用於檢測nlrp7基因的基因晶片、檢測試劑和試劑盒的製作方法

2023-05-04 16:30:11

專利名稱：用於檢測nlrp7基因的基因晶片、檢測試劑和試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種基因晶片、其檢測試劑和試劑盒，尤其涉及一種用於檢測NLRP7基因的基因晶片、檢測試劑和試劑盒。
背景技術：
葡萄胎(Hydatidiform Mole，HM)是最常見的婦科疾病，是一種異常的人類妊娠，以絨毛間質水腫、滋養細胞增生同時缺乏胚胎發育或者異常的胚胎發育為特徵。葡萄胎最常見的是散發性，而非復發性，在南美葡萄胎的發生率為每1000-1500次妊娠I次，但在拉丁美洲，中東及遠東有更高的發生率。我國和東亞地區是葡萄胎的高發區，發生率為北美和歐洲國家的7-10倍，中國以浙江省為最高，為每120-700次妊娠I次；葡萄胎患者妊娠結局令人擔憂，在有一次葡萄胎經歷的婦女中，根據不同的人群有1-6%會再患葡萄胎，有10-20%會罹患自然流產等不良妊娠生育結局；二次葡萄胎後則有20-30%的再患葡萄胎概率。因此葡萄胎不是獨立的疾病，它同樣適合任何形式的生育結局不良。復發性的生育結局不良對年輕夫婦的身心打擊是巨大的；同時也造成消耗大量的衛生資源(在北美，由於反覆就診及大量的實驗室檢查，使得每對夫婦至少化費50，000美元，在中國同樣費用高昂)；此外尚有15-20%的葡萄胎會惡變為妊娠滋養細胞腫瘤，甚至危及患者的生命。人們從未在動物身上發現過葡萄胎，因此通過建立動物模型獲悉數據的可能性很小，先前有關葡萄胎發生的分子機制的研究集中在家族性復發性葡萄胎(FamilialRecurrent Mole, FRM), FRM是指在一個家系中兩個或以上的家族成員反覆發生葡萄胎，屬孟德爾常染色體隱性遺傳性疾病，其確切的發生率不明，但比較罕見。我們的合作者SLIM團隊率先對FRM進行了遺傳學研究，首次報導了 FRM染色體雙親來源的遺傳背景，並確定了其遺傳易感基因的侯選區域定位於染色體19ql3.3—19ql3.4區域(5) ；2006年，SLIM團隊通過基因克隆與定位的方法發現了第一個與復發性葡萄胎及不良生育結局相關的致病基因NLRP7基因(其基因序列如 SEQ ID N0.1所示)，至今，多個研究機構報導了在不同人種的復發性葡萄胎患者中已發現62個不同的NLRP7基因突變位點(見INFEVERS，http://fmf.1gh.cnrs.fr/ISSAID/infevers/),在SLIM實驗室,大約60%的復發性葡萄胎患者存在NLRP7基因突變。證明了 NLRP7基因是復發性葡萄胎重要的發病相關基因。這些變異包括終止子的改變，重排，小的缺失，插入，接合子改變及無義突變。NLRP7基因雙位點突變導致二倍體雙親來源的葡萄胎。至今，來自不同實驗室已報導了 39例NLRP7基因雙位點突變所致葡萄胎均是二倍體雙親來源的葡萄胎。NLRP7基因單位點突變可致各種核型葡萄胎。NLRP7基因突變導致合子後分裂異常。NLRP7基因突變與各種類型的妊娠丟失相關。最近研究發現，大約13%的散發性葡萄胎患者存在NLRP7基因突變，大約8%的復發性流產患者存在NLRP7基因突變，同時在一些普通人群中偶見NLRP7基因非同義突變，這些人常為復發性妊娠丟失的易感人群。男性NLRP7基因突變不改變生育結局。