H4亞型、H6亞型和H9亞型AIV三重RT‑PCR引物組合、試劑盒及其應用的製作方法

2023-05-05 00:17:41 2

本發明屬於動物病毒學診斷技術領域，具體地，涉及快速同時鑑定h4亞型和/或h6亞型和/或h9亞型aiv的三重rt-pcr引物組合，還涉及包含該三重rt-pcr引物組合的試劑盒以及利用該三重rt-pcr引物組合來快速同時鑑定h4亞型和/或h6亞型和/或h9亞型aiv的方法。

背景技術：

眾所周知，在家禽養殖的過程中，aiv對其的危害性極大，根據對雞致病性的不同可將aiv分為高致病性(highlypathogenicavianinfluenzavirus，hpaiv)和低致病性禽流感病毒(lowpathogenicavianinfluenzavirus，lpaiv)。其中lpaiv包括h4、h6和h9亞型等，lpaiv一年四季均可發生，感染家禽後可能出現無明顯的症狀或非典型的症狀，有時僅表現為產蛋率稍有下降，因此國內養殖業對lpaiv的監測和防控意識薄弱。然而，隨著近些年我國科學家對aiv研究的深入，發現雖然lpaiv不會像hpaiv導致大量家禽死亡，但是lpaiv可以為hpaiv提供相關基因，促使hpaiv不斷變異，甚至使hpaiv獲得跨越種間屏障的能力，可以感染哺乳動物甚至是人類，從而造成嚴重的經濟損失，危害人類公共安全。

近些年來國內逐漸重視對lpaiv的研究，尤其對h4、h6和h9亞型aiv的研究。對h4亞型aiv的研究表明，該病毒呈現幾個特點。首先，h4亞型aiv在我國家禽中分離率越來越高，根據國家禽流感參考實驗室統計，h4亞型aiv在我國南方省份aiv的檢測中呈逐年增加的態勢。其次，h4亞型aiv的分布呈現季節性特點，從lpaivs個體分離率和群體分離率實驗統計來看，在1月份和7月份均達到最低分離率為0.00％，而在6和9月份的分離率在2.00％左右，家鴨中的h4亞型aiv的分離率要遠大於雞和家鵝的分離率。

h6亞型aiv最初在1965年分離自美國的火雞，隨後相繼在野鳥、水禽和陸禽中分離到。歐洲和美國的流行病學監測顯示，h6亞型aiv是監測中分離率較高的亞型之一，同時相對於其他亞型的aiv有更廣的宿主範圍。多個研究顯示，某些h6亞型aiv可以感染小鼠和雪貂，並引起發病。有報導2013年我國臺灣省出現一例人感染h6n1的病例。據報導，近年我國南方地區分離的h6亞型aiv已經具備在豚鼠上的水平傳播能力，顯示該亞型對公共衛生安全的威脅日益增大。

h9n2亞型aiv是危害養禽業的一種重要的傳染病，同時也是對公眾健康具有很大威脅的傳染病之一。1997年的香港h5n1禽流感病毒和2013年的h7n9及h10n8病毒的內部基因來自於h9n2亞型aiv，因此h9n2aiv在新型禽流感病毒的產生中起了至關重要的作用。雖然目前尚無人感染h9n2aiv死亡事件，但是該亞型的病毒在我國流行甚廣，感染哺乳動物的事件也偶有發生，並且病毒在禽群中不斷的發生著遺傳與變異，有可能對人類的公共衛生安全產生威脅。

因此，對lpaiv，尤其是針對h4亞型和/或h6亞型和/或h9亞型lpaiv的三重rt-pcr檢測方案的建立非常必要。

然而，目前國內外針對h4亞型和/或h6亞型和/或h9亞型aiv檢測方法很少，應用較多的鑑定方法是病毒的分離測序、血凝抑制試驗、神經氨酸酶試驗等常規方法，這些實驗雖然準確率高，但是耗時長、費用高，無法滿足疫病暴發時對疫病快速、及時診斷的要求；而且這些檢測方法不能同時確定該病毒是h4、h6或h9亞型aiv。因此，流行病學調查和疫病現場診斷上迫切需要一種能夠快速、準確的鑑別h4、h6或/和h9亞型aiv的檢測方法。

本發明的檢測方案可以一次檢測就可以確定該病毒是h4、h6或h9亞型aiv，而且具有簡便、快速、準確率高、特異性強的特點。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題是快速同時鑑定h4亞型和/或h6亞型和/或h9亞型aiv。

