一種多功能克隆載體及其使用方法

2023-05-05 04:52:51 2

一種多功能克隆載體及其使用方法
【專利摘要】本發明公開了一種多功能克隆載體，其構建方法是利用一種抗性基因表達自救方式直接用常規抗生素篩選陽性克隆子，包括以下步驟：首先設計一對具有5』端磷酸化引物序列，接著以PUC19質粒為模版，使用高保真酶PCR擴增得到多功能載體。使用本方法為得到的載體可以高效克隆各種PCR產物，對平末端PCR產物及普通Taq酶擴增產物也有高效克隆效率，可以完全替代平末端克隆載體和TA克隆T載體。使用該方法製備多功能克隆載體，一般陽性率大於90%，有假陽性率低，實驗成本低，實驗操作環節少，方便快捷的優點。本發明還公開了此種多功能克隆載體的使用方法。
【專利說明】一種多功能克隆載體及其使用方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種多功能克隆載體，本發明還涉及該多功能克隆載體的構建方法和使用方法，屬於基因工程中的克隆【技術領域】。
【背景技術】
[0002]隨著大規模測序技術的發展，越來越多物種的基因組序列被測定，為了進一步對未知基因的功能進行研究，需要對所研究的基因進行克隆，為下一步的研究提供可能。因而高效的基因克隆技術應用顯得尤為重要。常規的基因克隆技術，應用含有限制性內切酶識別序列的引物通過聚合酶鏈式反應(PCR)對目標基因進行擴增，並對所獲得的PCR擴增產物進行相應的限制性內切酶處理，並連接到相應限制性內切酶處理過的載體中，從而獲得保存該基因的載體。但這種方法步驟繁瑣，耗時長，且受基因序列和限制性內切酶識別序列的限制。

【發明內容】

[0003]本發明的第一個目的在於提供一種多功能克隆載體。
[0004]本發明的第二個目的在於提供一種多功能克隆載體的使用方法。
[0005]本發明的第一個目的通過以下技術方案予以實現:
[0006]一種多功能克隆載體，其構建步驟如下:
[0007]( I)設計一對具有5』端磷酸化引物序列如下:
[0008]F:5』-CTGTCAGACCAAGTTTACTCATA-3』
[0009]R:5』-TACCAATGCTTAATCAGTGAGGC-3』
[0010]所述引物5』端的第一個鹼基為A或者G。
[0011](2) PCR 擴增
[0012]以PUC19質粒為模板，使用高保真酶PCR擴增得到足量的產物，然後用DpnI內切酶消化掉殘留的模板質粒，膠純化得到的產物即為多功能克隆載體。
[0013]所述的PCR反應體系及條件如下:
[0014]反應體系設計為50 μ I總體系，具體是5 X PCR BuffeK緩衝液)6 μ 1，濃度為2.5mM的dNTPmix (脫氧核糖核苷三磷酸混合物)2 μ 1，濃度為IOmM的上下遊引物各I μ 1，濃度為2U/μ I的Phusion DNA聚合酶0.3 μ I, DNA模板I μ I (約IOng),用滅菌水補足50 μ I體
系O
[0015]反應條件為:95°C 3min預變性，循環內98 °C IOs變性，52°C退火20s，72 °C延伸2min, 35個循環；PCR反應循環後72°C繼續延伸5min，然後16°C保存。
[0016]所述DpnI內切酶消化反應體系和條件:
[0017]酶切反應體系如下 :IOXBuffer4 μ I,DNA1.5 μ g,DpnI內切酶1.5 μ I,滅菌去離子水補足到40 μ 10
[0018]反應條件37 °C，Ihr。[0019]本發明的第二個目的通過以下技術方案予以實現:
[0020]如前述的一種多功能克隆載體，它的使用方法包括以下步驟:
[0021](I)設計一對具有5』端磷酸化引物，並保證引物5』端的第一個鹼基為A或者G;
[0022](2)在0.2ml的PCR反應管中加入:目標PCR片段X μ 1，濃度為20ng/μ I的vector I μ I, 2 X Reaction Buffer5 μ I, T4DNALigase (2u/ μ I) 0.5 μ I，無菌去離子水補足至Ij 10 μ I
[0023]輕輕彈動反應管以混勻內容物，短暫離心3-5秒；
[0024](3)將上述混合反應液放置在22°C -30°C中反應5分鐘,反應結束後,將反應管置於冰上，進行後續的轉化反應；
