中成藥咽炎片標準特徵圖譜的構建方法與應用與流程

2023-05-12 00:33:02 2

本發明涉及中藥質量檢測領域，具體涉及一種中成藥咽炎片標準特徵圖譜的構建方法與應用。

背景技術：

咽炎片是由玄參、板藍根、天冬、麥冬、牡丹皮、制百部、青果、制款冬花、木蝴蝶、地黃、蟬蛻、薄荷油等十二味中藥飲片組成的中藥製劑，所含化學成分十分複雜。該製劑具有養陰潤肺，清熱解毒，清利咽喉，鎮咳止癢之功效。用於慢性咽炎引起的咽幹，咽癢，刺激性咳嗽等症。其製備方法是除薄荷油外，款冬花粉碎成細粉，過篩；其餘玄參等十味加水煎煮二次，第一次3小時，第二次2小時，合併煎液，靜置24小時，取上清液，濃縮成稠膏，與款冬花粉末混合，乾燥，製成顆粒，噴加薄荷油，混勻，壓製成1000片，包衣，即得。

已有特徵圖譜技術是一種可以應用於中藥成分的綜合的檢測手段，是通過對共有特徵峰的檢測以達到對待檢測樣品的多種成分進行檢測的目的，但是目前咽炎片中成藥尚無整體性有效控制其質量的檢測方法，如僅僅依靠薄層色譜法對咽炎片中成藥的部分藥味進行薄層色譜檢測，或對咽炎片中成藥中的某一種或多種成分採用高效液相色譜-紫外檢測器法進行含量測定，片面的反映咽炎片中成藥的質量有嚴重的缺陷，如秦香芹等(黑龍江醫藥.25(4)：529-530)採用高效液相色譜-紫外檢測器法測定咽炎片中芍藥苷的含量，僅測定咽炎片中牡丹皮所含的1種成分的含量。付永慧等(藥物分析雜誌.29(12)：2032-2035)測定咽炎片中5種指標成分的含量，僅能測定哈巴俄苷等可定性的5種成分的含量，而不能對咽炎片中至少6種無法定性的成分進行檢測，因此只能片面的反映咽炎片的質量，不但不能全面有效地衡量咽炎片質量的優劣，而且不能準確快速的判斷咽炎片的真偽。顯然，檢驗效率高同時定性準確的檢測方法，以滿足中成藥複雜的化學成分的質量可控的檢測是非常必要的。因此只有構建咽炎片的標準特徵圖譜才能較為全面的、準確快速的反映咽炎片中複雜的化學成分及其質量的優劣，是非常必要的。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種中成藥咽炎片標準特徵圖譜的構建方法與應用，以全面、快速地檢測出中成藥咽炎片中組方的10種藥材的特徵成分，達到鑑別該中成藥的真偽，並評價其質量的優劣，彌補現有技術的不足。

本發明運用中醫藥理論，首先為建立咽炎片的標準特徵圖譜對其組方成分進行了研究分析：

首先，咽炎片組方中的君藥是玄參，性甘、苦、鹹、寒，具有清熱養陰，解毒散結的功能；生地、麥冬、天冬、青果、板蘭根、牡丹皮六味為臣藥，君臣合伍有養陰調肺、清熱解毒、清利咽喉之功；制百部、制款冬花、木蝴蝶、為佐藥，有潤肺止咳、化痰之功效。組成之成藥全方以養陰，潤肺著力，而取清熱解毒、清利咽喉、疏風散熱、鎮咳化痰，利咽止癢之功，對素體陰虛，感受風熱之邪，易從燥化之症甚宜，宜治急、慢性咽炎所致咽喉紅腫、咽幹、咽癢、口乾、口渴、咳嗽、發熱、惡風、汗出及刺激性咳嗽、音啞，失音等症。

玄參主要含有環烯醚萜類、苯丙素苷類成分，其中的哈巴俄苷為一種主要環烯醚萜苷成分，有較強的抗炎、神經保護、增強免疫等作用，為玄參的特徵性有效成分。因此，本發明選擇的玄參的特徵成分為哈巴俄苷。