對於上述技術問題，本發明提供以下技術方案來解決：

本發明的技術方案之一是提供快速同時鑑定h4亞型和/或h6亞型和/或h9亞型aiv的三重rt-pct引物組合，包括3對特異性擴增引物，分別為引物對h4-f和h4-r、引物對h6-f和h6-r、引物對h9-f和h9-r或其互補序列或與其至少90％以上一致性的序列，引物對h4-f和h4-r、引物對h6-f和h6-r、引物對h9-f和h9-r的核苷酸序列如下所示：

h4引物h4-f：ccaagrggacattacaa(seqidno：1)；

h4引物h4-r：cytcaacatacttctccag(seqidno：2)；

h6引物h6-f：aacaaytcracaacacaagtg(seqidno：3)；

h6引物h6-r：tcatkctttcagtycccattct(seqidno：4)；

h9引物h9-f：agggccaaggcchcttgtcaa(seqidno：5)；

h9引物h9-r：ggatgttattttgtcaattgcgtt(seqidno：6)。

本發明的另一個技術方案是提供快速同時鑑定h4亞型和/或h6亞型和/或h9亞型aiv的試劑盒，所述試劑盒包含上述的引物組合。

進一步地，上述試劑盒還包含：緩衝液、dntp、dna聚合酶、去離子水。

優選地，上述的dna聚合酶為pfudna聚合酶和taqdna聚合酶，上述的dntp為datp、dttp、dctp、dgtp、dutp。

本發明的又一個技術方案是提供上述的引物組合或試劑盒在快速同時鑑定h4亞型和/或h6亞型和/或h9亞型aiv中應用。

優選地，上述應用的領域為禽類或哺乳動物。

本發明的再一個技術方案是提供一種快速同時鑑定h4亞型和/或h6亞型和/或h9亞型aiv的三重rt-pcr分析方法，包括如下步驟：

(1)從樣品中提取病毒rna；

(2)以上述步驟中的rna為模板，利用通用引物反轉錄出cdna；

(3)以上述步驟中的cdna為模板，利用權利要求1所述的引物組合進行pcr擴增；

(4)擴增後利用電泳法分析，確定所述病毒的類型。

優選地，上述通用引物為流感病毒反轉錄通用引物(unit12)，上述電泳法為瓊脂糖凝膠電泳法。

優選地，上述pcr擴增的反應體系為20μl：5×緩衝液4μl；2.5mmdntp1μl；聚合酶0.5μl，cdna1μl；h4-f，濃度為20pm和h4-r，濃度為20pm，各0.1-1μl；h6-f，濃度為20pm，和h6-r，濃度為20pm，各0.1-1μl；h9-f，濃度為20pm和h9-r，濃度為20pm，各0.1-1μl；去離子水，補至20μl。

優選地，h4-f和h4-r，各0.4μl；h6-f和h6-r，各0.5μl；h9-f和h9-r各0.4μl。

優選地，上述pcr擴增的反應程序為：a.98℃預變性，30s；b.98℃變性，10s；c.55-65℃退火，30s；d.72℃延伸，15s；e.72℃終延伸，3min，其中，步驟b到步驟d，循環30次。

優選地，退火溫度為62℃。

詳細定義：

「dna聚合酶(dnapolymerase)」，dna聚合酶是細胞複製dna的重要作用酶。dna聚合酶，以dna或cdna為複製模板，從將dna由5'端點開始複製到3'端的酶。dna聚合酶的主要活性是催化dna的合成(在具備模板、引物、dntp等的情況下)及其相輔的活性。用於本發明的dna聚合酶的例子有q5高保真dna聚合酶、phusin高保真dna聚合酶、taqdna聚合酶，然而，本領域技術人員根據實際情況，能夠選用合適的dna聚合酶，這些酶也在發明的保護範圍之內。

「互補序列(complementarysequence)」，互補序列是以一條核苷酸鏈為模板，根據鹼基互補規則形成的互補鏈，互補序列也在本發明的保護範圍之內。

「反轉錄(reversetranscription)」，反轉錄是以rna為模板，通過反轉錄酶，合成dna的過程，是dna生物合成的一種特殊方式。

「dntp(deoxy-ribonucleosidetriphosphate)」，脫氧核糖核苷三磷酸的縮寫。是包括datp、dgtp、dttp、dctp等在內的統稱，n是指含氮鹼基，代表變量指代a、t、g、c、u等中的一種。在生物dna合成中，以及各種pcr(rt-pcr、實時pcr)中起原料作用。