、有關NLRP7基因功能研究:NLRP7是胞漿蛋白，包含了三個主要的功能區域，是NLRP7家族14個成員中的一員，屬於CATERPILIER家族的亞家族，CATERPILIER被認為與主動免疫、凋亡和病原誘導的炎症的細胞內調節有關。至今NLRP7家族中已有5個基因發現與數種人類疾病密切相關，全都涉及多系統的感染；NLRP基因族被認為介導激活宿主先天免疫系統對所謂的抗原相關分子模式(PAMPs)諸如細菌來源的產物作出反應；NLRP蛋白募集其它銜接蛋白行成蛋白複合物形成炎症小體，炎症小體激活前CASPASE-1使其在在IL-1 β 116位天冬氨酸處切開才能使IL-1 β成為成熟形式並促使其分泌到細胞外；分泌的IL-1 β介導激活其它的細胞因子並募集淋巴細胞到感染部位對抗病原微生物及引起組織損傷。同樣的，作為NLRP7家族成員之一，在唯一的一個體外研究中發現NLRP7基因抑制IL-1 β及CASPASE-1前體的加工，並且具有抑制Caspase-1依賴性的IL-1 β的分泌的作用；革蘭氏陰性菌細胞壁成份脂多糖(LPS)與IL-1 β可以增加外周血單個核細胞的NLRP7基因表達，NLRP7基因表達增強可以反饋調節抑制了 IL-1 β的分泌，因此NLRP7可以抑制LPS誘導的IL-1 β的分泌。目前Slim團隊體外研究發現NLRP7基因突變者外周血淋巴細胞對各種炎症刺激受損及分泌較低水平的IL-1和TNF，推測炎症反應受損後使得胚胎發育停止或異常，機體耐受絨毛水腫變性及葡萄胎的發生。發明人通過測序及比對分析對300例中國人種散發性葡萄胎與300例中國人種無不良生育史的婦女進行NLRP7基因突變篩查，發現20個突變位點，14個變異位點，NLRP7基因突變變異率為11.33%，NLRP7基因共有11個外顯子，突變變異位點集中分布在外顯子4,2,3,5,6,偶發在外顯子9，14例NLRP7基因突變位於外顯子4 (14/20)，5例NLRP7基因突變位於外顯子2 (5/20)， I例NLRP7基因突變位於外顯子6 (1/20)。同時對35例中國人種復發性妊娠丟失(其中至少一次是葡萄胎)患者進行NLRP7基因突變篩查，發現了 11位患者(31.4%)存在NLRP7基因突變，7例患者為雙位點突變，4例患者為單位點突變，僅2例患者為純合子突變；其中23例為復發性葡萄胎患者，11例患者(48%)發現至少一個位點的NLRP7基因突變。與已發表的數據相比，中國人種葡萄胎的發生具有以下三個特點:1.中國人種復發性葡萄胎NLRP7基因突變率48%明顯低於另外兩個亞洲種族。巴基斯坦RHM患者(11例)NLRP7基因突變率81%，而印度人種RHM患者(13例)NLRP7基因突變率為84% ;雖然缺乏NLRP7基因突變不能絕對排除NLRP7基因的突變，如發生在內含子的變異及促進子的變異，或者大的缺失，重排和複製有時不能用常規的DNA測序手段發現變異；2.中國人種復發性葡萄胎患者僅20%為純合子突變，明顯低於巴基斯坦RHM患者88%和印度RHM患者72%，中國人種存在著較低的同源率，可能與國家大，人口多，人群遷移機會多相關。葡萄胎髮病具有種族與地域的差異，種族差異主要是遺傳差異，這也證明遺傳因素在葡萄胎髮病中起重要作用，在不同群體中可能存在發病機制上的差異，提示在中國人中開展葡萄胎易感基因和發病機制的研究有著其他人種同類研究不可替代的意義。

發明內容