其次，板蘭根、牡丹皮均為組方中的臣藥。板蘭根具有清熱解毒、涼血利咽的功能。而衡量板藍根藥材質量優劣的指標性成分為板藍根中的r,s-告依春，如《中國藥典》2015年版一部板藍根項下採用了高效液相色譜-紫外檢測器法測定r,s-告依春的含量，因此以r,s-告依春的含量作為判定板藍根藥材質量優劣的指標；牡丹皮具有清熱涼血，活血化瘀的功能。其中牡丹皮中的芍藥苷具有保護腦神經細胞和心肌、抗局灶性腦缺血、提高造血機能、腫瘤抑制、免疫調節等生物活性，是牡丹皮的活性成分。因此，本發明選擇的板藍根的特徵成分為r,s-告依春。選擇的牡丹皮的特徵成分為芍藥苷；生地、麥冬、天冬、青果亦為方中之臣藥，與板蘭根、牡丹皮合用可增強君藥作用。

再次，制百部、制款冬花、木蝴蝶為組方中的佐藥，具有潤肺止咳、化痰的功效。既可以加強君、臣藥的治療作用，亦可解除次要的兼證，制百部、制款冬花、木蝴蝶中的特徵成分的檢測也是不可缺少的。

因此，按照中藥君、臣、佐、使組方原則，並依照藥味作用主次而選擇了r,s-告依春、芍藥苷、哈巴俄苷共3種已定性的成分和6種不能定性的成分，實現這6種成分分別歸屬於1.地黃和百部；2.天冬、麥冬和青果；3.板藍根和百部；4.木蝴蝶和牡丹皮；5.百部、木蝴蝶和玄參；6.百部和款冬花，共9種特徵成分為指標構建了咽炎片的標準特徵圖譜，從而實現並達到了可以判斷咽炎片的真偽並較全面的反映咽炎片成藥的質量的優劣。

本發明的標準特徵圖譜的構建步驟如下：

(1)首先取①r,s-告依春、芍藥苷、哈巴俄苷對照品，②12批咽炎片樣品，③按《中華人民共和國衛生部藥品標準》中藥成方製劑第二冊收載的咽炎片處方比例及工藝製備的分別缺少玄參、板藍根、天冬、麥冬、牡丹皮、制百部、青果、制款冬花、木蝴蝶、地黃、蟬蛻、薄荷油的12種陰性樣品，即先後製備對照品溶液，供試品溶液和陰性樣品溶液，分別精密吸取對照品溶液，供試品溶液和陰性樣品溶液各1μl，注入液相色譜儀中，按照設定的色譜條件進行測定，檢測並記錄20分鐘的色譜圖，並以國家藥典委員會的中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟體系統進行計算後即生成咽炎片的標準特徵圖譜；

(2)對照品溶液的製備：精密稱取r,s-告依春對照品10.35mg、芍藥苷對照品12.24mg、哈巴俄苷對照品10.08mg(精密至0.1mg)，分別置於50ml量瓶中，加甲醇定容至50ml，製成對照品濃溶液。分別精密量取對照品濃溶液各5ml，置於25ml量瓶中，加甲醇定容至25ml，製成每1ml含r,s-告依春41.40μg、芍藥苷47.20μg、哈巴俄苷38.71μg的混合溶液作為對照品溶液。

(3)供試品溶液的製備：取咽炎片樣品10片，除去包衣，精密稱定(精密至1mg)，研細，精密稱定粉末1g(精密至1mg)，加入20％甲醇20ml，超聲處理(功率300w，頻率40khz)30分鐘，放冷，搖勻，濾過，取續濾液，製成供試品溶液。

(4)陰性樣品溶液的製備：按《中華人民共和國衛生部藥品標準》中藥成方製劑第二冊收載的咽炎片處方比例及工藝製備的分別缺少玄參、板藍根、天冬、麥冬、牡丹皮、制百部、青果、制款冬花、木蝴蝶、地黃、蟬蛻、薄荷油的陰性樣品，按供試品溶液的製備方法製備12種陰性樣品溶液。

其中的共有特徵峰的標定是通過對照品溶液，供試品溶液和陰性樣品溶液的色譜圖中的色譜峰出峰時間和色譜峰是否存在進行比較，得出供試品溶液圖譜中9個共有特徵峰的歸屬：1號峰為未知成分峰，屬於地黃；2號峰為未知成分峰，屬於百部、天冬、麥冬、青果；3號峰為r,s-告依春峰，屬於板藍根；4號峰為未知成分峰，屬於板藍根、百部；5號峰為芍藥苷峰，屬於牡丹皮；6號峰為未知成分峰，屬於木蝴蝶、牡丹皮；7號峰為未知成分峰，屬於百部、木蝴蝶、玄參；8號峰為未知成分峰，屬於百部、款冬花；9號峰為哈巴俄苷峰，屬於玄參。