「電泳(electrophoresis，ep)」，帶電顆粒在電場作用下，向著與其電性相反的電極移動，稱為電泳。利用帶電粒子在電場中移動速度不同而達到分離的技術稱為電泳技術。用於dna的電泳方法有瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯醯胺凝膠電泳等。本領域技術人員根據實際情況，能夠選用合適的電泳方法，這些方法也在發明的保護範圍之內。

「一致性(identity)」，序列一致性是指在兩個或多個同源序列的每一個位置上多數出現的核苷酸或胺基酸組成的序列。本領域技術人員在本發明公開的引物序列的基礎上，能夠對序列稍作改變而依然取得本發明引物的技術效果，這些稍作改變且與本發明的引物具有高度一致性的引物序列也在本發明的保護範圍之內。

「pcr擴增(polymerasechainreaction)」，聚合酶鏈式反應簡稱pcr。pcr是體外酶促合成特異dna片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火(復性)及適溫延伸等反應組成一個周期，循環進行，使目的dna得以迅速擴增，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點。它不僅可用於基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎研究，還可用於疾病的診斷或任何有dna、rna的地方。

本發明的有益效果是：

(1)本發明根據實驗室近幾年分離的h4、h6和h9亞型aiv的ha基因序列，結合genbank公布的ha基因的保守序列設計出3對特異性引物，具有特異性強的特點，可以同時檢測出h4亞型和/或h6亞型和/或h9亞型aiv，其他亞型流感病毒h2、h8、h10等均為陰性，新城疫病毒、傳染性喉氣管炎病毒、傳染性支氣管炎病毒等也均為陰性；

(2)本發明對檢測方法進行深入優化，具有靈敏度高的特點，通過對樣品倍比稀釋進行靈敏度檢測得出檢測的最低濃度為100eid50/100μl；

(3)具有重複性好的特點，同一樣品在同一反應條件下重複三次作為同一批次內重複試驗，不同樣品在同一反應條件下重複一次作為不同批次間重複試驗，試驗結果相同；

(4)本發明彌補了現有禽流感病毒學鑑定和診斷的技術不足，現有的檢測方法只能對流感病毒是否是h4、h6或h9亞型aiv進行逐一檢測、排查。本發明建立一種快速同時鑑定h4亞型和/或h6亞型和/或h9亞型aiv的三重rt-pcr分析方法，達到一次檢測就可以確定該病毒是h4、h6或h9亞型aiv的目的。與傳統檢測方法相比，本發明實現了對同一樣品同時進行多種不同目的基因的檢測；

(5)本發明樣品用量少，操作簡單，時間短，成本低，需要的檢測儀器簡便，完全可以在基層實驗室推廣使用。

附圖說明

結合附圖對本發明具體實施例的詳細描述，本領域技術人員將會更加明了本發明的上述以及其他目的、優點和特徵。

圖1為三重rt-pcr檢測方法的特異性檢測電泳圖；

圖2為h4亞型aiv的靈敏度檢測電泳圖；

圖3為h6亞型aiv的靈敏度檢測電泳圖；

圖4為h9亞型aiv的靈敏度檢測電泳圖；

圖5為三重rt-pcr檢測方法對臨床樣品檢測電泳圖。

具體實施方式

實施例中所用原料和設備均為本領域技術人員熟知，且均為市場上能夠購買到或容易獲得或製得。

實施例1：pcr引物對設計

根據實驗室近幾年分離的h4、h6和h9亞型aiv的ha基因序列，結合genbank公布的h4、h6和h9亞型的ha基因的保守序列，設計出3對特異性引物，分別為引物對h4-f和h4-r、引物對h6-f和h6-r、引物對h9-f和h9-r，其核苷酸序列如下所示：