本發明的目的在於針對現有技術的不足，提供一種用於檢測NLRP7基因的基因晶片、檢測試劑和試劑盒。本發明的目的是通過以下技術方案來實現的:一種用於檢測NLRP7基因的基因晶片，它包括固相載體和合成在該載體上的寡核苷酸探針等，所述寡核苷酸探針是針對檢測與葡萄胎相關的NLRP7基因的18個SNP位點所在的核苷酸序列；所述的18個SNP位點具有SEQ ID N0.182-199所示的核苷酸序列；所述寡核苷酸探針具有SEQ ID N0.2-145所示的核苷酸序列。一種用於檢測樣本中NLRP7基因的檢測試劑，它包括上述的基因晶片和18對用於擴增樣本中各SNPs的PCR引物等，所述PCR引物具有SEQ ID N0.146-181所示的核苷酸序列。一種用於檢測樣本中NLRP7基因的試劑盒，它包括上述的檢測試劑、一陰性對照樣本和一陽性對照樣本等，所述陰性對照樣本為無菌純水，所述陽性對照樣本為確認的由SEQ ID N0.1-18中某一 DNA片段突變的DNA片段。本發明的有益效果是:本發明檢測NLRP7基因的SNP分型晶片、檢測試劑和試劑盒可快速、準確檢測臨床樣本中的NLRP7基因各個相關SNPs位點。該檢測系統通量大、靈敏度高，對於葡萄胎的臨床診斷和高危人群早期篩查、早期預防幹預具有重要的意義，可廣泛用於臨床高效篩查葡萄胎高 危人群。


圖1為基因晶片的一般製作流程 圖2為PCR擴增流程圖。
具體實施例方式晶片合成:採用原位合成檢測探針的技術在晶片上合成與檢測位點序列互補的探針，檢測位點包含了 A，T，C，G四種鹼基類型的探針。具體原理如下:在原位合成晶片上通過程序控制添加光敏基團保護的單核苷酸，依次平行合成所設計的寡核苷酸探針。所述的寡核苷酸探針包含與檢測位點互補序列，和延伸臂。延伸臂將連接晶片基部與檢測位點互補序列減少探針的空間位阻。然後對合成晶片進行質檢，包括本底背景掃面以及將帶有螢光信號的核酸物質與指控探針雜交檢測來確定合成晶片質量。檢測位點擴增、標記:根據待檢測的位點在基因組序列上的位置，在所設計探針的兩側合適區域根據引物設計標準設計引物。以檢測樣本DNA位模板，進行標記PCR反應。純化獲得的螢光標記產物與合成晶片雜交、掃描和結果分析。其流程如圖1所示。本發明的基因晶片包括固相載體和合成在該載體上的寡核苷酸探針，所述固相載體為經過表面化學基團修飾的玻璃基質，寡核苷酸探針是針對檢測與葡萄胎相關的NLRP7基因的18個SNP位點所在的核苷酸序列。上述的18 個 SNP 位點包括:c.[198G>C] ; [=]，c.[251G>A] ； c.[271G>A]；c.[316G>A] ；c.[376T>A] ； [=] , c.[614G>A] ； [=] , c.[728C>T] ；c.[924C>A]；[=],c.[1071C>G] ；[=],c.[1137G>C] ；[=],c.[1441G>A] ； [=],c.[1460G>A] ；c.[1538C>T]；[=],c.[1757T>C] ；c.[1879G>C] ； [=], c.[2165A>G] ；c.[2201C>T]和 c.[2809C>T]。它們具有SEQ ID N0.182-199所示的核苷酸序列。根據所述18個SNP位點和側翼序列設計SNP檢測探針，針對每個SNP位點，設計4組探針，每組探針具有正、反兩條核苷酸序列，故本發明針對檢測與葡萄胎相關的NLRP7基因的18個SNP位點所在的核苷酸序列的寡核苷酸探針具有SEQ ID N0.2-145所示的核苷酸序列。
