抑制端粒酶活性的核酶基因hTERT－5'RZcDNA、重組載體與核酶的製作方法

2023-05-04 19:08:01 1

專利名稱：抑制端粒酶活性的核酶基因hTERT－5'RZ cDNA、重組載體與核酶的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因工程技術領域，具體地說涉及抑制端粒酶活性的核酶基因、含該基因的重組載體及轉錄產物核酶和核酶的藥學用途。
背景技術：
端粒是真核生物染色體末端的一種保護性結構，正常體細胞由於末端複製問題，端粒隨細胞分裂而進行性縮短。端粒酶(telomerase)是一種特殊的核糖核酸蛋白質聚合物，它能以自身RNA作為模板合成端粒，以彌補複製造成的端粒縮短，使細胞不會因端粒耗盡而出現凋亡。另一方面，端粒酶是細胞周期重要的調控因素之一，影響著細胞周期的進程。腫瘤細胞由於端粒酶的激活，一方面維持了端粒的長度，使細胞獲得永生；另一方面使細胞周期縮短，生長變快。大量的研究已表明，端粒酶的活化與癌症的發生密切相關，端粒酶已成為抗腫瘤治療的一個新靶點。
核酶是具有一定結構的小分子RNA，能定點切割靶mRNA，從而抑制基因表達。劉柏林、屈藝等在「Ribozyme抑制端粒酶活性的腫瘤基因治療」(見《中國科學(C輯)》第32卷第2期，P159-164，2002年4月)一文中公開了一種抑制端粒酶活性的teloRZ核酶，將該核酶導入體外培養腫瘤細胞和裸鼠移植瘤，可定點切割hTR(人的端粒酶RNA，即human telomerase RNA)，使之喪失合成端粒DNA的模板功能，從而抑制腫瘤細胞和腫瘤組織的生長。因此，開發高效、特異抑制端粒酶活性的核酶，是人類攻克癌症疾病的一項新戰略和重要措施。
屈藝等在「端粒酶逆轉錄酶核酶hTERT-5』RZ抑制Hela細胞端粒酶活性的實驗研究」(見《中華醫學遺傳學雜誌》2002年10月第19卷第5期，P389-392)一文中公開了端粒酶逆轉錄酶核酶hTERT-5』RZ具有抑制Hela細胞端粒酶活性的效力，且其端粒酶活性抑制效力優於teloRZ核酶，但未公開端粒酶逆轉錄酶核酶基因hTERT-5』RZ cDNA與端粒酶逆轉錄酶核酶hTERT-5』RZ的結構等關鍵技術內容，致使所屬技術領域的技術人員無法實施。

發明內容
本發明的目的在於提供一種抑制端粒酶活性的核酶基因——端粒酶逆轉錄酶核酶基因hTERT-5』RZ cDNA、含該基因的重組載體和重組載體轉錄的端粒酶逆轉錄酶核酶hTERT-5』RZ，以實現核酶作為腫瘤基因治療藥物的應用。
現有研究成果表明人類端粒酶由RNA和蛋白質組成，它的3個主要成分包括人端粒酶RNA(human Telomerase RNA，hTR)，端粒酶相關蛋白(Telomerase Protein 1，TPI)和端粒酶逆轉錄酶(human Telomerase Reverse Transcriptase，hTERT)。hTR和hTERT與端粒酶活性具有密切相關性，hTERT是端粒酶的催化亞基和活性中心，是決定端粒酶活性的關鍵因素(見Kim NW，Piatyszek MA，Prowse KR，et al.Specific association of humantelomerase activity with immortal cells and cancer.Science，1994，2662011-2015及Nakamura TM，Morin GB，Chapman KB，et al.Telomerase catalytic subunit homologs fromfission yeast and human.Science，1997，277955-959.)。