實施例2：三重rt-pcr檢測方法的建立及條件優化

一、病毒總rna提取

選取實驗室保存的h4n6、h6n1、h9n2亞型aiv，分別提取病毒總rna。

1、取病毒液250μl，加入750μltrizol，混勻，室溫靜置5min；

2、加入200μl氯仿，顛倒混勻，室溫靜置5min；

3、於4℃下12000轉/min，離心15min；

4、將上清液吸取到新的離心管中，加入500μl異丙醇，顛倒混勻，-20℃靜置20min；

5、於4℃下12000轉/min，離心20min；

6、棄上清液，用75％乙醇1000μl洗一次；

7、於4℃下12000轉/min，離心10min；

8、棄上清液，自然晾乾後加入20μl無rna酶水，將病毒rna溶解。

二、rna反轉錄為cdna

反應體系為20μlrna加入2μlunit12引物，於70℃水浴鍋5min，冰水浴5min後，加入5×緩衝液8μl，dntp混合物4μl，rna酶抑制劑1μl，反轉錄酶1μl，加入無rna酶h2o定容至40μl，於42℃反應1h。

三、加入特異性擴增引物進行pcr檢測

1、三重rt-pcr反應體系優化

三重rt-pcr反應體系為20μl，5×緩衝液4μl，2.5mmdntp1μl，dna聚合酶(phudna聚合酶)0.5μl，cdna1μl，h4-f(濃度為20pm)和h4-r(濃度為20pm)各0.1μl、0.2μl、0.3μl、0.4μl、0.5μl、0.6μl、0.7μl、0.8μl、0.9μl或1μl，h6-f(濃度為20pm)和h6-r(濃度為20pm)各0.1μl、0.2μl、0.3μl、0.4μl、0.5μl、0.6μl、0.7μl、0.8μl、0.9μl或1μl，h9-f(濃度為20pm)和h9-r(濃度為20pm)各0.1μl、0.2μl、0.3μl、0.4μl、0.5μl、0.6μl、0.7μl、0.8μl、0.9μl或1μl，用去離子水補至20μl。

2、三重rt-pcr反應程序優化

三重rt-pcr反應程序為：98℃預變性30s；98℃變性10s；55-65℃(設置梯度55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃或65℃)退火30s；72℃延伸15s，共30個循環；最後72℃終延伸3min。

3、取pcr產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，並在紫外光下拍照，分析記錄結果。

四、結果判定方法及分析

結果判定方法：h4亞型aiv特異性擴增引物的擴增產物大小為406bp，若待檢樣品中含有400bp左右的dna片段，則此濃度的引物和退火溫度能夠擴增h4亞型aiv的ha，反之則此濃度的引物和退火溫度不能擴增h4亞型aiv的ha；h6亞型aiv特異性擴增引物的擴增產物大小為600bp，若待檢樣品中含有600bp左右的dna片段，則此濃度的引物和退火溫度能夠擴增h6亞型aiv的ha，反之則此濃度的引物和退火溫度不能擴增h6亞型aiv的ha；h9亞型aiv特異性擴增引物的擴增產物大小為490bp，若待檢樣品中含有500bp左右的dna片段，則此濃度的引物和退火溫度能夠擴增h9亞型aiv的ha，反之則此濃度的引物和退火溫度不能擴增h9亞型aiv的ha。

結果表明，實施例1中的引物對h4可以用於鑑定h4亞型aiv，引物對h6可以用於鑑定h6亞型aiv，引物對h9可以用於鑑定h9亞型aiv。最佳反應體系(20μl)：5×緩衝液4μl，2.5mmdntp1μl，酶0.5μl，cdna1μl，h4-f(濃度為20pm)和h4-r(濃度為20pm)各0.4μl，h6-f(濃度為20pm)和h6-r(濃度為20pm)各0.5μl，h9-f(濃度為20pm)和h9-r(濃度為20pm)各0.4μl，用去離子水補至20μl。三重rt-pcr最佳反應程序為：98℃預變性30s；98℃變性10s；62℃退火30s；72℃延伸15s，共30個循環；最後72℃終延伸3min。

實施例3：rt-pcr檢測方法的特異性檢測

一、總rna提取

選取實驗室保存的h2n3、h4n6、h6n1、h8n4、h9n2、h10n3亞型aiv、新城疫病毒、傳染性喉氣管炎病毒、傳染性支氣管炎病毒，分別提取病毒總rna。方法同實施例2。