[0025]當插入片段長度大於2kb，可以將反應時間延長至30分鐘。
[0026](4)轉化
[0027]a取部分連接產物加到50-100 μ I感受態細胞中(剛從冰箱裡取出的感受態放於冰浴上約20分鐘解凍，待剛剛解凍時加入連接產物，連接產物的加入量不超過感受態細胞體積的十分之一)，輕彈混勻，冰浴30分鐘。
[0028]b將離心管置於42°C恆溫45-60秒，取出管後立即置於冰浴中放置2分鐘，其間不
要搖動離心管。
[0029]c吸取全部的轉化產物加到含氨苄青黴素(氨苄青黴素終濃度100 μ g/ml)的LB固體瓊脂培養基上，用無菌的彎頭玻棒輕輕的將細胞均勻塗開；待平板表面乾燥後，倒置平板，37°C培養12-16小時；
[0030](5)陽性克隆檢測
[0031]a快速菌落PCR檢測
[0032]挑取菌落直接進行PCR檢測，按照下面反應條件進行PCR鑑定陽性克隆子:95°C 3min預變性，循環內94°C 30s變性，55 °C退火30s，25個循環，72 °C延伸Xs (IK/min)，PCR反應循環後72°C繼續延伸5min，然後4°C保存；
[0033]b測序鑑定:快速菌落方法進行初步的鑑定後進行DNA序列的測定；本載體PCR各鑑定和測序引物序列如下:
[0034]F5，-AGACAGATCGCTGAGATAGG-3，
[0035]R5』-CGTTAAGGGATTTTGGTCATGAG-3』
[0036]本發明提出的一種，與現有技術相比具有的有益效果為:
[0037]I)本發明的使用方法應用一種抗性基因表達自救方式直接用常規抗生素來篩選陽性克隆子，適用各種PCR產物直接連接，高保真酶和普通Taq酶擴增產物直接與本載體連接，一般陽性克隆子大於90%，假陽性率較低，實驗成本低、實驗操作環節比傳統克隆方法少，方便、快捷。
[0038]2)本發明提到的多功能克隆載體的製備的方法為國際上率先提出的一種新型克隆載體的製備方法，利用連入DNA片段後，抗性基因得到恢復表達，連接產物轉化大腸桿菌，抗性基因恢復表達的為陽性克隆，沒有DNA片段插入的載體，不能獲得抗生素基因的有效表達，從而大腸桿菌不能長出正常的單菌落。
[0039]3)本發明得到的載體可以高效克隆各種PCR產物，對平末端PCR產物(Pfu擴增產物)顯示出高效的克隆效率，同時對普通Taq酶擴增產物也有高效克隆效率，可以完全替代平末端克隆載體和TA克隆T載體。
[0040]4)使用本載體無需對抗生素基因復甦，轉化後冰浴2min就可以立即塗板，比傳統使用傳統載體節約2小時時間。
[0041]5)使用本發明做成的試劑盒極大節約了試驗時間和操作環節，使科研效率得到大幅度提聞。
【具體實施方式】
[0042]實施例1
[0043]一種多功能克隆載體，其構建步驟如下:
[0044]I)設計一對具有5』端磷酸化引物序列如下:
[0045]F:5』-CTGTCAGACCAAGTTTACTCATA-3』
[0046]R:5』-TACCAATGCTTAATCAGTGAGGC-3』
[0047]所述引物5』端的第一個鹼基為A或者G。
[0048]2) PCR 擴增
[0049]以PUC19質粒為模板，使用高保真酶PCR擴增得到足量的產物，然後用DpnI內切酶消化掉殘留的模板質粒，膠純化得到的產物即為多功能克隆載體。
[0050]其中所述的PCR反應體系及條件如下:
[0051]反應體系設計為50 μ I總體系，具體是5 X PCR BuffeK緩衝液)6 μ 1，濃度為2.5mM的dNTPmix (脫氧核糖核苷三磷酸混合物)2 μ 1，濃度為IOmM的上下遊引物各I μ 1，濃度為2U/ μ I的Phusion DNA聚合酶0.3 μ I, DNA模板I μ I (約IOng),用滅菌水補足50 μ I體
系O
[0052]反應條件為:95°C 3min預變性，循環內98 °C IOs變性，52°C退火20s，72 °C延伸2min, 35個循環；PCR反應循環後72°C繼續延伸5min，然後16°C保存。
[0053]所述DpnI內切酶消化反應體系和條件:
[0054]酶切反應體系如下:10XBuffer4 μ I, DNA約1.5 μ g, DpnI內切酶1.5 μ I,滅菌去離子水補足到40 μ I。
