植株的方法，其特徵在於所述的山茶花果 實為9月份採集的成熟果實。
3、 根據權利要求1所述的茶花愈傷組織再生植株的方法，其特徵在於所述的培養條件 為培養溫度為25±2°C，光照光強為2500 3000Lx，光照時間為12h/d。
全文摘要
本發明主要涉及一種茶花愈傷組織再生植株的方法，按以下步驟進行剝去山茶花果實種子的內外種皮，接種在1/2MS培養基上；無菌苗長至3釐米以上時，將小植株幼嫩葉片和莖段接種在愈傷組織誘導培養基上，愈傷組織誘導培養基為MS+0.5mg·L-16-BA+1.0mg·L-12，4-D；愈傷組織長至直徑為1釐米大小時，轉移至愈傷組織分化培養基上，愈傷組織分化培養基為MS+mg·L-16-BA20+0.1mg·L-1IBA+mg·L-1KT0.1；不定芽長至0.5cm時進行分離，壯芽培養基為MS+0.2mg·L-16-BA+0.05mg·L-1NAA；當芽條長至4-5cm時，切掉芽條基部，以1000g·L-1的IBA浸泡芽條的基部，然後接種在MW+0.2mg·L-1IBA+0.2mg·L-1NAA的培養基上。本發明的有益效果是本發明培養基配方簡單，操作工藝簡便，培養時間短，再生頻率高，擴繁係數大，有利於大規模生產珍稀山茶花植株及實現外源基因的遺傳轉化。
文檔編號A01H4/00GK101558742SQ200910098398
公開日2009年10月21日 申請日期2009年5月12日 優先權日2009年5月12日
發明者李紀元, 李辛雷, 敏 田, 範正琪 申請人:中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所