二、rna反轉錄為cdna

方法同實施例2。

三、三重rt-pcr檢測

1、模板的組成

由h4n6、h6n1和h9n2亞型aiv的cdna溶液(體積比為1:1:1)組成混合溶液1、由h4n6和h6n1亞型aiv的cdna溶液(體積比為1:1)組成混合溶液2、由h4n6和h9n2亞型aiv的cdna溶液(體積比為1:1)組成混合溶液3、由h6n1和h9n2亞型aiv的cdna溶液(體積比為1:1)組成混合溶液4、h4n6亞型aiv的cdna溶液稱為溶液5、h6n1亞型aiv的cdna溶液稱為溶液6、h9n2亞型aiv的cdna溶液稱為溶液7、h2n3亞型aiv的cdna溶液稱為溶液8、h8n4亞型aiv的cdna溶液稱為溶液9、h10n3亞型aiv的cdna溶液稱為溶液10、新城疫病毒cdna溶液稱為溶液11、傳染性喉氣管炎病毒cdna溶液稱為溶液12、傳染性法氏囊病毒cdna溶液稱為溶液13、去離子水稱為溶液14。

2、加入特異性擴增引物進行pcr檢測

方法同實施例2中的優化後的rt-pcr反應體系和反應條件。

四、電泳

取pcr產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖1所示。分析如下，泳道1為混合溶液1，泳道2為混合溶液2，泳道3為混合溶液3，泳道4為混合溶液4，泳道5為溶液5、泳道6為溶液6、泳道7為溶液7、泳道8為溶液8、泳道9為溶液9、泳道10為溶液10、泳道11為溶液11、泳道12為溶液12、泳道13為溶液13、泳道14為溶液14。將目的片段切割後，送至測序公司測序。

結果表明，所有含h4、h6和/或h9亞型aiv模板的樣品均能擴增出對應的406bp、600bp和/或490bp的目的條帶，而其它模板在相同位置無任何條帶。對目的片段測序，對序列結果分析顯示與引物設計模板的基因對應片段完全一致。這一結果表明，本發明的三重rt-pcr方法檢測h4、h6和/或h9亞型aiv具有強的特異性。

實施例4：rt-pcr檢測方法的靈敏度檢測

一、rt-pcr檢測方法對h4n6亞型aiv的靈敏度檢測

1、h4n6亞型aiv各種稀釋液的製備

取h4n6亞型aiv測定病毒含量eid50，將病毒稀釋為106eid50/100μl，在此基礎上進行10倍倍比稀釋，使各稀釋液的病毒含量分別為105eid50/100μl、104eid50/100μl、103eid50/100μl、102eid50/100μl、101eid50/100μl、100eid50/100μl、10-1eid50/100μl。選擇104eid50/100μl-10-1eid50/100μl區間檢測rt-pcr檢測方法的靈敏性。

2、總rna提取

取104eid50/100μl-10-1eid50/100μl共6個區間樣品稀釋液，分別提取總rna，方法同實施例2。

3、rna反轉錄為cdna

方法同實施例2。

4、加入特異性擴增引物進行pcr檢測

所用到的特異性擴增引物對h4-r和h4-f。方法同實施例2中的優化後的rt-pcr反應體系和反應條件。

5、電泳

取pcr產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖2所示。經分析，h4n6亞型aiv樣品稀釋至101eid50/100μl及以上病毒稀釋液可以觀察到兩條大小分別在400bp左右的條帶。結果表明，本發明的檢測方法對h4n6亞型aiv的檢測靈敏度可達到101eid50/100μl。

二、rt-pcr檢測方法對h6n1亞型aiv的靈敏度檢測

1、h6n1亞型aiv各種稀釋液的製備

h6n1亞型aiv的稀釋方法同步驟一中的1。

2、總rna提取

取104eid50/100μl-10-1eid50/100μl共6個區間樣品稀釋液，分別提取總rna，方法同實施例2。

3、rna反轉錄為cdna

方法同實施例2。

4、加入特異性擴增引物進行pcr檢測

所用到的特異性引物對是h6-r和h6-f。方法同實施例2中的優化後的rt-pcr反應體系和反應條件。

5、電泳

取pcr產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖3所示。經分析，h6n1亞型aiv的樣品稀釋至100eid50/100μl及以上病毒稀釋液可以觀察到兩條大小分別在600bp左右的條帶。結果表明，檢測方法對h6n1亞型aiv的檢測靈敏度可達到100eid50/100μl。