[0055]反應條件37 °C，Ihr。
[0056]實施例2
[0057]載體的使用方法:
[0058]I引物設計要求
[0059]本載體對鹼基有偏好性，設計引物時候一定保證引物5 『端的第一個鹼基為A或者G；
[0060]2反應體系的建立
[0061]按照下表的反應體系在0.2ml的PCR管中加入各種成分:
【權利要求】
1.一種多功能克隆載體，其特徵在於:其構建方法如下， (1)設計一對具有5』端磷酸化引物序列如下:
F:5』-CTGTCAGACCAAGTTTACTCATA-3』
R:5』-TACCAATGCTTAATCAGTGAGGC-3』 所述引物5』端的第一個鹼基為A或者G ; (2)PCR擴增 以PUC19質粒為模板，使用高保真酶PCR擴增得到足量的產物，然後用DpnI內切酶消化掉殘留的模板質粒，膠純化得到的產物即為多功能克隆載體。
2.根據權利要求1所述的一種多功能克隆載體，其特徵在於:所述的PCR反應體系及條件如下: 反應體系設計為50 μ I總體系，具體是5XPCR Buffer6 μ 1，濃度為2.5mM的dNTPmix2y 1，濃度為IOmM的上下遊引物各I μ 1，濃度為2U/μ I的Phusion DNA聚合酶0.3 μ 1，DNA模板I μ 1，用滅菌水補足50 μ I體系； 反應條件為:95°C 3min預變性，循環內98°C IOs變性，52°C退火20s，72°C延伸2min，35個循環；PCR反應循環後72°C繼續延伸5min，然後16°C保存。
3.根據權利要求1或2所述的一種多功能克隆載體，其特徵在於:所述DpnI內切酶消化反應體系和條件如下: 酶切反應體系:1OXBuffer4 μ 1,DNA1.5 μ g,DpnI內切酶1.5 μ I,滅菌去離子水補足到40 μ I ； 反應條件37 °C，Ihr。
4.一種權利要求1-3的多功能克隆載體的使用方法，它包括以下步驟: (1)設計一對具有5』端磷酸化引物，並保證引物5』端的第一個鹼基為A或者G; (2)在0.2ml的PCR反應管中加入:目標PCR片段Χμ 1，濃度為20ng/μ I的vector 1 μ 1, 2 X Reaction Buf f er5 μ I, T4DNA Ligase (2u/ μ I) 0.5 μ I,無菌去離子水補足至1 10 μL 輕輕彈動反應管以混勻內容物，短暫離心3-5秒； (3)將上述混合反應液放置在22°C-30°C中反應5分鐘，反應結束後，將反應管置於冰上，進行後續的轉化反應； 當插入片段長度大於2kb，可以將反應時間延長至30分鐘； (4)轉化 a取部分連接產物加到50-100 μ I感受態細胞中(剛從冰箱裡取出的感受態放於冰浴上約20分鐘解凍，待剛剛解凍時加入連接產物，連接產物的加入量不超過感受態細胞體積的十分之一)，輕彈混勻，冰浴30分鐘； b將離心管置於42°C恆溫45-60秒，取出管後立即置於冰浴中放置2分鐘，其間不要搖動離心管； c吸取全部的轉化產物加到含氨苄青黴素(氨苄青黴素終濃度100μ g/ml)的LB固體瓊脂培養基上，用無菌的彎頭玻棒輕輕的將細胞均勻塗開；待平板表面乾燥後，倒置平板，37°C培養12-16小時； (5)陽性克隆檢測a快速菌落PCR檢測 挑取菌落直接進行PCR檢測，按照下面反應條件進行PCR鑑定陽性克隆子:95°C 3min預變性，循環內940C 30s變性，55 °C退火30s，25個循環，72 °C延伸Xs (ΙΚ/min)，PCR反應循環後72°C繼續延伸5min，然後4°C保存； b測序鑑定:快速菌落方法進行初步的鑑定後進行DNA序列的測定；本載體PCR各鑑定和測序引物序列如下:
F5，-AGACAGATCGCTGAGATAGG-3，
R5』-CGTTAAGGGATT TTGGTCATGAG-3』 。
【文檔編號】C12N15/70GK103757039SQ201310102710
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年3月27日 優先權日:2013年3月27日
【發明者】張茂雷, 何東海, 郝曉燕, 康濤 申請人:廣州賽哲生物科技有限公司