本發明用於檢測樣本中NLRP7基因各相關性SNPs的檢測試劑包括上述基因晶片和18對用於擴增樣本中各SNPs的PCR引物。所述PCR引物具有SEQ ID N0.146-181所示的核苷酸序列。在使用時，抽提待檢測樣品的基因組DNA，以每個待檢測SNP位點設計上下遊引物並進行PCR擴增，在擴增過程中引入螢光標記。螢光標記的核酸靶標分子通過鹼基互補配對原則與晶片上的探針雜交，通過晶片掃描獲得每個位點的螢光信號。上述樣本處理試劑、PCR擴增試劑、雜交試劑均可以使用本領域技術人員所熟知的在這些操作過程中需使用的各種試劑，這些試劑必要時可以包括在試劑盒中，也可以將其配方列明在試劑盒的說明書中由使用者按照說明書中的指示自行配製。本發明的試劑盒中還包括相應的陰性對照樣本和陽性對照樣本。陰性對照樣本為無菌純水，陽性對照樣本為確認的由SEQ ID N0.1-18中某一 DNA片段突變的DNA片段。如:由SEQ ID N0.1突變的DNA片段，具有SEQ ID N0.200-202所示的核苷酸序列。下面結合附圖，通過對本發明較佳實施方式的描述，詳細說明但不限制本發明。實施例1:NLRP7基因各相關SNPs檢測晶片的製備 1.晶片製備過程:
(O將設計的探針序列保存，通過電腦程式優化晶片合成時添加鹼基的順序，在基片上通過化學反應合成含有相應探針序列的晶片。(2)晶片質檢:
I)合成完成後，經清洗的晶片在GenePiX4100B掃描儀上，在PMT=750強度下對晶片進行掃面，檢測晶片合成後的背景螢光信號。

2)將標記的外源核酸與晶片上的指控探針進行雜交，檢測探針合成的質量。5)通過質檢的晶片在4°C下保存。經如上處理的晶片即可用於雜交。實施例2:NLRP7基因各相關SNPs檢測試劑盒樣本檢測
臨床驗證結果表明，本發明的檢測系統通量大、靈敏度高，基因晶片技術的引入使得該方法具有與螢光定量PCR相當的靈敏度。具體試劑、檢測方法如下:
1.試劑盒組成
權利要求
1.一種用於檢測NLRP7基因的基因晶片，其特徵在於，它包括固相載體和合成在該載體上的寡核苷酸探針等，所述寡核苷酸探針是針對檢測與葡萄胎相關的NLRP7基因的18個SNP位點所在的核苷酸序列；所述的18個SNP位點具有SEQ ID N0.182-199所示的核苷酸序列；所述寡核苷酸探針具有SEQ ID N0.2-145所示的核苷酸序列。
2.一種用於檢測樣本中NLRP7基因的檢測試劑，其特徵在於，它包括權利要求1所述的基因晶片和18對用於擴增樣本中各SNPs的PCR引物等，所述PCR引物具有SEQ IDN0.146-181所示的核苷酸序列。
3.一種用於檢測樣本中NLRP7基因的試劑盒，其特徵在於，它包括權利要求2所述的檢測試劑、一陰性對照樣本和一陽性對照樣本等，所述陰性對照樣本為無菌純水，所述陽性對照樣本為確認的由SEQ ID N0.1-18中某一 DNA片段突變的DNA片段。
全文摘要
本發明公開了一種用於檢測與葡萄胎相關的NLRP7基因SNP分型晶片、檢測試劑和試劑盒，構建了篩查與葡萄胎相關的NLRP7基因多態性高危人群的基因晶片檢測系統，基因晶片包括固相載體和合成在該載體上的寡核苷酸探針，檢測試劑包括基因晶片和18對用於擴增樣本中各SNPs的PCR引物，試劑盒包括檢測試劑、一陰性對照樣本和一陽性對照樣本；本發明可快速、準確檢測臨床樣本中的NLRP7基因各個相關SNPs位點。該檢測系統通量大、靈敏度高，對於葡萄胎的臨床診斷和高危人群早期篩查、早期預防幹預具有重要的意義，可廣泛用於臨床高效篩查葡萄胎高危人群。
文檔編號C40B40/06GK103103271SQ20131002771
公開日2013年5月15日 申請日期2013年1月24日 優先權日2013年1月24日
發明者錢建華 申請人:杭州市第一人民醫院