三、rt-pcr檢測方法對h9n2亞型aiv的靈敏度檢測

1、h9n2亞型aiv各種稀釋液的製備

h9n2亞型aiv的稀釋方法同步驟一中的1。

2、總rna提取

取104eid50/100μl-10-1eid50/100μl共6個區間的樣品稀釋液，分別提取總rna，方法同實施例2。

3、rna反轉錄為cdna

方法同實施例2。

4、加入特異性擴增引物進行pcr檢測

所用到的特異性擴增引物對為h9-r和h9-f。方法同實施例2中的優化後的rt-pcr反應體系和反應條件。

5、電泳

取pcr產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖4所示。經分析，h9n2亞型aiv的樣品稀釋至100eid50/100μl及以上病毒稀釋液可以觀察到兩條大小分別在500bp左右的條帶。結果表明，檢測方法對h9n2亞型aiv的檢測靈敏度可達到100eid50/100μl。

實施例5：待檢病料(病禽的喉拭子和洩殖腔拭子)的三重rt-pcr檢測

1、樣品的製備

採集病禽的喉拭子和洩殖腔拭子共計100份，分別標號為y1-y100，將拭子浸潤到pbs緩衝液中，在振蕩器上充分混勻，離心，將上清液轉移至無菌的離心管中，編號備用。

2、總rna提取

取250μl上清液，加入750μltrizol，提取病毒總rna，方法同實施例2。

3、rna反轉錄為cdna

方法同實施例2。

4、加入擴增引物進行pcr檢測

所用到的特異性引物對為h4、h6和h9。方法同實施例2中的優化後的rt-pcr反應體系和反應條件。

5、電泳

取pcr產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，2份樣品為h4、h6和h9亞型aiv陽性，4份樣品為h4和h9亞型aiv陽性，5份樣品為h6和h9亞型aiv陽性，2份樣品為h4和h6亞型aiv陽性，6份樣品為h4亞型aiv陽性，7份樣品為h6亞型aiv陽性，12份樣品為h9亞型aiv陽性。這一實驗結果與實驗室的血清學結果一致。同時，將擴增的目的片段送到測序公司進行測序，測序結果與rt-pcr結果一致。

瓊脂糖凝膠電泳鑑定結果如圖5，m為標記物，泳道1-20為編號y21-y40的樣品，泳道21為去離子水。泳道2和3(編號y22和y23)分別擴增出一條大小為406bp的條帶，為h4亞型aiv；泳道5(編號y25)擴增出一條大小為490bp的條帶，為h9亞型aiv；泳道6(編號y26)擴增出一條大小為600bp的條帶，為h6亞型aiv；泳道7(編號y27)擴增出三條大小為600、490和406bp的條帶，為h4、h6和h9亞型aiv混合感染；泳道9(編號y29)擴增出兩條大小為490和406bp的條帶，為h4和h9亞型aiv混合感染；泳道10(編號y30)擴增出兩條大小為600和490bp的條帶，為h6和h9亞型aiv混合感染；泳道14和15(編號y34和y35)擴增出兩條大小為600和406bp的條帶，為h4和h6亞型aiv混合感染；其餘樣品和陰性對照為陰性。

結果表明，利用本發明的三重rt-pcr可以準確鑑定h4、h6和/或h9亞型的aiv。

以上所述僅是本發明的具體實施例而已，並非對本發明做任何形式上的限制，雖然本發明已以具體實施例揭露如上，然而並非用以限定本發明，任何熟悉本專業的技術人員，在不脫離本發明技術方案的範圍內，當可利用上述揭示的技術內容作出些許更動或修飾為等同變化的等效實施例，但凡是未脫離本發明技術方案的內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬於本發明技術方案的範圍內。

序列表

聊城大學

h4亞型、h6亞型和h9亞型aiv三重rt-pcr引物組合、試劑盒及其應用

6

patentinversion3.5

1

17

dna

人工序列

misc_特徵

(6)..(6)

r是a或g

1

ccaagrggacattacaa17

2

19

dna

人工序列

misc_特徵

(2)..(2)

y是c或t

2

cytcaacatacttctccag19

3

21

dna

人工序列

misc_特徵

(6)..(6)

y是c或t

misc_特徵

(9)..(9)

r是a或g

3

aacaaytcracaacacaagtg21

4

22

dna

人工序列

misc_特徵

(5)..(5)

k是g或t

misc_特徵

(14)..(14)

r是a或g

4

tcatkctttcagtycccattct22

5

21

dna

人工序列

misc_特徵

(13)..(13)

h是a、t或c

5

agggccaaggcchcttgtcaa21

6

24

dna

人工序列

6

ggatgttattttgtcaattgcgtt24