上述構建的咽炎片標準特徵圖譜應用於咽炎片的真偽鑑別和質量優劣的判定。

應用方法：只要分別精密吸取對照品溶液，供試品溶液各1μl，注入液相色譜儀中，按照上述設定的色譜條件進行測定，檢測並記錄20分鐘的色譜圖即可進行判定；

結果判定如下：首先待檢測樣品的供試品溶液圖譜中應有9個特徵峰，其中包括的r,s-告依春、芍藥苷和哈巴俄苷3個峰應分別與相應的r,s-告依春、芍藥苷和哈巴俄苷3個對照品峰的保留時間相同，即設定與r,s-告依春對照品保留時間相同的峰為s1峰，並分別計算檢測樣品的特徵峰1～4號與s1峰的相對保留時間，規定值為：0.73、0.82、1.00、1.22，且檢測樣品的特徵峰1～4號相對保留時間應在規定值的±5％之內；同樣設定與芍藥苷對照品保留時間相同的峰為s2峰，計算檢測樣品的特徵峰5～9號與s2峰的相對保留時間，規定值為：1.00、1.04、1.14、1.23、1.39，檢測樣品的相對保留時間應在規定值的±5％之內，如待檢測樣品的供試品溶液圖譜完全滿足上述判定條件，則可判定檢測樣品為合格樣品；否則可判定檢測樣品為不合格樣品。

顯然，本發明首次構建的咽炎片的標準特徵圖譜所包含的特徵峰全面，定位準確，實現了有效鑑別該中成藥的真偽，為評價其質量的優劣提供了快速標準檢測方法，有望成為咽炎片中成藥質量控制的標準方法。

附圖說明

圖1：本發明的咽炎片已定性3種成分的對照品溶液的uhplc-uv色譜圖。

圖2：本發明的咽炎片供試品溶液的uhplc-uv色譜圖。

圖3：本發明構建的咽炎片標準特徵圖譜。

具體實施方式

下面給出本發明的詳細的實施例。

本發明採用：儀器與試藥：agilent1290超高效液相色譜儀(美國，安捷倫)；sartorisbp211d電子天平；autoscienceas10200bt型超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。甲醇為色譜用試劑，其它試劑均為分析純。r,s-告依春對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111753-201505，含量為100％)、芍藥苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110736-201539，含量為96.4％)、哈巴俄苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111730-201508，含量為96.0％)。

色譜條件：色譜柱：dikmaendevaorsilc182.1×100mm，1.8μm；以甲醇為流動相a，以水為流動相b，進行梯度洗脫0～4min，90％b→80％b，4～10min，80％b→40％b，10～14min，40％b，14～15min，40％b→80％b，15～18min，80％b→90％b，18～20min，90％b，流速為每分鐘0.2ml；檢測波長為278nm；柱溫為30℃；理論板數按哈巴俄苷峰計算應不低於10000。

對照品溶液的製備：精密稱取r,s-告依春對照品10.35mg、芍藥苷對照品12.24mg、哈巴俄苷對照品10.08mg(精密至0.1mg)，分別置於50ml量瓶中，加甲醇定容至50ml，製成對照品濃溶液。分別精密量取對照品濃溶液各5ml，置於25ml量瓶中，加甲醇定容至25ml，製成每1ml含r,s-告依春41.40μg、芍藥苷47.20μg、哈巴俄苷38.71μg的混合溶液作為對照品溶液。

供試品溶液的製備：取咽炎片樣品10片，除去包衣，精密稱定(精密至1mg)，研細，精密稱定粉末1g(精密至1mg)，加入20％甲醇20ml，超聲處理(功率300w，頻率40khz)30分鐘，放冷，搖勻，濾過，取續濾液，製成供試品溶液。

陰性樣品溶液的製備：按《中華人民共和國衛生部藥品標準》中藥成方製劑第二冊收載的咽炎片處方比例及工藝製備的分別缺少玄參、板藍根、天冬、麥冬、牡丹皮、制百部、青果、制款冬花、木蝴蝶、地黃、蟬蛻、薄荷油的陰性樣品，按供試品溶液的製備方法製備12種陰性樣品溶液。