本發明的技術方案針對端粒酶逆轉錄酶hTERT mRNA 5』端區GUC切點設計合成端粒酶逆轉錄核酶基因，核酶基因由兩條40nt的互補鏈組成。為便於構建重組載體，互補鏈兩端分別設有內切酶位點序列和2～3個保護鹼基，共長57bp。將兩條互補單鏈退火形成核酶基因，該核酶基因命名為hTERT-5』RZ cDNA，其核苷酸序列如附圖1所述。將合成的核酶基因hTERT-5』RZ cDNA插入兼具體外轉錄功能的真核表達載體pcDNA3.1(+)的EcoRI-XhoI位點，即獲重組載體，該重組載體命名為pcDNA3.1 hTERT-5』RZ。將重組質粒pcDNA3.1 hTERT-5』RZ用XhoI和EcoRI酶切使之線性化，採用T7/SP6體外轉錄試劑盒，經T7RNA聚合酶催化即可轉錄出本發明所述的端粒酶逆轉錄酶核酶，該核酶命名為hTERT-5』RZ，其二級結構如圖3所述。核酶hTERT-5』RZ和核酶teloRZ組合可形成雙核酶，核酶hTERT-5』RZ與核酶teloRZ的質量比為1∶1。
將本發明所述重組載體pcDNA3.1 hTERT-5』RZ轉染至人宮頸癌Hela細胞株並進行端粒酶活性檢測。檢測結果表明，導入核酶hTERT-5』RZ後Hela細胞端粒酶活性顯著下降，其端粒酶活性抑制效力優於TeloRZ核酶，大約為TeloRZ核酶的兩倍左右。
將核酶hTERT-5』RZ和雙核酶用於治療人肝癌裸鼠移植瘤的實驗，實驗結果表明，核酶hTERT-5』RZ和雙核酶均能有效地抑制腫瘤生長。


圖1是本發明所述核酶基因hTERT-5』RZ cDNA的核苷酸序列；圖2是將合成的核酶基因hTERT-5』RZ cDNA插入真核表達載體pcDNA3.1(+)構建重組載體的過程示意圖；
圖3是核酶hTERT-5』RZ的二級結構圖；圖4是重組載體的電泳鑑定圖；圖5是端粒酶活性檢測的聚丙烯醯胺凝膠電泳圖，圖中，1表示第1組(hTERT-5』RZ+teloRZ)，2表示第2組(hTERT-5』RZ)，3表示第3組(teloRZ)，4表示第4組(control RNA)，5表示陰性對照(lysis-buffer)。
具體實施例方式
實施例1核酶基因hTERT-5』RZ cDNA的設計、合成針對端粒酶逆轉錄酶hTERT mRNA 5』端區GUC切點，藉助計算機輔助設計成核酶基因序列，核酶基因由兩條40nt的互補鏈組成(如圖1所示)。為了便於克隆，在核酶基因的5』和3』末端分別設有EcoRI和XhoI酶切點的序列，並加2～3個保護鹼基。採用固相亞磷醯胺三酯法(Pon R.T.，Buck G.A.，Hager K.M.et al.DeoxynucleosidephosphoramidatesA new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis.Tetrahedron Lett.221859-1862，1981)，用ABI 3900高通量DNA合成儀(PE公司、BIO-RAD公司有售)合成。使用的固相支持物為可控微孔玻璃珠(購自NEW Life Science公司)，單體為核苷亞磷醯胺(購自PE Applied Biosystems公司)。從90年代起，國內外有關核苷酸序列的合成均已專業化、商品化。因此，也可將所設計的核酶基因序列交由有關專業公司合成(本發明中的核酶基因hTERT-5』RZ cDNA曾交由GIBCO-BRL生命技術公司合成)。
實施例2重組載體的構建構建重組載體的過程如圖2所示。取實施例1合成並純化的單鏈核酶基因hTERT-5』RZ cDNA片段各33μg，退火成互補雙鏈。用EcoRI和XhoI(均購自TakaRa公司)雙酶切、凝膠電泳回收大片段。載體pcDNA3.1(+)(可從Invitrogen公司購買)，用EcoRI和XhoI酶切後，電泳回收大片段。載體與核酶基因按摩爾比1∶4用DNA Ligationkit ver.2(購自TakaRa公司)方法連接，轉化感受態菌JM109(購自TakaRa公司)，用氨苄青黴素篩選出轉化子。用柱式抽提試劑盒(購自TakaRa公司)提取質粒，酶切鑑定重組子並測序，得到重組質粒pcDNA3.1 hTERT-5』RZ。隨機挑選6個pcDNA3.1 hTERT-5』RZ菌落擴增培養並抽提質粒，經EcoRI和XhoI酶切後，10％聚丙烯醯胺(PAGE，系Fluka公司產品)凝膠電泳均呈現46bp條帶(見圖4)，與預期的核酶基因hTERT-5』RZcDNA片段大小一致。挑選克隆1進行測序，結果與設計合成的核酶基因hTERT-5』RZcDNA序列完全一致。