標準特徵圖譜的構建：首先取①r,s-告依春、芍藥苷、哈巴俄苷對照品；②12批咽炎片樣品；③按《中華人民共和國衛生部藥品標準》中藥成方製劑第二冊收載的咽炎片處方比例及工藝製備的分別缺少玄參、板藍根、天冬、麥冬、牡丹皮、制百部、青果、制款冬花、木蝴蝶、地黃、蟬蛻、薄荷油的陰性樣品，先後製備對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液，按照設定的色譜條件進行測定，並以國家藥典委員會的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統進行計算，生成咽炎片的標準特徵圖譜，其中選定共有特徵峰為9個。

共有特徵峰的標定：通過對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液的色譜圖中色譜峰出峰時間和色譜峰是否存在進行比較，得出供試品溶液圖譜中9個共有特徵峰的歸屬。見表1。

表1共有特徵峰的歸屬

具體應用方法：分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液各1μl，注入液相色譜儀中，按照設定的色譜條件進行測定，檢測並記錄20分鐘的色譜圖進行結果判定。

結果判定：待檢測樣品的供試品溶液圖譜中應有9個特徵峰，其中包括的r,s-告依春、芍藥苷和哈巴俄苷3個峰應分別與相應的r,s-告依春、芍藥苷和哈巴俄苷3個對照品峰的保留時間相同，即設定與r,s-告依春對照品保留時間相同的峰為s1峰，並分別計算檢測樣品的特徵峰1～4號與s1峰的相對保留時間，規定值為：0.73(1號峰)、0.82(2號峰)、1.00(3號峰)、1.22(4號峰)，且檢測樣品的特徵峰1～4號相對保留時間應在規定值的±5％之內；同樣設定與芍藥苷對照品保留時間相同的峰為s2峰，計算檢測樣品的特徵峰5～9號與s2峰的相對保留時間，規定值為：1.00(5號峰)、1.04(6號峰)、1.14(7號峰)、1.23(8號峰)、1.39(9號峰)，檢測樣品的相對保留時間應在規定值的±5％之內，如待檢測樣品的供試品溶液圖譜完全滿足上述判定條件，則可判定檢測樣品為合格樣品；否則可判定檢測樣品為不合格樣品。

精密度試驗精密吸取同一供試品溶液1μl，連續進樣6次，測定共有特徵峰9個，峰1～4號以r,s-告依春峰為參照峰，峰5～9號以芍藥苷峰為參照峰，各特徵峰相對保留時間的相對標準偏差rsd(n＝6)均小於1.5％，表明儀器精密度良好。

重複性試驗取同一批咽炎片樣品，按供試品溶液的製備方法平行製備6份供試品溶液，分別在上述色譜條件下進行測定，峰1～4號以r,s-告依春峰為參照峰，峰5～9號以芍藥苷峰為參照峰，各特徵峰相對保留時間的相對標準偏差rsd(n＝6)均小於1.5％，表明該方法重複性良好。

穩定性試驗精密吸取同一供試品溶液1μl，按上述色譜條件，分別於0、2、4、8、12、24小時進樣1次，測定特徵峰9個，峰1～4號以r,s-告依春峰為參照峰，峰5～9號以芍藥苷峰為參照峰，各特徵峰相對保留時間的相對標準偏差rsd(n＝6)均小於1.5％，表明供試品溶液在24小時內穩定性良好。

相對保留時間的確定採用上述色譜條件分析6批次咽炎片樣品，峰1～4號以r,s-告依春峰為參照峰，各共有特徵峰相對保留時間平均值(n＝6)分別為：0.73、0.82、1.00、1.22，rsd均為0％；峰5～9號以芍藥苷峰為參照峰，各共有特徵峰相對保留時間平均值(n＝6)分別為：1.00、1.04、1.14、1.23、1.39，rsd均為0％；允許範圍按±5％計算，各色譜峰相對保留時間均在規定範圍內。

綜上，本發明所建立的咽炎片的標準特徵圖譜可以較為全面的反映複方製劑中複雜的化學成分，具有操作簡便，精密度好，重複性高的特點，有望成為咽炎片中成藥質量控制的標準方法，以達到全面、有效地控制和監查中成藥咽炎片的質量。