實施例3體外轉錄反應獲取核酶hTERT-5』RZ重組質粒pcDNA3.1 hTERT-5』RZ用上述XhoI和EcoRI酶切使之線性化，採用T7/SP6體外轉錄試劑盒(購自寶靈曼公司)，經T7RNA聚合酶(購自GIBCO-BRL公司)催化以轉錄出相應的小片段核酶hTERT-5』RZ，用紫外檢測法進行定量，得率為3.5μg RNA/μg質粒。核酶hTERT-5』RZ的二級結構如圖3所示。
實施例4雙核酶的製備將實施例3所獲取的核酶hTERT-5』RZ與核酶teloRZ按質量比1∶1配料，即核酶hTERT-5』RZ10μg、核酶teloRZ10μg與40μl脂質體Lipofectamine(購自Roche公司)混合即可製成雙核酶hTERT-5』RZ-teloRZ。
核酶teloRZ按劉柏林、屈藝等在「Ribozyme抑制端粒酶活性的腫瘤基因治療」(見《中國科學(C輯)》第32卷第2期，P159-164，2004年4月)一文中公開的方法製備。
實施例5細胞轉染在6孔板中接種5×104個人宮頸癌Hela細胞/孔(人宮頸癌Hela細胞可從ATCC公司購買)，用1640培養基(購自GIBCO-BRL公司)常規培養2天後，換用OPTi-MEM培養基(購自Roche公司)2ml培養。實驗分為4組，第1組為10μg hTERT-5』RZ+10μgteloRZ+40μl Lipofectamine；第2組為15μg hTERT-5』RZ+40μl Lipofectamine；第3組為15μg teloRZ+40μl Lipofectamine；第4組為對照，加入空載體pcDNA-3.1(可從Invitrogen公司購買)/XhoI轉錄合成的小片段RNA與40μl Lipofectamine。上述各實驗組中的脂質體Lipofectamine(購自Roche公司)與小片段核酶RNA(溶於160μl OPTi-MEM中)混合後，室溫靜置20min，滴入6孔板培養液中，6小時後改用含10％胎牛血清的1640培養基培養。每24h重複轉染一次，72h後收集細胞，用於端粒酶活性檢測。
實施例6端粒酶活性檢測離心收集HeLa細胞，並用無K+、Ca2+的PBS(購自GBC-BRL公司)洗二次，加入100μl TRAP-lysis buffer[10mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、1mmol/L MgCl2、1mmol/L EGTA、0.1mmol/L PMSF、5mmol/L β-硫基乙醇，0.5％CHAPs，10％甘油]，充分混勻後冰上放置30min，12000r/min 4℃離心20min，收集上清液，按說明書方法進行考馬斯亮蘭染色，於紫外分光光度計(751-GW分光光度計，惠普上海分析儀器有限公司，產品編號910389)波長595nm處測定蛋白質濃度並稀釋為2μg/μl，-70℃凍存備用。採用kim報導的TRAP法(見Kim NW，Piatyszek MA，Prowse KR，et al.Specific association of human telomeraseactivity with immortal cells and cancer.Science，1994，2662011-2015)，用端粒酶檢測試劑盒(購自Oncogene公司)進行端粒酶活性測定。各實驗組分別取2μg蛋白提取物，加反應液[5μlTRAP-buffer，50umol/L dNTP，1μl TS引物，PCR-Grade Water]至終體積50μl。室溫孵育30min，以完成端粒酶介導的在TS引物3』末端進行的端粒延伸反應。97℃ 10min滅活端粒酶，在冰上向反應體系加入1μl Primer Mix和2u Taq酶。在PCR擴增儀(PERKINELMER CETUS公司)中進行35次循環擴增，循環參數94℃，30s；50℃，30s；72℃，90s，最後一次循環再在72℃延長10min。並以裂解緩衝液替代細胞裂解液作為陰性對照，取40μl PCR產物行12％非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳分離，SYBR Green染料(購自FMCBioproducts公司)染色，36bp帶顯示定量內標，梯度帶顯示端粒酶活性。用凝膠掃描分析儀(GIS-1000數碼凝膠圖象分析系統)對電泳膠條帶灰度進行掃描計數，36bp帶灰度計為A1，端粒酶梯度帶灰度總計為A2，則A2/A1為細胞端粒酶相對量。
端粒酶活性檢測的聚丙烯醯胺凝膠電泳結果如圖5所示，各實驗組經掃描定量分析所得到的HeLa細胞端粒酶相對量見表1。
表1

從圖5和表1可以看出，導入核酶hTERT-5』RZ後HeLa細胞端粒酶活性顯著下降，其端粒酶抑制效力明顯優於核酶teloRZ。兩種核酶的混合物對端粒酶活性的抑制效果優於單個核酶。
實施例7核酶治療人肝癌裸鼠移植瘤1.材料與方法1.1試劑與材料人肝癌細胞株SMMC-7721(可從ATCC公司購買)為本室傳代培養。BALB/C裸鼠(重約20g/只)購於四川省抗生素研究所。
RNA轉染試劑TransMessangerTMTransfection Reagent為Qiagen公司產品。
1.2SMMC-7721裸鼠移植瘤的建立與程控光照飼養構建肝癌裸鼠移植瘤，瘤塊至55mm3大小時用於實驗。
1.3用藥實驗將裸鼠分為4組，每組6隻(雌雄各半)。第1組為對照組，每日瘤體內多點注射5μg/只對照RNA(5μg Control RNA+10μl Enhancer R+TransMessanger Reagent 25μl)，第2組為teloRZ組，每日瘤體內多點注射5μg/只teloRZ(5μg teloRZ+10μl EnhancerR+TransMessanger Reagent 25μl)，第3組為hTERT-5』RZ組，每日瘤體內多點注射5μg/只hTERT-5』RZ(5μg hTERT-5』RZ+10μl Enhancer R+TransMessanger Reagent 25μl)，第4組為雙核酶組，每日瘤體內多點注射5μg/只雙核酶(5μg雙核酶hTERT-5』RZ與teloRZ的質量比為1∶1+10μlEnhancer R+TransMessanger Reagent 25μl)。連續注射14天，14天後統一用斷頸法處死動物，測量腫瘤溼重。
2.結果用藥14天後核酶對裸鼠移植瘤生長的影響見表2。
表2

從表2可以看出，注射核酶的三組裸鼠其瘤塊生長速度明顯慢於對照組裸鼠的瘤塊生長速度。其中，hTERT-5』RZ組、雙核酶組的瘤塊小於teloRZ組。hTERT-5』RZ組的抑瘤率為61％、雙核酶組的抑瘤率為63％、teloRZ組的抑瘤率51％。表明，核酶hTERT-5』RZ和雙核酶較核酶teloRZ能更好地抑制腫瘤生長。
權利要求
1.一種抑制端粒酶活性的核酶基因hTERT-5』RZ cDNA，其特徵在於它具有附圖1所述的核苷酸序列。
2.一種重組載體，其特徵在於它含有權利要求1所述的核酶基因hTERT-5』RZ cDNA插入序列。
3.一種抑制端粒酶活性的核酶hTERT-5』RZ，其特徵在於它具有附圖3所述的結構。
4.一種抑制端粒酶活性的雙核酶，其特徵在於主要由核酶hTERT-5』RZ和核酶teloRZ組成，核酶hTERT-5』RZ與核酶teloRZ的質量比為1∶1。
全文摘要
本發明公開了一種抑制端粒酶活性的核酶基因hTERT－5』RZ cDNA、含該基因的重組載體和重組載體轉錄的核酶hTERT－5』RZ。核酶基因由兩條40nt的互補鏈組成，將兩條互補單鏈退火即形成核酶基因，其核苷酸序列如附圖1所述。將核酶基因hTERT－5』RZcDNA插入載體pcDNA3.1(+)的EcoRI－XhoI位點，即獲重組質粒pcDNA3.1 hTERT－5』RZ。將重組質粒pcDNA3.1 hTERT－5』RZ用XhoI和EcoRI酶切使之線性化，採用T
文檔編號C12N9/22GK1597958SQ200410040520
公開日2005年3月23日 申請日期2004年8月24日 優先權日2004年8月24日
發明者劉柏林, 屈藝, 劉菽秋 申請人:四川大學